Έκφραση των γονιδίων HOMEOBOX KNOTTED HOMEOBOX στην Καμβιακή Ζώνη των Cactaceae υποδηλώνει τη συμμετοχή τους στην ανάπτυξη του ξύλου

¹ Departamento de Botánica, Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México, Πόλη του Μεξικού, Μεξικό
² Departamento de Biología Molecular de Plantas, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, Cuernavaca, Μεξικό
³ Jardín Botánico, Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México, Πόλη του Μεξικού, Μεξικό

Το αγγειακό κάμβιο είναι ένα πλευρικό μερίστωμα που παράγει δευτερεύον ξυλόμυλο (δηλαδή ξύλο) και φλοιό. Διαφορετικά είδη Cactaceae αναπτύσσουν διαφορετικούς τύπους δευτερογενούς ξυλώματος. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τους μηχανισμούς που κρύβονται πίσω από το σχηματισμό ξύλου στα Cactaceae. Η οικογένεια γονιδίων KNOTTED HOMEOBOX (KNOX) κωδικοποιεί μεταγραφικούς παράγοντες που ρυθμίζουν την ανάπτυξη των φυτών. Ο ρόλος των γονιδίων KNOX κατηγορίας Ι στη ρύθμιση του κορυφαίου μεριστώματος του βλαστού, της αρχιτεκτονικής της ταξιανθίας και της δευτερογενούς ανάπτυξης έχει καθιερωθεί σε μερικά μοντέλα ειδών, ενώ οι λειτουργίες των γονιδίων KNOX κατηγορίας ΙΙ είναι λιγότερο κατανοητές, αν και η Arabidopsis thaliana κατηγορίας II KNOX Η πρωτεΐνη KNAT7 είναι γνωστό ότι ρυθμίζει τη βιοσύνθεση του δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος. Για να διερευνήσει τη συμμετοχή των γονιδίων KNOX στην τεράστια μεταβλητότητα του ξύλου στα Cactaceae, εντοπίσαμε ορθολογικά γονίδια που εκφράζονται σε είδη με ινώδη (Pereskia lychnidiflora και Pilosocereus alensis), μη ινώδη (Ariocarpus retusus) και δίμορφο (Ferocactus pilosus) ξύλο. Και τα δύο γονίδια KNOX κατηγορίας Ι και κατηγορίας ΙΙ εκφράστηκαν στην καμπική ζώνη του κάκτου, συμπεριλαμβανομένων ενός ή δύο παραλόγων κατηγορίας Ι του KNAT1, καθώς και ενός ή δύο παραλόγων κατηγορίας ΙΙ του KNAT3-KNAT4-KNAT5. Ενώ το γονίδιο KNOX SHOOTMERISTEMLESS (STM) και το ορθολογικό του ARK1 εκφράζονται κατά τη δευτερογενή ανάπτυξη στο στέλεχος Arabidopsis και Populus, αντίστοιχα, δεν βρήκαμε ορθόλογα STM στην καμπική ζώνη Cactaceae, γεγονός που υποδηλώνει πιθανές διαφορές στο αγγειακό γενετικό ρυθμιστικό δίκτυο του cambium. αυτά τα είδη. Είναι σημαντικό, ενώ δύο παράλογα KNOX κατηγορίας ΙΙ από τον κλάδο KNAT7 εκφράστηκαν στην καμπική ζώνη του A. retusus και του F. pilosus, δεν εντοπίσαμε έκφραση ορθολογικού KNAT7 στην καμπική ζώνη του P. lychnidiflora. Οι διαφορές στη δραστηριότητα μεταγραφικού καταστολέα της βιοσύνθεσης του δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος από τους ορθολόγους KNAT7 θα μπορούσαν επομένως να εξηγήσουν τις διαφορές στην ανάπτυξη του ξύλου στα είδη κάκτων.

Εισαγωγή

Ως δεξαμενές πολυδύναμων κυττάρων, τα μεριστώματα έχουν παίξει πρωταγωνιστικό ρόλο στη διαφοροποίηση των μορφών ανάπτυξης αγγειόσπερμων. Τα κορυφαία μεριστώματα του βλαστού και της ρίζας διατηρούν την πρωτογενή ανάπτυξη στα φυτά, ενώ τα πλευρικά μεριστώματα, που αποτελούνται από το αγγειακό κάμβιο και το κάμβιο του φελλού στα ευδικοτυλήδονα και τα γυμνόσπερμα, εμπλέκονται στη δευτερογενή ανάπτυξη (Evert, 2006). Το αγγειακό κάμπιο διατηρεί έναν πληθυσμό αρχικών (βλαστικών) κυττάρων, τα οποία διαιρούνται ασύμμετρα για να δημιουργήσουν δύο θυγατρικά κύτταρα. Το ένα διατηρεί την καμπιακή αρχική ταυτότητα, ενώ το άλλο διαιρείται ξανά και οι κόρες διαφοροποιούνται για να δημιουργήσουν δευτερεύον φλόωμα ή ξυλόμυλο (Groover et al., 2010· Miyashima et al., 2013). Τα αγγειακά παράγωγα καμβίου πιστεύεται ότι έχουν επηρεάσει τα γεγονότα ειδογένεσης και διαφοροποίησης (Spicer and Groover, 2010; Lucas et al., 2013). Στα Cactaceae, τα χαρακτηριστικά του δευτερογενούς ξυλώματος (δηλαδή, το ξύλο) υποδηλώνουν ότι έχει εξελιχθεί από ετεροχρόνιες διεργασίες όπου μια αλλαγή στο χρόνο των αναπτυξιακών διεργασιών οδηγεί σε μορφολογικές διαφορές μεταξύ των ειδών (Altesor et al., 1994). Τα μεγαλύτερα είδη (≥1,5 m ύψος) σε αυτή την οικογένεια χυμωδών φυτών έχουν ινώδες ξύλο με στοιχεία αγγείων στο ξυλώμα παρόμοια με αυτά που προέρχονται συνήθως από το αγγειακό κάμβιο, με παρόμοια χημική σύσταση ξύλου με αυτή άλλων ξυλωδών ειδών δικοτυλήδονων (Reyes- Rivera et al., 2015). Από την άλλη πλευρά, το ξύλο που βρίσκεται σε μικρότερα είδη είναι γενικά σπάνιο και μη ινώδες, με άφθονες τραχειίδες ευρείας ζώνης και στοιχεία αγγείων παρόμοια με εκείνα που είναι τυπικά του πρωτο- και του μεταξυλίου. Σε αυτά τα είδη, το επίπεδο λιγνίωσης του ξύλου είναι ασήμαντο και η λιγνίνη έχει ετερογενή χημική σύσταση (Reyes-Rivera et al., 2015). Πολλά είδη Cactaceae έχουν δίμορφο ξύλο, όπου παράγεται ένας τύπος ξύλου στα νεανικά στάδια και μια διαφορετική δομή σχηματίζεται στα ενήλικα στάδια ανάπτυξης. Από όσο γνωρίζουμε, αυτό το φαινόμενο είναι μοναδικό μεταξύ των ευδικοτυλήδων και σχετίζεται με τις σφαιρικές και σφαιροειδείς μορφές ανάπτυξης ορισμένων ειδών Cactaceae (Mauseth and Plemons, 1995). Σε είδη με διμορφικό ξύλο που παράγουν τραχειίδες ευρείας ζώνης, αυτές αναπτύσσονται πάντα πρώτα, πριν παραχθεί το ινώδες ή παρεγχυματικό ξύλο (Mauseth and Plemons, 1995; Loza–Cornejo και Terrazas, 2011). Οι μηχανισμοί που διαμορφώνουν την ανάπτυξη του αγγειακού καμβίου και των παραγώγων του στα Cactaceae είναι ως επί το πλείστον άγνωστοι. παρ ‘όλα αυτά,

Η αλληλεπίδραση διαφορετικών παραγόντων στη ρύθμιση της αγγειακής δραστηριότητας του καμβίου έχει αναφερθεί προηγουμένως (Liu et al., 2014; Nieminen et al., 2015) και οι ρόλοι των ρυθμιστών ανάπτυξης, συμπεριλαμβανομένων της αυξίνης, της κυτοκινίνης και του αιθυλενίου, σε αυτή τη διαδικασία είναι καλά καθιερωμένα. Αργότερα στην ανάπτυξη, τα γονίδια που ρυθμίζουν την κυτταρική επέκταση, τη δευτερογενή διαφοροποίηση του ξυλώματος, τη λιγνίωση και την εναπόθεση δευτερογενούς τοιχώματος συμβάλλουν στον σχηματισμό ξύλου (ανασκόπηση στο Růžička et al., 2015; Ye and Zhong, 2015; Zhong and Ye, 2015). Το προφίλ μεταγραφής του αγγειακού κάμβιου στο λεύκωμα (Populus tremula) αποκάλυψε ομοιότητες μεταξύ των ρυθμιστικών δικτύων γονιδίων που λειτουργούν στο κορυφαίο μερίστωμα του βλαστού και του αγγειακού κάμβιου. Συγκεκριμένα, αναφέρθηκε ότι τέσσερα μέλη της οικογένειας γονιδίων KNOTTED1-LIKE HOMEOBOX (KNOX), και συγκεκριμένα PttKNOX1, PttSHOOT MERISTEMLESS (PttSTM), Το PttKNOX2 και το PttKNOX6 εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό και στους δύο ιστούς (Schrader et al., 2004). Η λειτουργική ανάλυση υποδηλώνει ότι τα ορθόλογα Populus των γονιδίων Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) κατηγορίας Ι KNOX STM και KNOTTED-LIKE HOMEOBOX OF ARABIDOPSIS THALIANA 1 (KNAT1)/BREVIPEDICELLUS (BP), PttSTM/ARBORKNOK1Karttm/ARBORKNOXa αντίστοιχα, ρυθμίζουν τη δευτερογενή ανάπτυξη (Groover et al., 2006; Du et al., 2009; Liu et al., 2015). Ενώ οι ρόλοι των γονιδίων KNOX κατηγορίας Ι στη ρύθμιση του κορυφαίου μεριστώματος βλαστών, της αρχιτεκτονικής ταξιανθίας και της ανάπτυξης σύνθετων φύλλων είναι καλά καθιερωμένοι, οι λειτουργίες των γονιδίων KNOX κατηγορίας ΙΙ είναι λιγότερο κατανοητές. Γενικά, οι μεταγραφές κατηγορίας Ι είναι λιγότερο άφθονες από τις μεταγραφές KNOX κατηγορίας ΙΙ και εκφράζονται σε συγκεκριμένες περιοχές μεριστωμάτων, ιδιαίτερα στο μεριστώμα του κορυφαίου βλαστού και των φύλλων. Αντίθετα, μεταγραφές κατηγορίας ΙΙ βρίσκονται σε διαφοροποιούμενα κύτταρα και σε όλα τα ώριμα φυτικά όργανα (Serikawa et al., 1997, ανασκόπηση από τους Hay and Tsiantis, 2010· Arnaud and Pautot, 2014), αλλά όχι στο κορυφαίο μερίστωμα του βλαστού (Furumizu et al. ., 2015). Επιπλέον, ο σκούρο πράσινος φαινότυπος οδοντωτών φύλλων του μεταλλάγματος κλάσης II knat3 knat4 knat5 τριπλής απώλειας λειτουργίας στο Arabidopsis είναι παρόμοιος με αυτόν των μεταλλαγμάτων κέρδους-λειτουργίας κατηγορίας Ι (Furumizu et al., 2015), υποδηλώνοντας αντίθετη λειτουργίες για γονίδια των δύο τάξεων. Εδώ αναφέρουμε ότι τα γονίδια KNOX κατηγορίας Ι και ΙΙ εκφράζονται στην καμπική ζώνη, που αποτελείται από αγγειακά κάμβια και παράγωγα κύτταρα, από είδη Cactaceae με ινώδη (Pereskia lychnidiflora και Pilosocereus alensis), μη ινώδη (Ariocarpus retusus) και διμορφικά (Ferocactus pilosus) ξύλο.

Υλικά και μέθοδοι

Δειγματοληψία φυτικού υλικού και ιστών

Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα είδη Cactaceae με διαφορετικούς τύπους ξύλου: Pereskia lychnidiflora DC. (υποοικογένεια: Pereskoideae); Pilosocereus alensis (FAC Weber) Byles amp; GD Rowley (υποοικογένεια: Cactoideae, φυλή: Cereeae); Ariocarpus retusus Scheidw (Cactoideae, φυλή: Cacteae); και Ferocactus pilosus (Galeotti ex Salm-Dyck) Werderm. (Cactoideae, Cacteae). Συλλέχθηκαν δείγματα από την καμπική ζώνη ενήλικων ατόμων που αναπτύσσονται στο Μεξικό. Για τα ψηλά είδη (F. pilosus, P. lychnidiflora), η καμπική ζώνη συγκομίστηκε από ένα άτομο και των δύο ειδών στο χωράφι (F. pilosus στο Μεξικανικό Οροπέδιο, πολιτεία San Luis Potosí, τοποθεσία 23°19′31′′ Β. 100°33′30′′Δ, κουπόνι TT890 MEXU και P. lychnidiflora στον Ισθμό του Tehuantepec, πολιτεία Οαχάκα, τοποθεσία 16°22′52′′Β, 95°19′03′′Δ, κουπόνι TT966 MEXU ), με δείγματα που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της περιόδου των βροχών για να διασφαλιστεί ότι το αγγειακό κάμβιο ήταν ενεργό. Όλοι οι περιβάλλοντες ιστοί συμπεριλαμβανομένου του φλοιού αφαιρέθηκαν όπως περιγράφεται από τους Liu et al. (2014). Η καμπική ζώνη αφαιρέθηκε με ένα μαχαίρι μικροτόμου μιας χρήσης και καταψύχθηκε αμέσως σε υγρό άζωτο. Ένα ολόκληρο άτομο τόσο του A. retusus όσο και του P. alensis τοποθετήθηκε σε γλάστρες που περιείχαν το φυσικό τους έδαφος και μεταφέρθηκε από το φυσικό τους περιβάλλον στο εργαστήριο (A. retusus από το Μεξικανικό Οροπέδιο, πολιτεία Nuevo León, τοποθεσία 23°23′39′′ Β. 100°21′57′′Δ, κουπόνι SA1976 MEXU και P. alensis από την ακτή του Ειρηνικού, πολιτεία Michoacán, τοποθεσία 18°46′41′′Β. 103°08′05′′Δ, κουπόνι JRR3 MEXU) . Η ταυτοποίηση του είδους επιβεβαιώθηκε από τον S. Arias [Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México (IB, UNAM)], ο κορυφαίος ειδικός ταξινομίας της οικογένειας των Cactaceae στο Μεξικό. Η καμπική ζώνη συλλέχτηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα δείγματα της καμβιακής ζώνης αποθηκεύτηκαν στους -80°C μέχρι την εκχύλιση RNA. Για ανάλυση έκφρασης με RT-PCR, ένα ενήλικο φυτό A. retusus, F. pilosus και P. lychnidiflora, ένα νεανικό φυτό 2 ετών των δύο πρώτων ειδών και δύο νεαρά άτομα ηλικίας 5 ετών του Α. . retusus, που συλλέχθηκαν προηγουμένως από τις ίδιες τοποθεσίες, δωρήθηκαν από τον Βοτανικό Κήπο IB, UNAM. Για το μεταγραφικό άκρο της ρίζας του Pachycereus pringlei (S. Watson) Britton amp; Rose, τα φυτά βλάστησαν από σπόρους που συλλέχθηκαν κοντά στο Bahia Kino, στην πολιτεία Sonora και δωρήθηκαν από τους F. Molina-Freaner και JF Martínez-Rodríguez (Instituto de Ecología, πανεπιστημιούπολη , UNAM). Τα δείγματα της καμβιακής ζώνης αποθηκεύτηκαν στους -80°C μέχρι την εκχύλιση RNA. Για ανάλυση έκφρασης με RT-PCR, ένα ενήλικο φυτό A. retusus, F. pilosus και P. lychnidiflora, ένα νεανικό φυτό 2 ετών των δύο πρώτων ειδών και δύο νεαρά άτομα ηλικίας 5 ετών του Α. . retusus, που συλλέχθηκαν προηγουμένως από τις ίδιες τοποθεσίες, δωρήθηκαν από τον Βοτανικό Κήπο IB, UNAM. Για το μεταγραφικό άκρο της ρίζας του Pachycereus pringlei (S. Watson) Britton amp; Rose, τα φυτά βλάστησαν από σπόρους που συλλέχθηκαν κοντά στο Bahia Kino, στην πολιτεία Sonora και δωρήθηκαν από τους F. Molina-Freaner και JF Martínez-Rodríguez (Instituto de Ecología, πανεπιστημιούπολη , UNAM). Τα δείγματα της καμβιακής ζώνης αποθηκεύτηκαν στους -80°C μέχρι την εκχύλιση RNA. Για ανάλυση έκφρασης με RT-PCR, ένα ενήλικο φυτό A. retusus, F. pilosus και P. lychnidiflora, ένα νεανικό φυτό 2 ετών των δύο πρώτων ειδών και δύο νεαρά άτομα ηλικίας 5 ετών του Α. . retusus, που συλλέχθηκαν προηγουμένως από τις ίδιες τοποθεσίες, δωρήθηκαν από τον Βοτανικό Κήπο IB, UNAM. Για το μεταγραφικό άκρο της ρίζας του Pachycereus pringlei (S. Watson) Britton amp; Rose, τα φυτά βλάστησαν από σπόρους που συλλέχθηκαν κοντά στο Bahia Kino, στην πολιτεία Sonora και δωρήθηκαν από τους F. Molina-Freaner και JF Martínez-Rodríguez (Instituto de Ecología, πανεπιστημιούπολη , UNAM). και δύο νεαρά άτομα ηλικίας 5 ετών του A. retusus, που είχαν προηγουμένως συγκεντρωθεί από τις ίδιες τοποθεσίες, δόθηκαν από τον Βοτανικό Κήπο ΙΒ, UNAM. Για το μεταγραφικό άκρο της ρίζας του Pachycereus pringlei (S. Watson) Britton amp; Rose, τα φυτά βλάστησαν από σπόρους που συλλέχθηκαν κοντά στο Bahia Kino, στην πολιτεία Sonora και δωρήθηκαν από τους F. Molina-Freaner και JF Martínez-Rodríguez (Instituto de Ecología, πανεπιστημιούπολη , UNAM). και δύο νεαρά άτομα ηλικίας 5 ετών του A. retusus, που είχαν προηγουμένως συγκεντρωθεί από τις ίδιες τοποθεσίες, δόθηκαν από τον Βοτανικό Κήπο ΙΒ, UNAM. Για το μεταγραφικό άκρο της ρίζας του Pachycereus pringlei (S. Watson) Britton amp; Rose, τα φυτά βλάστησαν από σπόρους που συλλέχθηκαν κοντά στο Bahia Kino, στην πολιτεία Sonora και δωρήθηκαν από τους F. Molina-Freaner και JF Martínez-Rodríguez (Instituto de Ecología, πανεπιστημιούπολη , UNAM).

Για τη διαβροχή του ξύλου, λαμβάνονταν λεπτά ροκανίδια (πάχους 2 mm) κάθε 5 mm, από την περιοχή που βρίσκεται πλησιέστερα στο κουκούτσι (νεαρό ξύλο) στο τμήμα που βρίσκεται πλησιέστερα στο αγγειακό κάμπιο (ώριμο ξύλο) και κάθε περιοχή επεξεργαζόταν ξεχωριστά. Τα μη ινώδη δείγματα A. retusus τοποθετήθηκαν σε σωλήνες μικροφυγοκέντρου 2 mL γεμάτες με διάλυμα Franklin (5:1:4 οξικό οξύ:υπεροξείδιο του υδρογόνου: νερό· Ruzin, 1999), ενώ τα δίμορφα δείγματα F. pilosus και το ινώδες P alensis και Ρ. lychnidiflora τοποθετήθηκαν σε σωλήνες που περιείχαν διάλυμα Jeffrey (ίσοι όγκοι 10% χρωμικού οξέος και 10% νιτρικού οξέος· Berlyn and Miksche, 1976). Για κάθε είδος χρησιμοποιήθηκαν 0,2 g του ιστού. Τα δείγματα στη συνέχεια επωάστηκαν στους 56°C για 4 ώρες (μη ινώδες ξύλο) και 24 ώρες (διμορφικό και ινώδες ξύλο). Επιπροσθέτως, Όλα τα δείγματα υποβλήθηκαν σε υπερήχους σε καθαριστικό υπερήχων Branson 200 (Branson Ultrasonics, Danbury, CT, USA) μέχρις ότου διαβραχούν πλήρως, πλύθηκαν με νερό και αφυδατώθηκαν χρησιμοποιώντας μια σειρά πλύσεων με αιθανόλη σε 50, 70, 90% και απόλυτες συγκεντρώσεις. Οι διαβροχές του A. retusus χρωματίστηκαν με ένα υδατικό διάλυμα κυανού της τολουιδίνης 0,1% για 12 ώρες (Ruzin, 1999) και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια. Οι διαβροχές των δειγμάτων ξύλου από άλλα τρία είδη χρωματίστηκαν με Safranin για 2 ώρες και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια χρησιμοποιώντας συνθετική ρητίνη (Entellan, Merck Millipore, Darmstadt, Γερμανία). Όλα τα ξύλινα στοιχεία φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα οπτικό μικροσκόπιο BX51 (Olympus Corporation, Τόκιο, Ιαπωνία) και οι εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image-Pro Plus v. 6.1 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA). πλύθηκε με νερό και αφυδατώθηκε χρησιμοποιώντας μια σειρά πλύσεων με αιθανόλη σε 50, 70, 90% και απόλυτες συγκεντρώσεις. Οι διαβροχές του A. retusus χρωματίστηκαν με ένα υδατικό διάλυμα κυανού της τολουιδίνης 0,1% για 12 ώρες (Ruzin, 1999) και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια. Οι διαβροχές των δειγμάτων ξύλου από άλλα τρία είδη χρωματίστηκαν με Safranin για 2 ώρες και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια χρησιμοποιώντας συνθετική ρητίνη (Entellan, Merck Millipore, Darmstadt, Γερμανία). Όλα τα ξύλινα στοιχεία φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα οπτικό μικροσκόπιο BX51 (Olympus Corporation, Τόκιο, Ιαπωνία) και οι εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image-Pro Plus v. 6.1 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA). πλύθηκε με νερό και αφυδατώθηκε χρησιμοποιώντας μια σειρά πλύσεων με αιθανόλη σε 50, 70, 90% και απόλυτες συγκεντρώσεις. Οι διαβροχές του A. retusus χρωματίστηκαν με ένα υδατικό διάλυμα κυανού της τολουιδίνης 0,1% για 12 ώρες (Ruzin, 1999) και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια. Οι διαβροχές των δειγμάτων ξύλου από άλλα τρία είδη χρωματίστηκαν με Safranin για 2 ώρες και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια χρησιμοποιώντας συνθετική ρητίνη (Entellan, Merck Millipore, Darmstadt, Γερμανία). Όλα τα ξύλινα στοιχεία φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα οπτικό μικροσκόπιο BX51 (Olympus Corporation, Τόκιο, Ιαπωνία) και οι εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image-Pro Plus v. 6.1 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA). 1% υδατικό διάλυμα κυανού τολουιδίνης για 12 ώρες (Ruzin, 1999) και τοποθετήθηκε σε αντικειμενοφόρους πλάκες. Οι διαβροχές των δειγμάτων ξύλου από άλλα τρία είδη χρωματίστηκαν με Safranin για 2 ώρες και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια χρησιμοποιώντας συνθετική ρητίνη (Entellan, Merck Millipore, Darmstadt, Γερμανία). Όλα τα ξύλινα στοιχεία φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα οπτικό μικροσκόπιο BX51 (Olympus Corporation, Τόκιο, Ιαπωνία) και οι εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image-Pro Plus v. 6.1 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA). 1% υδατικό διάλυμα κυανού τολουιδίνης για 12 ώρες (Ruzin, 1999) και τοποθετήθηκε σε αντικειμενοφόρους πλάκες. Οι διαβροχές των δειγμάτων ξύλου από άλλα τρία είδη χρωματίστηκαν με Safranin για 2 ώρες και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια χρησιμοποιώντας συνθετική ρητίνη (Entellan, Merck Millipore, Darmstadt, Γερμανία). Όλα τα ξύλινα στοιχεία φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα οπτικό μικροσκόπιο BX51 (Olympus Corporation, Τόκιο, Ιαπωνία) και οι εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image-Pro Plus v. 6.1 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA).

Εκχύλιση RNA, Σύνθεση cDNA και ενίσχυση PCR

Το ολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIZol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, συμπεριλαμβανομένου του προαιρετικού βήματος της φυγοκέντρησης πριν από τον διαχωρισμό των φάσεων, ή χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης ολικού RNA Spectrum Plant (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ). Το cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας Αντίστροφη Μεταγραφάση SuperScript II (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εκφυλισμένοι εκκινητές PCR χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση των γονιδίων KNOX. Σχεδιάστηκαν εκκινητές για την ενίσχυση υποτιθέμενων ορθολόγων κάκτων του KNAT3 (KNAT3_Cact_F: 5′-GAGAGRAATAATGGCWTATCATC-3′ και KNAT3_Cact-R: 5′-CCTTCTGGTTCTACTTCCCTC-3′) με βάση τις ευθυγραμμίσεις της τάξης των πρωτεϊνών KNAT3_Rabsis (KNAT3_Cact-R): και τα πλησιέστερα ομόλογά του από τα Beta vulgaris και Pachycereus pringlei. Για τα Cactaceae ορθόλογα του KNAT1, εκκινητές που σχεδιάστηκαν από Du et al. (2009) χρησιμοποιήθηκαν. Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν με στήλες Sephadex Centri-sep (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα ενισχυμένα και καθαρισμένα προϊόντα αλληλουχήθηκαν σε έναν 3500xL Genetic Analyzer sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) χρησιμοποιώντας τους εκκινητές PCR. Η πολυμεράση Platinum Taq (Thermo Fischer Scientific, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ) χρησιμοποιήθηκε για αντιδράσεις PCR. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται για RT-PCR παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1. Το RNA-seq πραγματοποιήθηκε στο Ινστιτούτο Γονιδιώματος του Πεκίνου, στο Χονγκ Κονγκ. τα μεταγραφήματα του αγγειακού κάμβιου και του άκρου της ρίζας συναρμολογήθηκαν de novo χρησιμοποιώντας το Trinity v. 2.2 Τα ενισχυμένα και καθαρισμένα προϊόντα αλληλουχήθηκαν σε έναν 3500xL Genetic Analyzer sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) χρησιμοποιώντας τους εκκινητές PCR. Η πολυμεράση Platinum Taq (Thermo Fischer Scientific, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ) χρησιμοποιήθηκε για αντιδράσεις PCR. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται για RT-PCR παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1. Το RNA-seq πραγματοποιήθηκε στο Ινστιτούτο Γονιδιώματος του Πεκίνου, στο Χονγκ Κονγκ. τα μεταγραφήματα του αγγειακού κάμβιου και του άκρου της ρίζας συναρμολογήθηκαν de novo χρησιμοποιώντας το Trinity v. 2.2 Τα ενισχυμένα και καθαρισμένα προϊόντα αλληλουχήθηκαν σε έναν 3500xL Genetic Analyzer sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) χρησιμοποιώντας τους εκκινητές PCR. Η πολυμεράση Platinum Taq (Thermo Fischer Scientific, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ) χρησιμοποιήθηκε για αντιδράσεις PCR. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται για RT-PCR παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1. Το RNA-seq πραγματοποιήθηκε στο Ινστιτούτο Γονιδιώματος του Πεκίνου, στο Χονγκ Κονγκ. τα μεταγραφήματα του αγγειακού κάμβιου και του άκρου της ρίζας συναρμολογήθηκαν de novo χρησιμοποιώντας το Trinity v. 2.2¹ και CLC Genomic Workbench v. 7.5 (Qiagen ² ), αντίστοιχα.

Ευθυγράμμιση Αλληλουχίας και Φυλογενετική Ανάλυση

Αλληλουχίες πρωτεϊνών που μοιάζουν με KNOX ανακτήθηκαν από τη βάση δεδομένων Phytozome ³ (έκδ. 11, τελευταία πρόσβαση στις 9 Μαΐου 2016) χρησιμοποιώντας τα εργαλεία PhytoMine. Όλες οι πρωτεΐνες με KNOX (IPR005540 [InterProscan ορισμός]/PF03790 [ορισμός Pfam] και IPR005541/PF03791), ELK (IPR005539/PF03789) και τομείς HD (IPR009057/PF05) ήταν 9tri. Οι αλληλουχίες B. vulgaris ανακτήθηκαν χρησιμοποιώντας tBLASTn από τη διάταξη γονιδιώματος RefBeet v. 1.2 (The Beta vulgaris πόρος ⁴, Dohm et al., 2013) χρησιμοποιώντας μια μήτρα υποκατάστασης BLOSUM80 (Henikoff and Henikoff, 1992· εκείνη την εποχή, το B. vulgaris ήταν το μόνο είδος από την τάξη Caryophyllales με γονιδίωμα αλληλουχίας). Οι χιμαιρικές αλληλουχίες και εκείνες από τα γονιδιώματα πρώιμης απελευθέρωσης απορρίφθηκαν. Μετά από αυτό, προστέθηκαν αλληλουχίες πρωτεΐνης KNOX από τα είδη δέντρων Betula luminifera και Juglans nigra. Για τα είδη Cactaceae, οι αλληλουχίες πρωτεΐνης KNOX που χρησιμοποιήθηκαν συνήχθησαν από τα ενισχυμένα και αλληλουχημένα θραύσματα PCR (βλ. προηγούμενη ενότητα), από τα δεδομένα RNA-seq και την de novo συγκρότηση του μεταγραφήματος της καμπιακής ζώνης των τεσσάρων ειδών που αναφέρονται σε αυτήν την εργασία (το τα ίδια δείγματα RNA χρησιμοποιήθηκαν ως υλικό έναρξης για τη συγκρότηση μεταγραφομετρικής ζώνης της καμπίας), από το μεταγραφικό άκρο της ρίζας του είδους της υποοικογένειας Cactoideae Pachycereus pringlei (η ανάλυση των μεταγραφωμάτων θα αναφερθεί αλλού) και από το πρόσφατα δημοσιευμένο μεταγραφικό Lophophora williamsii (Ibarra-Laclette et al., 2015). Οι προκύπτουσες αλληλουχίες ευθυγραμμίστηκαν με το Clustal Omega⁵ και το αρχείο ευθυγράμμισης επεξεργάστηκε μη αυτόματα. Οι θέσεις ευθυγράμμισης με κενά άνω του 30% δεν συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση. Οι τιμές ταυτότητας και ομοιότητας (%) ελήφθησαν από μια κατά ζεύγη στοίχιση (Needle-EMBOSS ⁶ ), με πλήρη διαγραφή κενού για κάθε ζεύγος.

Η φυλογένεση ανακατασκευάστηκε με MEGA7 (Kumar et al., 2016). Ένας αλγόριθμος μέγιστης πιθανότητας που βασίζεται στο μοντέλο υποκατάστασης JTT (Felsenstein, 1981) χρησιμοποιήθηκε για την επίλυση της φυλογενετικής σχέσης των πρωτεϊνών KNOX που προέρχονται από τα είδη Cactaceae και τα φυτικά είδη με γονιδιώματα αλληλουχίας. Η προκύπτουσα τοπολογία δοκιμάστηκε στατιστικά με ένα bootstrap 1000 επαναλήψεων τόσο για το πλήρες όσο και για τα επιλεγμένα σύνολα δεδομένων. Τα αρχεία NWK οπτικοποιήθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία στο FigTree ⁷(εδ. 1.4.2). Η πρωτεΐνη BELL 1 του Arabidopsis (AT5G41410.1) χρησιμοποιήθηκε ως εξωτερική ομάδα. Οι αλληλουχίες νουκλεοτιδίων που αναφέρονται σε αυτή την εργασία κατατέθηκαν στην GenBank με τους αριθμούς εισαγωγής KX891335-KX891338 για το F. pilosus. KX891339-KX891343 και KX891349 για A. retusus. KX891344-KX891346 για P. lychnidiflora; KX891347 και KX891348 για P. alensis. και KX870027-KX870031 για P. pringlei.

Αποτελέσματα

Μορφολογική Ανάλυση Κυττάρων Ξυλώματος

Για να εξετάσουμε τα λεπτομερή κυτταρικά χαρακτηριστικά του δευτερογενούς ξυλώματος στα τέσσερα είδη που μελετήθηκαν, πραγματοποιήσαμε μια μορφολογική ανάλυση των κυττάρων ξυλώματος χρησιμοποιώντας διαβροχές ξύλου. Το νεαρό ξυλόειδο του A. retusus με μη ινώδες ξύλο και του F. pilosus με δίμορφο ξύλο σχηματίζει τραχειές ευρείας ζώνης και στοιχεία αγγείων με δακτυλιοειδή και ελικοειδή σχέδια δευτερεύοντος τοιχώματος που σχηματίστηκαν κατά την πρώιμη ανάπτυξη. Οι ώριμες ίνες και τα στοιχεία των αγγείων με ψευδοκαλλιόμορφη και εναλλακτική κοιλότητα σχηματίστηκαν σε ενήλικα φυτά κατά την όψιμη ανάπτυξη. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ νεαρού και ώριμου ξύλου P. alensis και P. lychnidiflora, με αμφότερα να έχουν ινώδες ξύλο. Τα στοιχεία της τραχείας του A. retusus και του νεαρού F. pilosus είχαν χαμηλή αναλογία λιγνωμένου κυτταρικού τοιχώματος, παρόμοια με αυτά του πρωτο- και του μεταξυλίου (δηλαδή του πρωτογενούς ξυλώματος), ενώ τα αγγειακά στοιχεία και οι ίνες των ώριμων F. pilosus, P. alensis και P. lychnidiflora είχαν υψηλότερη αναλογία λιγνοποιημένων κυτταρικών τοιχωμάτων. Αυτή η ανάλυση επέτρεψε την αδιαμφισβήτητη ταυτοποίηση κάθε δευτερεύοντος τύπου κυττάρου ξυλώματος και των χαρακτηριστικών του κυτταρικού τοιχώματος (Εικόνα 1) και έτσι επιβεβαίωσε τους τύπους ξύλου που προσδιορίσαμε προηγουμένως χρησιμοποιώντας μια ανατομική ανάλυση τομών ξύλου (Reyes-Rivera et al., 2015). Η μεταβλητότητα στο μέγεθος και το κοίλωμα των στοιχείων του αγγείου που σχετίζεται με την παρουσία ινών βρέθηκε σε είδη με δίμορφο και ινώδες ξύλο. Αυτή η ανάλυση επέτρεψε την αδιαμφισβήτητη ταυτοποίηση κάθε δευτερεύοντος τύπου κυττάρου ξυλώματος και των χαρακτηριστικών του κυτταρικού τοιχώματος (Εικόνα 1) και έτσι επιβεβαίωσε τους τύπους ξύλου που προσδιορίσαμε προηγουμένως χρησιμοποιώντας μια ανατομική ανάλυση τομών ξύλου (Reyes-Rivera et al., 2015). Η μεταβλητότητα στο μέγεθος και το κοίλωμα των στοιχείων του αγγείου που σχετίζεται με την παρουσία ινών βρέθηκε σε είδη με δίμορφο και ινώδες ξύλο. Αυτή η ανάλυση επέτρεψε την αδιαμφισβήτητη ταυτοποίηση κάθε δευτερεύοντος τύπου κυττάρου ξυλώματος και των χαρακτηριστικών του κυτταρικού τοιχώματος (Εικόνα 1) και έτσι επιβεβαίωσε τους τύπους ξύλου που προσδιορίσαμε προηγουμένως χρησιμοποιώντας μια ανατομική ανάλυση τομών ξύλου (Reyes-Rivera et al., 2015). Η μεταβλητότητα στο μέγεθος και το κοίλωμα των στοιχείων του αγγείου που σχετίζεται με την παρουσία ινών βρέθηκε σε είδη με δίμορφο και ινώδες ξύλο.

ΕΙΚΟΝΑ 1. Μορφολογία των δευτερογενών κυττάρων ξυλώματος σε τέσσερα είδη Cactaceae. (Α) Μη ινώδες ξύλο Ariocarpus retusus, από δείγμα ύψους 15 cm. (Β) Δίμορφο ξύλο Ferocactus pilosus, από δείγμα ύψους 90 cm. (Γ) Ινώδες ξύλο Pilosocereus alensis, από δείγμα ύψους 1,5 m. (Δ) Ινώδες ξύλο Pereskia lychnidiflora, από δείγμα ύψους 4 μέτρων. Μόνο το ώριμο ξύλο απεικονίζεται στο (A,C,D) , καθώς δεν παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ νεαρού και ώριμου ξύλου αυτών των ειδών. Μπάρα κλίμακας: 100 μm.

Τα γονίδια της οικογένειας KNOX εκφράζονται στην καμπιακή ζώνη των κάκτων

Για να διερευνήσουμε τη συμμετοχή της οικογένειας KNOX στην τεράστια μεταβλητότητα των μορφολογιών του ξύλου στα Cactaceae, αναζητήσαμε ορθολογίες αυτών των γονιδίων που εκφράζονται στην καμπική ζώνη Cactaceae, η οποία περιλαμβάνει το αγγειακό κάμπιο και τα πρόσφατα προερχόμενα κύτταρα. Η RT-PCR χρησιμοποιώντας εκφυλισμένους εκκινητές για τα γονίδια KNOX κατηγορίας Ι οδήγησε σε ένα κύριο προϊόν ενίσχυσης του προβλεπόμενου μοριακού βάρους στα τέσσερα είδη Cactaceae που μελετήθηκαν. Οι αλληλουχίες αμινοξέων που συνήχθησαν από τα ενισχυμένα και αλληλουχημένα θραύσματα αυτών των γονιδίων (ArKNOX1a από Ariocarpus retusus, FpKNOX1a από Ferocactus pilosus, PaKNOX1a από Pilosocereus alensis και PlKNOX1a από Pereskia lychnidi αντιστοιχούν σε πρωτεΐνη σχεδόν 100pulus της NAQ2020) και Arabidopsis, αντίστοιχα, συμπεριλαμβανομένου μέρους του τομέα KNOX1 και του συνόλου των KNOX2, ELK,

ΣΧΗΜΑ 2. Ευθυγράμμιση των συναγόμενων αλληλουχιών αμινοξέων των πρωτεϊνών KNOX κατηγορίας Ι των Cactaceae. Τα αμινοξέα επισημαίνονται με φόντο κλίμακας του γκρι σύμφωνα με τις τιμές ταυτότητας και ομοιότητάς τους μόνο εάν η κάλυψη στη θέση ευθυγράμμισης είναι μεγαλύτερη από 55%. Καθώς μέρος της περιοχής KNOX1 δεν καλύπτεται από τις ατελείς πρωτεϊνικές αλληλουχίες, τα αμινοξέα στις άλλες πρωτεΐνες δεν επισημαίνονται, παρά το υψηλό ποσοστό ταυτότητας/ομοιότητας. Οι τομείς ορίστηκαν με το InterProscan. Η αλληλουχία Arabidopsis KNAT1 συμπεριλήφθηκε ως αναφορά.

Θραύσματα γονιδίων KNOX κατηγορίας II ενισχύθηκαν επιτυχώς με RT-PCR με εκφυλισμένους εκκινητές από τα τρία είδη από την υποοικογένεια Cactoideae, αλλά δεν απομονώθηκαν από το P. lychnidiflora. Οι αλληλουχίες αμινοξέων που συνάγονται από τα ενισχυμένα και αλληλουχημένα θραύσματα αυτών των τριών γονιδίων, ArKNOX3a, FpKNOX3a και PaKNOX3a, καλύπτουν σχεδόν το 95% της αλληλουχίας πρωτεΐνης KNAT3, συμπεριλαμβανομένων των περιοχών KNOX1, KNOX2 και ELK, καθώς και των περισσότερων από τις περιοχές HD τομέα (Εικόνα 3).

ΣΧΗΜΑ 3. Ευθυγράμμιση των συναγόμενων αλληλουχιών αμινοξέων των πρωτεϊνών KNOX κατηγορίας II των Cactaceae και ορισμένων πρωτεϊνών KNOX κατηγορίας II του Arabidopsis . Οι βαθμολογίες αμινοξέων επισημαίνονται με φόντο σε κλίμακα του γκρι ανάλογα με την ταυτότητα και την ομοιότητά τους μόνο εάν η κάλυψη στη θέση ευθυγράμμισης είναι μεγαλύτερη από 55%. Καθώς μέρος της περιοχής KNOX1 δεν καλύπτεται από τις ατελείς πρωτεϊνικές αλληλουχίες, τα αμινοξέα στις άλλες πρωτεΐνες δεν επισημαίνονται, παρά το υψηλό ποσοστό ταυτότητας/ομοιότητας. Οι τομείς ορίστηκαν με το InterProscan.

Εκτός από τις επτά μεταγραφές που αναφέρθηκαν παραπάνω, οκτώ ακόμη μεταγραφές KNOX συγκεντρώθηκαν de novo από τα δεδομένα RNA-seq μας των δειγμάτων καμπιακής ζώνης τριών ειδών Cactaceae, των A. retusus, F. pilosus και P. lychnidiflora. Οι αλληλουχίες αμινοξέων που προέκυψαν από τις ενισχυμένες μεταγραφές του F. pilosus επεκτάθηκαν αργότερα με ευθυγράμμιση με τις συναρμολογημένες μεταγραφές και επομένως μετονομάστηκαν σε FpKNOX1ae και FpKNOX3ae (Εικόνες 2-5). Η έκφραση όλων των μεταγραφών KNOX στην καμπική ζώνη των A. retusus, F. pilosus και P. lychnidiflora επιβεβαιώθηκε με RT-PCR (Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Αξιοσημείωτο είναι ότι στην καμπική ζώνη νεανικών φυτών 2 ετών τόσο του A. retusus όσο και του F. pilosus, εκφράστηκε ένας από τους δύο ορθολόγους του KNOX3, δηλαδή ArKNOX3a και FpKNOX3ae και του KNOX7, δηλαδή, ArKNOX7r1 και FpKNOX7r2. . Δεν ανιχνεύθηκε έκφραση των ορθολόγων KNOX1 σε νεαρά φυτά. Σε αυτό το στάδιο, μόνο πολύ σπάνια συσσώρευση ξύλου, που αντιπροσωπεύεται από τραχειίδες ευρείας ζώνης και στοιχεία αγγείων, εντοπίστηκε σε αυτά τα είδη. Από τα έξι γονίδια KNOX που εκφράζονται στο αγγειακό κάμπιο του ενήλικου φυτού A. retusus, η έκφραση μόνο του ArKNOX7r1 ανιχνεύθηκε στο φυμάτιο ενός φυτού ηλικίας 5 ετών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Φυλογενετική Ανάλυση της Οικογένειας KNOX

Αρχικά, 524 πρωτεϊνικές αλληλουχίες τύπου KNOX ανακτήθηκαν από τη βάση δεδομένων Phytozome. Οι χιμαιρικές αλληλουχίες και εκείνες από εκλύσεις προσχέδιο γονιδιώματος φιλτραρίστηκαν και συμπεριλήφθηκαν οι συναγόμενες πρωτεϊνικές αλληλουχίες των Cactaceae, των δέντρων B. luminifera και J. nigra, καθώς και εκείνες που ανακτήθηκαν από το γονιδίωμα B. vulgaris. Η προκύπτουσα μήτρα περιείχε 478 ευθυγραμμισμένες πρωτεϊνικές αλληλουχίες που ανήκουν σε 45 είδη με γονιδιώματα αλληλουχίας, έξι είδη Cactaceae και δύο είδη δέντρων. Τα αναγνωριστικά των αλληλουχιών που ανακτήθηκαν από τη βάση δεδομένων Phytozome παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S2. Η φυλογένεση μέγιστης πιθανότητας ομαδοποίησε τις πρωτεΐνες KNOX σε πέντε κύριες κλάσεις (Εικόνες 4, 5), οι οποίες ονομάστηκαν σύμφωνα με την υποτιθέμενη ορθολογία τους Arabidopsis: π.χ. το κλάδο KNAT1 (γκρι), το κλάδο KNAT2-KNAT6 (κυανό), το κλάδο STM (ροζ). ), KNAT3-KNAT4-KNAT5 clade (μπλε), και KNAT7 clade (πράσινο). Οι τρεις πρώτοι clades ανήκουν στην κατηγορία I KNOX και οι δύο τελευταίοι ανήκουν στην κατηγορία II πρωτεΐνες KNOX. Το Σχήμα 5 απεικονίζει τις φυλογενετικές σχέσεις της υποομάδας πρωτεϊνών KNOX από το Arabidopsis, τα Cactaceae και το B. vulgaris. Ως είδος αναφοράς χρησιμοποιήθηκε το Arabidopsis, με το B. vulgaris από την τάξη Caryophyllales, στην οποία ανήκει η οικογένεια Cactaceae, να περιλαμβάνεται ως το πλησιέστερο αδελφό ταξινομικό με γονιδίωμα αλληλουχίας.

ΣΧΗΜΑ 4. Φυλογενετικό δέντρο μέγιστης πιθανότητας πρωτεϊνών KNOX.Φυλογένεση του πλήρους συνόλου δεδομένων, που ενσωματώνει τις συναγόμενες πρωτεΐνες των πέντε ειδών Cactaceae που αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη. τις συναγόμενες πρωτεΐνες από τα 44 γονιδιώματα φυτών που ανακτήθηκαν από τη βάση δεδομένων Phytozome και το γονιδίωμα Beta vulgaris. ακολουθίες από Betula luminifera και Juglans nigra δέντρα. και πρωτεΐνες που συνάγονται από το μεταγραφικό Lophophora williamsii (Ibarra-Laclette et al., 2015). Τα αναγνωριστικά γονιδίων για κάθε αλληλουχία παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S2. Οι κλάδοι για τις αλληλουχίες Cactaceae και Beta vulgaris αντιπροσωπεύονται με πράσινο και υποδεικνύονται με πράσινες κορδέλες. Οι αλληλουχίες από μονοκοτυλήδονα (Poaceae και Musaceae) υποδεικνύονται με καφέ κορδέλες. Η πρωτεΐνη BEL1 από το Arabidopsis thaliana χρησιμοποιήθηκε για να ριζώσει το δέντρο και υποδεικνύεται με κόκκινο χρώμα. Η πρωτεΐνη KNOX από το μονοκύτταρο πράσινο φύκι Ostreococcus lucimarinus στη βάση του δέντρου υποδεικνύεται επίσης με κόκκινο χρώμα. Τα πέντε κύρια clades ονομάζονται σύμφωνα με την υποτιθέμενη ορθολογία Arabidopsis, που υποδεικνύεται από μια μαύρη αιχμή βέλους. Οι πρωτεΐνες KNOX κατηγορίας Ι ανήκουν στα κλάδια KNAT1 (γκρι), KNAT2-KNAT6 (κυανό) και STM (ροζ). Οι πρωτεΐνες KNOX κατηγορίας ΙΙ ανήκουν στις κλάδες KNAT3-KNAT4-KNAT5 (μπλε) και KNAT7 (πράσινες). Τα γονίδια KNOX κατηγορίας I Populus και το γονίδιο Juglans κατηγορίας II που αναφέρονται στη συζήτηση είναι τα μόνα γονίδια KNOX που αναφέρθηκαν ότι εμπλέκονται στο σχηματισμό ξύλου σε αυτά τα είδη δέντρων και υποδεικνύονται με ανοιχτές αιχμές βελών. Η γραμμή κλίμακας απεικονίζει τον αριθμό των αντικαταστάσεων ανά ακολουθία. Οι πρωτεΐνες KNOX κατηγορίας Ι ανήκουν στα κλάδια KNAT1 (γκρι), KNAT2-KNAT6 (κυανό) και STM (ροζ). Οι πρωτεΐνες KNOX κατηγορίας ΙΙ ανήκουν στις κλάδες KNAT3-KNAT4-KNAT5 (μπλε) και KNAT7 (πράσινες). Τα γονίδια KNOX κατηγορίας I Populus και το γονίδιο Juglans κατηγορίας II που αναφέρονται στη συζήτηση είναι τα μόνα γονίδια KNOX που αναφέρθηκαν ότι εμπλέκονται στο σχηματισμό ξύλου σε αυτά τα είδη δέντρων και υποδεικνύονται με ανοιχτές αιχμές βελών. Η γραμμή κλίμακας απεικονίζει τον αριθμό των αντικαταστάσεων ανά ακολουθία. Οι πρωτεΐνες KNOX κατηγορίας Ι ανήκουν στα κλάδια KNAT1 (γκρι), KNAT2-KNAT6 (κυανό) και STM (ροζ). Οι πρωτεΐνες KNOX κατηγορίας ΙΙ ανήκουν στις κλάδες KNAT3-KNAT4-KNAT5 (μπλε) και KNAT7 (πράσινες). Τα γονίδια KNOX κατηγορίας I Populus και το γονίδιο Juglans κατηγορίας II που αναφέρονται στη συζήτηση είναι τα μόνα γονίδια KNOX που αναφέρθηκαν ότι εμπλέκονται στο σχηματισμό ξύλου σε αυτά τα είδη δέντρων και υποδεικνύονται με ανοιχτές αιχμές βελών. Η γραμμή κλίμακας απεικονίζει τον αριθμό των αντικαταστάσεων ανά ακολουθία.

ΣΧΗΜΑ 5. Φυλογενετικό δέντρο του επιλεγμένου συνόλου των πρωτεϊνών KNOX από τα Arabidopsis , τα Cactaceae και Beta vulgaris .Οι πρωτεΐνες KNOX κατηγορίας Ι ανήκουν στα κλάδια KNAT1 (γκρι), KNAT2-KNAT6 (κυανό) και STM (ροζ). Οι πρωτεΐνες KNOX κατηγορίας ΙΙ ανήκουν στις κλάδες KNAT3-KNAT4-KNAT5 (μπλε) και KNAT7 (πράσινες). Οι θέσεις τομέα για τις ακολουθίες Cactaceae εμφανίζονται στα δεξιά δίπλα στον ορθολόγο KNAT. Η περιοχή ELK στις πρωτεΐνες KNAT7 αναγνωρίζεται από την InterProscan αλλά όχι από τα εργαλεία PFAM. Ως εκ τούτου, η βάση δεδομένων InterProscan χρησιμοποιήθηκε για τον ορισμό του τομέα. Για τα FpKNOX1ae και FpKNOX3ae, το τμήμα της αρχικής ενισχυμένης ακολουθίας φαίνεται κάτω από τη συναρμολογημένη ακολουθία. Σημειώστε ότι δεν ήταν δυνατό να ληφθεί η πλήρης αλληλουχία τομέα KNOX1 για τις αλληλουχίες Cactaceae που τελειώνουν σε “a”. Επομένως, η φυλογενετική τους θέση μπορεί να αλλάξει ελαφρώς όταν είναι διαθέσιμη η πλήρης αλληλουχία πρωτεΐνης. Οι τιμές bootstrap από 1000 δέντρα εμφανίζονται στους κόμβους.

Η μοριακή φυλογενετική ανάλυση επιβεβαίωσε ότι τα τέσσερα γονίδια KNOX κατηγορίας 1 Cactaceae που ενισχύθηκαν από την καμπική ζώνη με RT-PCR με εκφυλισμένους εκκινητές (ArKNOX1a, FpKNOX1ae, PaKNOX1a και PlKNOX1a) αποτελούν μέρος της κλάσης KNAT1 (Εικόνα 5). Επιπλέον, δύο από τις de novo συναρμολογημένες μεταγραφές, το ArKNOX1r και το PlKNOX1r, ανήκαν επίσης στο κλάδε KNAT1. Τα γονίδια ArKNOX3a, FpKNOX3ae και PaKNOX3a τάξης II που εκφράζονται στην αγγειακή ζώνη των τριών ειδών εμπίπτουν στον κλάδο KNAT3-KNAT4-KNAT5, μαζί με δύο άλλα γονίδια KNOX κατηγορίας II, τα ArKNOX3r και PlKNOX3r (το μόνο Pereskia που ταυτοποιείται στην κατηγορία II αυτή η μελέτη). Τέσσερις de novo συναρμολογημένες μεταγραφές, ArKNOX7r1, ArKNOX7r2, FpKNOX7r1 και FpKNOX7r2, ανήκουν στην κλάση KNAT7 (Εικόνες 4, 5 και Πίνακας 1).

ΠΙΝΑΚΑΣ 1. Αριθμός γονιδίων KNOX από αυτή τη μελέτη που εκφράζεται στην καμπική ζώνη, στην άκρη της ρίζας και στο βλαστό/ρίζα των ειδών Cactaceae.

Από τις πέντε μεταγραφές KNOX που ανιχνεύθηκαν στο άκρο της ρίζας P. pringlei, και τα δύο γονίδια KNOX κατηγορίας Ι βρέθηκαν στον κλάδο KNAT2-KNAT6, μία αλληλουχία τάξης ΙΙ αποδόθηκε στον κλάδο KNAT3-KNAT4-KNAT5 και άλλα δύο ανήκαν σε το clade KNAT7. Μεταξύ των πέντε γονιδίων KNOX που ταυτοποιήθηκαν στο πρόσφατα δημοσιευμένο μεταγραφικό L. williamsii (Ibarra-Laclette et al., 2015), ένα βρέθηκε σε καθένα από τα πέντε clades (Εικόνες 4, 5 και Πίνακας 1). Στην παγκόσμια φυλογένεση KNOX (Εικόνα 4), οι αλληλουχίες B. vulgaris αναλύονταν πάντα ως αδελφές με τις αλληλουχίες Cactaceae. Στη φυλογένεση για το υποσύνολο των πρωτεϊνών KNOX (Εικόνα 5), οι πρωτεΐνες KNOX κατηγορίας Ι B. vulgaris αναλύθηκαν ως αδελφές με τις αλληλουχίες Cactaceae και στις τρεις κλάσεις, ενώ αυτό δεν ίσχυε για δύο κλάδες KNOX κατηγορίας II. Το μόνο B. vulgaris παράλογο του KNAT3, KNAT4, και το KNAT5 έπεσαν στην υποκατηγορία των ακολουθιών A. thaliana. Εντός της κλάσης KNAT7, η ακολουθία B. vulgaris αντιπροσώπευε την αδελφή αλληλουχία για την υποκατηγορία Cactaceae KNOX7r2, ενώ οι αλληλουχίες KNOX7r1 ομαδοποιήθηκαν ως ξεχωριστή υποκατηγορία. Οι πιθανοί λόγοι αυτής της μικρής ασυνέπειας θα μπορούσαν να είναι οι ατελείς αλληλουχίες πολλών πρωτεϊνών Cactaceae, καθώς και ο πολύ περιορισμένος αριθμός αλληλουχιών σε αυτή τη φυλογένεση (Εικόνα 5).

Συζήτηση

Αν και, είναι καλά τεκμηριωμένο ότι ορισμένοι μεταγραφικοί παράγοντες KNOX είναι σημαντικοί για τη διατήρηση του κορυφαίου μεριστώματος του βλαστού, ο ρόλος τους στη δραστηριότητα του αγγειακού καμβίου και στη δευτερογενή ανάπτυξη είναι λιγότερο καλά κατανοητός. Τέσσερα γονίδια KNOX κατηγορίας Ι αναφέρθηκαν ότι εκφράζονται στο αγγειακό κάμπιο του P. tremula (Schrader et al., 2004; Du et al., 2009), ενώ η έκφραση ενός γονιδίου KNOX κατηγορίας II ανιχνεύθηκε στο αγγειακό κάμπιο του J. nigra (Huang et al., 2009). Ως εκ τούτου, είχε ιδιαίτερο ενδιαφέρον να προσδιοριστεί εάν τα γονίδια και των δύο τάξεων εκφράζονται στις αγγειακές ζώνες των κάκτων και εάν διαφορετικά παράλογα εκφράζονται σε είδη που παράγουν διαφορετικούς τύπους ξύλου. Εκτελώντας RT-PCR με εκφυλισμένους εκκινητές στα τέσσερα είδη Cactaceae (A. retusus, F. pilosus, P. lychnidiflora και P. alensis) και RNA-seq με επακόλουθη de novo συγκρότηση μεταγραφώματος για τρία από αυτά τα είδη, βρήκαμε, και συνεπώς επιβεβαιώσαμε με RT-PCR (Συμπληρωματικό Σχήμα S1), ότι τα μεταγραφήματα των γονιδίων KNOX κατηγορίας Ι και κατηγορίας ΙΙ υπάρχουν σε η καμπική ζώνη των ενήλικων ατόμων και στα τέσσερα είδη (Πίνακας 1). Υπάρχει η πιθανότητα άλλα γονίδια KNOX να εκφράζονται σε πολύ χαμηλά επίπεδα στην αγγειακή ζώνη των Cactaceae, εμποδίζοντας την επιτυχή de novo συναρμολόγηση. Η αλληλουχία του γονιδιώματος των ειδών από την οικογένεια Cactaceae θα διευκολύνει μια πιο λεπτομερή ανάλυση των προτύπων έκφρασης KNOX. Για τον σχολιασμό των αλληλουχιών KNOX των Cactaceae, κατασκευάστηκε ένα φυλογενετικό δέντρο που περιελάμβανε αλληλουχίες KNOX από γονιδιώματα αγγειόσπερμων με αλληλουχία από τη βάση δεδομένων Phytozome και από το γονιδίωμα B. vulgaris ως είδος από την τάξη των Caryophyllales, στην οποία ανήκει η οικογένεια των Cactaceae. Η έκφραση όλων των γονιδίων KNOX στην καμπική ζώνη των ενήλικων φυτών A. retusus, F. pilosus και P. lychnidiflora επιβεβαιώθηκε με RT-PCR (Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Εν τω μεταξύ, στο φυμάτιο του 5χρονου φυτού A. retusus, εντοπίσαμε έκφραση μόνο ενός από τα έξι γονίδια ArKNOX που αναφέρονται σε αυτήν την εργασία, του ArKNOX7r1. Έκφραση δύο γονιδίων KNOX, των ορθολογικών ArKNOX7r1/FpKNOX7r1 και ArKNOX3a/FpKNOX3ae, ανιχνεύθηκε στο αγγειακό κάμπιο των νεαρών φυτών A. retusus και F. pilosus, όταν μόλις άρχιζαν να συσσωρεύουν ξύλο. Αυτό το εύρημα υποδηλώνει περαιτέρω ότι τα γονίδια KNOX, που αναφέρονται σε αυτή την εργασία, εμπλέκονται στο σχηματισμό ώριμου ξύλου και ότι το παράλογο KNOX7r1 έχει ευρύτερες λειτουργίες στην ανάπτυξη των Cactaceae. Η έκφραση όλων των γονιδίων KNOX στην καμπική ζώνη των ενήλικων φυτών A. retusus, F. pilosus και P. lychnidiflora επιβεβαιώθηκε με RT-PCR (Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Εν τω μεταξύ, στο φυμάτιο του 5χρονου φυτού A. retusus, εντοπίσαμε έκφραση μόνο ενός από τα έξι γονίδια ArKNOX που αναφέρονται σε αυτήν την εργασία, του ArKNOX7r1. Έκφραση δύο γονιδίων KNOX, των ορθολογικών ArKNOX7r1/FpKNOX7r1 και ArKNOX3a/FpKNOX3ae, ανιχνεύθηκε στο αγγειακό κάμπιο των νεαρών φυτών A. retusus και F. pilosus, όταν μόλις άρχιζαν να συσσωρεύουν ξύλο. Αυτό το εύρημα υποδηλώνει περαιτέρω ότι τα γονίδια KNOX, που αναφέρονται σε αυτή την εργασία, εμπλέκονται στο σχηματισμό ώριμου ξύλου και ότι το παράλογο KNOX7r1 έχει ευρύτερες λειτουργίες στην ανάπτυξη των Cactaceae. Η έκφραση όλων των γονιδίων KNOX στην καμπική ζώνη των ενήλικων φυτών A. retusus, F. pilosus και P. lychnidiflora επιβεβαιώθηκε με RT-PCR (Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Εν τω μεταξύ, στο φυμάτιο του 5χρονου φυτού A. retusus, εντοπίσαμε έκφραση μόνο ενός από τα έξι γονίδια ArKNOX που αναφέρονται σε αυτήν την εργασία, του ArKNOX7r1. Έκφραση δύο γονιδίων KNOX, των ορθολογικών ArKNOX7r1/FpKNOX7r1 και ArKNOX3a/FpKNOX3ae, ανιχνεύθηκε στο αγγειακό κάμπιο των νεαρών φυτών A. retusus και F. pilosus, όταν μόλις άρχιζαν να συσσωρεύουν ξύλο. Αυτό το εύρημα υποδηλώνει περαιτέρω ότι τα γονίδια KNOX, που αναφέρονται σε αυτή την εργασία, εμπλέκονται στο σχηματισμό ώριμου ξύλου και ότι το παράλογο KNOX7r1 έχει ευρύτερες λειτουργίες στην ανάπτυξη των Cactaceae. στο φυτό του 5χρονου φυτού A. retusus, εντοπίσαμε έκφραση μόνο ενός από τα έξι γονίδια ArKNOX που αναφέρονται σε αυτή την εργασία, του ArKNOX7r1. Έκφραση δύο γονιδίων KNOX, των ορθολογικών ArKNOX7r1/FpKNOX7r1 και ArKNOX3a/FpKNOX3ae, ανιχνεύθηκε στο αγγειακό κάμπιο των νεαρών φυτών A. retusus και F. pilosus, όταν μόλις άρχιζαν να συσσωρεύουν ξύλο. Αυτό το εύρημα υποδηλώνει περαιτέρω ότι τα γονίδια KNOX, που αναφέρονται σε αυτή την εργασία, εμπλέκονται στο σχηματισμό ώριμου ξύλου και ότι το παράλογο KNOX7r1 έχει ευρύτερες λειτουργίες στην ανάπτυξη των Cactaceae. στο φυτό του 5χρονου φυτού A. retusus, εντοπίσαμε έκφραση μόνο ενός από τα έξι γονίδια ArKNOX που αναφέρονται σε αυτή την εργασία, του ArKNOX7r1. Έκφραση δύο γονιδίων KNOX, των ορθολογικών ArKNOX7r1/FpKNOX7r1 και ArKNOX3a/FpKNOX3ae, ανιχνεύθηκε στο αγγειακό κάμπιο των νεαρών φυτών A. retusus και F. pilosus, όταν μόλις άρχιζαν να συσσωρεύουν ξύλο. Αυτό το εύρημα υποδηλώνει περαιτέρω ότι τα γονίδια KNOX, που αναφέρονται σε αυτή την εργασία, εμπλέκονται στο σχηματισμό ώριμου ξύλου και ότι το παράλογο KNOX7r1 έχει ευρύτερες λειτουργίες στην ανάπτυξη των Cactaceae. όταν μόλις άρχιζαν να συσσωρεύουν ξύλα. Αυτό το εύρημα υποδηλώνει περαιτέρω ότι τα γονίδια KNOX, που αναφέρονται σε αυτή την εργασία, εμπλέκονται στο σχηματισμό ώριμου ξύλου και ότι το παράλογο KNOX7r1 έχει ευρύτερες λειτουργίες στην ανάπτυξη των Cactaceae. όταν μόλις άρχιζαν να συσσωρεύουν ξύλα. Αυτό το εύρημα υποδηλώνει περαιτέρω ότι τα γονίδια KNOX, που αναφέρονται σε αυτή την εργασία, εμπλέκονται στο σχηματισμό ώριμου ξύλου και ότι το παράλογο KNOX7r1 έχει ευρύτερες λειτουργίες στην ανάπτυξη των Cactaceae.

Τα έξι γονίδια KNOX κατηγορίας Ι που βρέθηκαν να εκφράζονται στην καμπική ζώνη των τεσσάρων ειδών κάκτων είναι υποτιθέμενα ορθόλογα του γονιδίου Arabidopsis BP/KNAT1, καθώς ανήκουν στον κλάδο KNAT1. Το γονίδιο Populus ARK2/PttKNOX1, το οποίο εκφράζεται στο αγγειακό κάμβιο και στο αναπτυσσόμενο ξυλόμυλο (Schrader et al., 2004; Du et al., 2009), ανήκει επίσης σε αυτό το clade (λευκή αιχμή βέλους στο Σχήμα 4). Προηγούμενη εργασία έχει προτείνει ότι το ARK2 εμπλέκεται στη δραστηριότητα του αγγειακού καμβίου και στη δευτερογενή ανάπτυξη. Τα φυτά πλήθους που υπερέκφραζαν συστατικά το ARK2 είχαν μια ευρύτερη καμπική ζώνη και μειωμένη διαφοροποίηση του λιγνωμένου δευτερογενούς ξυλώματος, ενώ η καθοδική ρύθμιση του ARK2 είχε ως αποτέλεσμα την πρώιμη διαφοροποίηση των λιγνοποιημένων δευτερογενών κυττάρων ξυλώματος (Du et al., 2009).

Είναι σημαντικό ότι δεν βρήκαμε υποτιθέμενους ορθολόγους των γονιδίων Arabidopsis STM και KNAT2-KNAT6 που εκφράζονται στην καμπική ζώνη Cactaceae. Αντίθετα, τόσο οι παράλογοι ARK1a όσο και ARK1b στο Populus (ορθολογικοί του STM) φαίνεται να εκφράζονται στο αγγειακό κάμπιο (βάση δεδομένων Popgenie ⁸). Η υπερέκφραση ARK1 σε ένα υβριδικό Populus οδήγησε σε πλειοτροπικούς φαινοτύπους, συμπεριλαμβανομένης της βραδύτερης διαφοροποίησης των κυττάρων που προέρχονται από κάμβιο (Groover et al., 2006). Ενώ το KNAT1 ορθολογικό ARK2 εκφράζεται τόσο στο αγγειακό κάμπιο όσο και στο αναπτυσσόμενο ξυλώμα του Populus, το ARK1a αποδείχθηκε ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω σε μη μεριστωματικούς δευτερογενείς αγγειακούς ιστούς (Groover et al., 2006), δείχνοντας έτσι μεγαλύτερη ομοιότητα με το πρότυπο έκφρασης STM στην κορυφή του βλαστού. Η έκφραση STM είχε ανιχνευθεί στο παρελθόν επίσης στα στελέχη της ταξιανθίας Arabidopsis κατά τη διάρκεια της επαγόμενης δευτερογενούς ανάπτυξης (Ko and Han, 2004). Όπως ήταν αναμενόμενο, δεν βρήκαμε ορθολογικό STM στο μεταγραφικό άκρο της ρίζας του P. pringlei, ενώ δύο παράλογοι του P. pringlei ορθολογικοί του KNAT2-KNAT6 εκφράστηκαν στο άκρο της ρίζας (Εικόνες 4, 5 και Πίνακας 1). Ο υποτιθέμενος ορθολόγος STM ήταν παρών στο L. williamsii βλαστού και μεταγραφήματος ρίζας, υποδηλώνοντας ότι το STM μπορεί να εκφράζεται σε ορισμένους ιστούς των Cactaceae, πιθανότατα στο κορυφαίο μερίστωμα του βλαστού. Η απουσία υποτιθέμενων ορθολόγων STM στη μεταγραφή της καμπιακής ζώνης υποδηλώνει πιθανές διαφορές στο γενετικό ρυθμιστικό δίκτυο αγγειακής κάμβιας στα Cactaceae έναντι των Arabidopsis και Populus. Είναι ενδιαφέρον ότι οι μονοκοτυλήδονες δεν έχουν ορθολόγους του Arabidopsis STM. τα γονίδια του γρασιδιού που εμπλέκονται στη συντήρηση του κορυφαίου μεριστώματος των βλαστών (αραβόσιτος: KNOTTED1 και ROUGH SHEATH1; ρύζι: ORYZA SATIVA HOMEOBOX1 (OSH1) και OSH15· Tsuda et al., 2011· Bolduc et al., 2014) ανήκουν στην κατηγορία KNAT ). Επιπλέον, τα γονίδια KNOX μονοκοτυλήδονα συγκεντρώθηκαν ως μία υποκατηγορία εντός των κλάδων KNAT1, KNAT2-KNAT6 και KNAT7, ενώ εντός της κλάσης KNAT3-KNAT4-KNAT5 δύο υποκατηγορίες, μία από Poaceae και μία άλλη από Musaceae.

Για τα τρία είδη που χρησιμοποιήθηκαν για το RNA-seq και το de novo συγκρότημα μεταγραφώματος, εντοπίστηκαν δύο παράλογοι κατηγορίας Ι στην αγγειακή ζώνη του A. retusus και του P. lychnidiflora, ενώ μόνο ένα εντοπίστηκε στο F. pilosus (Εικόνες 2, 4, 5 και Πίνακας 1). Το παράλογο KNOX που λείπει κατηγορίας Ι θα μπορούσε να είχε χαθεί από το F. pilosus ως μια εξελικτική αναπτυξιακή διαδικασία, επιτρέποντας την ειδογένεση μετά από έναν διπλασιασμό γονιδίων στα Cactaceae, ένα φαινόμενο που έχει τεκμηριωθεί καλά σε άλλες οικογένειες. Χρησιμοποιώντας δεδομένα από αλληλουχημένα γονιδιώματα (Συμπληρωματικός Πίνακας S2), δείξαμε ότι ο αριθμός των γονιδίων KNOX κατηγορίας Ι και κατηγορίας ΙΙ σε ένα βρύα, ένα λυκόφυτο και 43 είδη αγγειόσπερμων ποικίλλει σημαντικά, ιδιαίτερα μεταξύ ευδικοτυλήδονων ειδών (Εικόνα 6). Καθώς δεν υπάρχουν ακόμα είδη Cactaceae με γονιδίωμα αλληλουχίας, τα Cactaceae δεν συμπεριλήφθηκαν σε αυτήν την ανάλυση. Όλα τα αναλυθέντα είδη αγγειόσπερμων έχουν πολλά γονίδια κατηγορίας II και όλα εκτός από την Carica papaya έχουν περισσότερα από ένα γονίδια κατηγορίας Ι. Υπάρχουν 29 γονίδια KNOX στο Glycine max (17 γονίδια κατηγορίας I και 12 γονίδια κατηγορίας II) αλλά μόνο τέσσερα στο Carica (ένα κατηγορίας Ι και τρία γονίδια κατηγορίας II). Επιπλέον, διαφορετικά είδη μπορούν να έχουν διαφορετικό αριθμό παραλόγων σε κάθε clade (Συμπληρωματικός Πίνακας S2 και Εικόνα 5). Ο αριθμός των γονιδίων KNOX μπορεί επίσης να ποικίλλει μέσα σε είδη της ίδιας οικογένειας. Για παράδειγμα, στα διπλοειδή είδη της οικογένειας Brassicaceae (η οποία περιλαμβάνει τον μεγαλύτερο αριθμό ειδών με γονιδιώματα αλληλουχίας), ο αριθμός των γονιδίων KNOX ποικίλλει από πέντε στο Eutrema salsugineum έως 12 στο Brassica rapa. Ακόμη και τα είδη ενός μόνο γένους μπορούν να έχουν μεταβλητό αριθμό γονιδίων KNOX. ενώ τα είδη Arabidopsis A. thaliana και A. lyrata διαθέτουν και τα δύο οκτώ γονίδια KNOX,

ΣΧΗΜΑ 6. Αριθμός γονιδίων KNOX σε είδη από διαφορετικά ταξινομικά φυτά.Ο αριθμός των γονιδίων KNOX τόσο της κατηγορίας Ι όσο και της κατηγορίας II παρουσιάζεται για τα αγγειόσπερμα, ενώ για τα Physcomitrella patens και τη Selaginella moellendorffii, υποδεικνύονται μόνο οι συνολικοί αριθμοί των γονιδίων KNOX. Όταν όλα τα είδη από μια τάξη ανήκαν στην ίδια οικογένεια, η οικογένεια αναφέρεται σε παρένθεση κάτω από τη σειρά. Όπου απεικονίζονται διαφορετικές οικογένειες μιας τάξης, υποδεικνύονται με πεζά γράμματα κάτω από το όνομα του είδους. Για την τάξη Malpighiales, οι οικογένειες που περιλαμβάνονται είναι: (α) Euphorbiaceae, (β) Linaceae και (γ) Salicaceae. Για την τάξη Brassicales, ένα είδος ανήκει στην οικογένεια (δ) Caricaceae, ενώ τα υπόλοιπα ανήκουν στην οικογένεια Brassicaceae. Η τάξη Caryophyllales, στην οποία ανήκει η οικογένεια Cactaceae, απεικονίζεται με έντονους χαρακτήρες και υποδεικνύεται από ένα μαύρο τρίγωνο. Τα είδη κάκτων δεν περιλαμβάνονται,^∗ Είδη από το ίδιο γένος με τον ίδιο αριθμό γονιδίων KNOX. ^∗∗ Είδη από το ίδιο γένος με διαφορετικό αριθμό γονιδίων KNOX. Σημειώστε ότι ο αριθμός των γονιδίων KNOX που ανήκουν στην κατηγορία I, κατηγορία II ή και στα δύο, μπορεί να είναι διαφορετικός.

Βρήκαμε ότι δύο υποτιθέμενοι ορθολόγοι των παραλόγων KNOX κατηγορίας II Arabidopsis KNAT3, KNAT4 και KNAT5 εκφράστηκαν στην καμπική ζώνη του A. retusus, αλλά μόνο ένας εκφράστηκε στην καμπιακή ζώνη του F. pilosus και του P. lychnidiflora (Εικόνες 3 –5 και Πίνακας 1). Μόνο ένας υποτιθέμενος παράλογος που εκφράζεται στην άκρη της ρίζας του P. pringlei ανήκε σε αυτή την κατηγορία. Ένα παράλογο από το δημοσιευμένο μεταγραφικό βλαστών και ρίζας του L. williamsii (Ibarra-Laclette et al., 2015) ανήκει επίσης σε αυτήν την κατηγορία. Αξιοσημείωτο είναι ότι μεταξύ των τριών ειδών που χρησιμοποιήθηκαν για τη συναρμολόγηση μεταγραφομετρικών ζωνών της καμπίας, δύο παράλογοι στο A. retusus και στο F. pilosus ανήκαν στην κλάση KNAT7, ενώ δεν βρέθηκε κανένας υποτιθέμενος ορθολόγος KNAT7 στο κάμπιο του P. lychnidiflora (P. alensis δεν λήφθηκε υπόψη καθώς η συναρμολόγηση του μεταγραφώματος δεν πραγματοποιήθηκε για αυτό το είδος). Το KNAT7 είναι ένας μεταγραφικός καταστολέας της βιοσύνθεσης του δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος (Liu et al., 2014). Το P. lychnidiflora έχει ινώδες ξύλο με σημαντική ξυλίωση του κυτταρικού τοιχώματος, το A. retusus έχει μη ινώδες ξύλο με άφθονες τραχειίδες ευρείας ζώνης και λιγότερη ξυλίωση, ενώ στο δίμορφο ξύλο του F. pilosus, οι τραχειές ευρείας ζώνης αναπτύσσονται πριν από πιο λιγνωμένα κύτταρα. . Ως εκ τούτου, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η κατασταλτική δραστηριότητα των ορθολόγων KNAT7 κατά τη διάρκεια της βιοσύνθεσης του δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος θα μπορούσε να εξηγήσει τις διαφορές στον τύπο ξύλου μεταξύ αυτών των ειδών, συμπεριλαμβανομένου του χαμηλότερου επιπέδου λιγνίωσης που παρατηρήθηκε στο A. retusus και στο F. pilosus. ενώ στο δίμορφο ξύλο του F. pilosus οι τραχειίδες ευρείας ζώνης αναπτύσσονται πριν από περισσότερα λιγνωμένα κύτταρα. Ως εκ τούτου, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η κατασταλτική δραστηριότητα των ορθολόγων KNAT7 κατά τη διάρκεια της βιοσύνθεσης του δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος θα μπορούσε να εξηγήσει τις διαφορές στον τύπο ξύλου μεταξύ αυτών των ειδών, συμπεριλαμβανομένου του χαμηλότερου επιπέδου λιγνίωσης που παρατηρήθηκε στο A. retusus και στο F. pilosus. ενώ στο δίμορφο ξύλο του F. pilosus οι τραχειίδες ευρείας ζώνης αναπτύσσονται πριν από περισσότερα λιγνωμένα κύτταρα. Ως εκ τούτου, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η κατασταλτική δραστηριότητα των ορθολόγων KNAT7 κατά τη διάρκεια της βιοσύνθεσης του δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος θα μπορούσε να εξηγήσει τις διαφορές στον τύπο ξύλου μεταξύ αυτών των ειδών, συμπεριλαμβανομένου του χαμηλότερου επιπέδου λιγνίωσης που παρατηρήθηκε στο A. retusus και στο F. pilosus.

Βρήκαμε ότι οι μεταγραφές και των δύο κατηγοριών γονιδίων KNOX εκφράζονται στην καμπική ζώνη των τεσσάρων ειδών Cactaceae που μελετήθηκαν και επομένως θα μπορούσαν να εκφραστούν είτε σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους είτε στον ίδιο κυτταρικό τύπο εντός της αγγειακής ζώνης. Αρκετές πρωτεΐνες KNOX έχουν αποδειχθεί ότι μετακινούνται επιλεκτικά από το ένα κυτταρικό στρώμα στο άλλο (ανασκόπηση από Han et al., 2014), υποδηλώνοντας ότι ακόμη και αν τα γονίδια κατηγορίας Ι και ΙΙ μεταγραφούν σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους, οι κωδικοποιημένες πρωτεΐνες θα μπορούσαν να συνυπάρχουν στο ίδιο κύτταρο ως αποτέλεσμα διακίνησης πρωτεϊνών. Σε κάθε περίπτωση, καθώς δεν βρέθηκαν στοιχεία αμοιβαίας καταστολής όταν συνδυάστηκαν μεταλλάξεις απώλειας λειτουργίας KNOX κατηγορίας Ι και κατηγορίας ΙΙ του Arabidopsis (Furumizu et al., 2015), οι πρωτεΐνες KNOX που ανήκουν σε διαφορετικές κατηγορίες μπορούσαν να ασκήσουν τις λειτουργίες τους εντός του ίδιο κελί. Οι πρωτεΐνες KNOX είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρούν με μια αδελφή ομάδα πρωτεϊνών από την οικογένεια BEL1-LIKE-HOMEODOMAIN (BHL, ή BELL από το ιδρυτικό γονίδιο BELL 1). Τόσο οι πρωτεΐνες KNOX όσο και οι πρωτεΐνες BELL ανήκουν στην υπερκατηγορία TALE (επέκταση βρόχου τριών αμινοξέων) των πρωτεϊνών homeobox. Ο σχηματισμός ετεροδιμερούς KNOX-BELL επηρεάζει τον κυτταρικό του εντοπισμό και την επιλογή στόχου KNOX (ανασκόπηση από Di Giacomo et al., 2013· Arnaud and Pautot, 2014). Από ετερόλογα πειράματα έκφρασης προτάθηκε ότι συγκεκριμένες πρωτεΐνες KNOX θα μπορούσαν να αλληλεπιδράσουν με διαφορετικούς συνεργάτες BELL οδηγώντας σε πολυάριθμους συνδυασμούς με διακριτές δραστηριότητες, ρυθμίζοντας έτσι διαφορετικά σύνολα στόχων, συμπεριλαμβανομένων μεταγραφικών παραγόντων και ορμονικών οδών, και τελικά επηρεάζουν πολλαπλές αναπτυξιακές διαδικασίες φυτών. Πρόσφατα όμως, Προτάθηκε μια πιο ειδική επιλεκτικότητα για τις in vivo αλληλεπιδράσεις KNOX-BELL (Furumizu et al., 2015), η οποία θα μπορούσε επίσης να ενισχύσει τις ιδιότητες κάθε εταίρου ετεροδιμερισμού. Έτσι, η αλληλεπίδραση μεταξύ του μεταγραφικού καταστολέα KNAT7 και του συνεργάτη του BHL6 θα μπορούσε να ενισχύσει τη δραστηριότητά τους στην καταστολή γονιδίων που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση του δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος (Liu et al., 2014).

Η γνώση των διαδικασιών διπλασιασμού και υπολειτουργικότητας των ρυθμιστικών γονιδίων μας βοηθά να κατανοήσουμε την εξέλιξη των διαφορετικών πτυχών της ανάπτυξης των φυτών (Pires and Dolan, 2012), συμπεριλαμβανομένης της εξέλιξης της αγγειακής ανάπτυξης. Η εργασία μας συμβάλλει στην αποσαφήνιση των μηχανισμών με τους οποίους σχηματίζονται διαφορετικοί τύποι ξύλου στα Cactaceae και παρέχει πληροφορίες για την εξελικτική ιστορία των γονιδίων KNOX σε διαφορετικά είδη αγγειόσπερμων και τον ρόλο τους στην ειδογένεση των φυτών της γης.

Συνεισφορές Συγγραφέων

Οι TT, JR-R, AV, FV-S, GR-A και SS σχεδίασαν το έργο. Οι TT, JR-R, EP, AV, GR-A και SS πραγματοποίησαν τα πειράματα και ανέλυσαν τα δεδομένα. Οι GR-A και JR-R ετοίμασαν τα σχήματα. και ο TT και ο SS έγραψαν το χειρόγραφο. Όλοι οι συγγραφείς έχουν διαβάσει και εγκρίνει το χειρόγραφο.

Δήλωση Σύγκρουσης Συμφερόντων

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη απουσία εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.

Ευχαριστίες

Η χρηματοδότηση παρασχέθηκε από την DGAPA-PAPIIT, την UNAM (επιχορηγήσεις IN209012 και 210115 στην TT και IN207115 στην SS) και από την Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [CB2014-240055 επιχορήγηση προς την SS. Ph.D. υποτροφίες 220343 σε JR-R. 367139 στο GR-A και 700638 στο EP, και μια επιχορήγηση μεταδιδακτορικού (220343) στον JR-R]. Ευχαριστούμε τον Jorge Nieto Sotelo για τα πολύτιμα σχόλια, τον Paul Gaytan, τον Eugenio Lopez και το προσωπικό της μονάδας σύνθεσης και αλληλούχισης DNA του IBt-UNAM για τη σύνθεση ολιγονουκλεοτιδίων και τη Laura Márquez Valdelamar για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας DNA.

Συμπληρωματικό υλικό

Το συμπληρωματικό υλικό για αυτό το άρθρο βρίσκεται στο διαδίκτυο στη διεύθυνση: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2017.00218/full#supplementary-material

ΣΧΗΜΑ S1 | Κατηγορία Ι και ΙΙ έκφραση μεταγραφής KNOX ανιχνεύθηκε σε δείγματα καμπιακής ζώνης με τελικό σημείο RT-PCR.

ΕΙΚΟΝΑ S2 | Η μήτρα ταυτότητας και ομοιότητας των συναγόμενων πρωτεϊνών KNOX που προσδιορίστηκαν σε αυτή τη μελέτη. (Α) Πρωτεΐνες κατηγορίας Ι. (Β) Συνενωμένοι τομείς KNOX1, KNOX2, ELK και HD πρωτεϊνών κατηγορίας Ι. (Γ) Πρωτεΐνες Τάξης II. (D) Συνδεμένες περιοχές KNOX1, KNOX2, ELK και HD πρωτεϊνών κατηγορίας II.

ΠΙΝΑΚΑΣ S1 | PCR εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη.

ΠΙΝΑΚΑΣ S2 | Τα αναγνωριστικά των αλληλουχιών KNOX που χρησιμοποιούνται για τη μοριακή φυλογενετική ανάλυση.

^ https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases
^ https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench/
^ http://phytozome.jgi.doe.gov
^ http://bvseq.molgen.mpg.de/index.shtml
^ http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/
^ http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/
^ http://tree.bio.ed.ac.uk/
^ http://popgenie.org/

: Cactaceae, μεταγραφικοί παράγοντες KNOX, KNAT7, δίμορφο ξύλο, ινώδες ξύλο, μη ινώδες ξύλο, αγγειακό κάμβιο, ξυλεία ξυλείας