Αλλαγές στη μικροχλωρίδα του εντέρου ελαφιού δασικού μόσχου (Moschus berezovskii) κατά τη διάρκεια της ex situ διατήρησης

• ¹ Σχολή Οικολογίας και Διατήρησης της Φύσης, Δασικό Πανεπιστήμιο του Πεκίνου, Πεκίνο, Κίνα
• ² Zhangzhou Pien Tze Huang Pharmaceutical Co., Ltd., Zhangzhou, Fujian, Κίνα
• ³ Huailai Zhiyangtianbao Technical Development Co., Ltd., Zhangjiakou, Κίνα

Η ex situ διατήρηση είναι μια σημαντική τεχνική για την προστασία της σπάνιας και απειλούμενης άγριας ζωής και η διατήρηση σταθερής ατομικής υγείας είναι ζωτικής σημασίας για την επιτυχία της. Η σύνθεση της μικροχλωρίδας του εντέρου είναι ένας κρίσιμος δείκτης της υγείας των ζώων και ως εκ τούτου θα πρέπει να παρακολουθείται στενά κατά την ex situ διατήρηση για την παρακολούθηση των επιπτώσεων στην υγεία των ζώων. Τα ελάφια μόσχου του δάσους (Moschus berezovskii) διανέμονταν ιστορικά στην επαρχία Χεμπέι της Κίνας, ωστόσο, τώρα έχουν εξαφανιστεί στην περιοχή. Έτσι, πραγματοποιήθηκαν ex situ προσπάθειες διατήρησης το 2016, όπου περίπου 50 άτομα μετανάστευσαν τεχνητά από το Weinan, Shaanxi στο Huailai, Hebei. Για να παρακολουθήσουμε την υγεία του εντέρου αυτών των μεταναστευμένων ατόμων, χρησιμοποιήσαμε τεχνολογία αλληλουχίας υψηλής απόδοσης 16S rRNA για να εξετάσουμε τις διαφορές μικροβίων μεταξύ των νεανικών ομάδων Huailai και Weinan. και μεταξύ ομάδων ενηλίκων Huailai και Weinan. Η ανάλυση άλφα ποικιλομορφίας έδειξε ότι ο πλούτος της μικροχλωρίδας μειώθηκε σημαντικά μετά τη μετανάστευση στην περιοχή Huailai και τα αποτελέσματα της ποικιλότητας βήτα έδειξαν επίσης σημαντική ανομοιότητα στις μικροβιακές κοινότητες του εντέρου, καταδεικνύοντας τις ευδιάκριτες διαφορές στη μικροβιακή δομή στον πληθυσμό ελαφιών του δάσους από τις δύο περιοχές. ομάδες ανηλίκων και ενηλίκων, αντίστοιχα. Επιπλέον, η πρόβλεψη του λειτουργικού προφίλ PICRUSt έδειξε ότι οι λειτουργίες της πέψης και της απορρόφησης του εντέρου και της αποδόμησης των τοξικών ουσιών αποδυναμώθηκαν σημαντικά μετά την ex situ διατήρηση. Παρατηρήθηκαν επίσης διαφορές στη σύνθεση της διατροφής μεταξύ των ατόμων των δύο τοποθεσιών και διερευνήθηκε ο αντίκτυπος της τροφής στις συνθέσεις μικροχλωρίδας του εντέρου στο ελάφι δασικού μόσχου κατά τη διάρκεια της ex situ διατήρησης. Αυτή η μελέτη παρέχει μια θεωρητική βάση για την ανάπτυξη ex situ μέτρων διατήρησης, ειδικά για την προστασία των δασικών ελαφιών μόσχου.

Εισαγωγή

Τα ελάφια μόσχου του δάσους (Moschus berezovskii) διανεμήθηκαν ευρέως στην Κίνα. Ωστόσο, ο άγριος πληθυσμός μειώθηκε γρήγορα από 2,5 εκατομμύρια τη δεκαετία του 1950 σε λιγότερο από 100.000 στη δεκαετία του 1990 λόγω της αδιάκριτης λαθροθηρίας και των μειωμένων περιοχών φυσικών ενδιαιτημάτων (Jie et al., 2015; Cai et al., 2020). Δεδομένου ότι η επέκταση του πληθυσμού με τεχνητή εκτροφή ex situ ακολουθούμενη από επανεισαγωγή στη φύση έχει αποδειχθεί αποτελεσματική στη διατήρηση των απειλούμενων ζώων, η Κίνα άρχισε να εκτρέφει ελάφια δασικού μόσχου το 1958 για να διατηρήσει επαρκή ελάφια που εκτρέφονται σε αιχμαλωσία για επανεισαγωγή, τα οποία βοήθησαν στην αποκατάσταση του πληθυσμού των ελαφιών μόσχου του δάσους. για πολύτιμες συγκομιδές μόσχου, ενώ παράλληλα μειώνεται η πίεση στους πόρους των άγριων ελαφιών μόσχου (He et al., 2014).

Η προώθηση της ex situ τεχνητής αναπαραγωγής είναι το πρώτο βήμα για την προστασία αυτού του είδους. Η επιτυχημένη τεχνητή αναπαραγωγή ελαφιού δασικού μόσχου στην Κίνα επικεντρώθηκε κυρίως στις επαρχίες Shaanxi και Sichuan. Μια έρευνα έδειξε ότι ο πληθυσμός των ελαφιών του δασικού μόσχου ξεπέρασε τα 30.000 άτομα το 2013 (Feng et al., 2013) και αποκαταστάθηκε η μερική ιστορική περιοχή εξάπλωσής του. Η επαρχία Hebei ήταν επίσης η ιστορική περιοχή διανομής των ελαφιών μόσχου, ωστόσο, το υπερβολικό κυνήγι και η καταστροφή των οικοτόπων είχαν ως αποτέλεσμα την εξαφάνιση του πληθυσμού (Wen, 2016). Πραγματοποιήσαμε ex situ εκτροφή ελαφιών μόσχου του δάσους στην περιοχή, προκειμένου να αποκατασταθεί η διανομή ελαφιών μόσχου στην επαρχία Hebei.

Η εστίαση στην κατάσταση της υγείας είναι κρίσιμη κατά τη διαδικασία ex situ διατήρησης των δασικών ελαφιών μόσχου. Η μικροχλωρίδα του εντέρου είναι ένας σημαντικός φυσιολογικός δείκτης της υγείας των ζώων. Η ομοιόστασή του είναι αναπόσπαστο στοιχείο για τη διατήρηση διαφόρων λειτουργιών που σχετίζονται με την υγεία (Prakash et al., 2011; Aziz et al., 2013). Μια ανισορροπία στη μικροχλωρίδα του εντέρου συχνά συνοδεύεται από μείωση της ποικιλότητας των μικροβίων. Η μειωμένη ποικιλομορφία και ο πλούτος της μικροχλωρίδας του ζωικού εντέρου μπορεί να αυξήσει την πιθανότητα ασθενειών στα προσβεβλημένα ζώα (Li et al., 2018; Zhang et al., 2019; Mao et al., 2020; Zhao et al., 2021). Ενώ η μικροχλωρίδα του εντέρου επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες, τα τρόφιμα είναι ο πιο άμεσος παράγοντας που επηρεάζει την ποικιλομορφία της εντερικής μικροχλωρίδας των ζώων (Hicks et al., 2018). Η τροφή είναι ένα υπόστρωμα για τη μικροβιακή ζύμωση και οδηγεί τη σύνθεση και το μεταβολισμό των μικροβιακών κοινοτήτων (Brian et al., 2011). Επιπλέον, είναι άμεση επιρροή στην εντερική μικροχλωρίδα και βασικός παράγοντας στη συνεξέλιξη των ζώων και της εντερικής τους μικροχλωρίδας (Nicholson et al., 2012; Yang et al., 2014).

Αυτή η μελέτη ανέλυσε και συνέκρινε τις διαφορές στη μικροχλωρίδα του εντέρου των ελαφιών μόσχου του δάσους στις περιοχές μετανάστευσης (Huailai, επαρχία Hebei) και μεταναστευτικές περιοχές (Weinan, επαρχία Shaanxi) για να βελτιώσει την κατανόηση των αλλαγών της σύνθεσης στη μικροχλωρίδα του εντέρου τους κατά τη διάρκεια της ex situ διατήρησης και να παρέχει μια επιστημονική αναφορά για τη βελτίωση και αξιολόγηση της κατάστασης της υγείας τους. Η μελέτη είναι επωφελής για τη συσσώρευση ex situ εμπειρίας διατήρησης και τη βελτίωση του ποσοστού επιτυχίας της ex situ διατήρησης ελαφιών μόσχου αναπαραγωγής.

Υλικά και μέθοδοι

Βασικές πληροφορίες για ερευνητικούς τομείς

Οι γεωγραφικές πληροφορίες των βάσεων αναπαραγωγής ελαφιού μόσχου του δάσους Weinan, Shaanxi και Huailai, Hebei και σύγκριση τροφίμων περιγράφονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1 και Πίνακα 1, αντίστοιχα. Ο πληθυσμός των ελαφιών του δάσους Hebei μετανάστευσε τεχνητά από το δάσος Shaanxi το 2016. Από τότε, το μέγεθος του πληθυσμού αυξήθηκε σε περισσότερα από 200 άτομα λόγω της αρχικής επιτυχίας των προγραμμάτων τεχνητής αναπαραγωγής.

Πίνακας 1. Σύγκριση τροφίμων μεταξύ των περιοχών Weinan και Huailai.

Το Weinan βρίσκεται στο μεσαίο ρεύμα του Κίτρινου Ποταμού στην ανατολική πεδιάδα Guanzhong στην επαρχία Shaanxi. Έχει θερμό, εύκρατο, ημί-υγρό και ημίξηρο κλίμα των μουσώνων, με τέσσερις διακριτές εποχές, αρκετό φως και κατάλληλες βροχοπτώσεις. Οι ειδικές περιβαλλοντικές και τροφικές συνθήκες του φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1 και Πίνακα 1, αντίστοιχα.

Το Huailai βρίσκεται στα βορειοδυτικά της επαρχίας Hebei στην εύκρατη ημι-άνυδρη περιοχή και έχει ένα εύκρατο ηπειρωτικό κλίμα των μουσώνων. Έχει τέσσερις διαφορετικές εποχές, αρκετό φως, εποχές καύσωνα και βροχών παρόμοιες με το Weinan και μεγάλη διαφορά θερμοκρασίας μεταξύ ημέρας και νύχτας. Ο καλοκαιρινός καιρός είναι ζεστός και υγρός, με αυξημένες βροχοπτώσεις. Το χειμώνα, η δραστηριότητα του κρύου αέρα είναι συχνή και ο καιρός είναι κρύος και χιονισμένος. Οι ειδικές συνθήκες περιβάλλοντος και τροφίμων φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1 και Πίνακα 1, αντίστοιχα.

Παραδοσιακή κινεζική ιατρική φόρμουλα και μέθοδος σίτισης

Το άγριο μόσχο ελάφι του δάσους είναι γνωστό ότι τρέφεται ελεύθερα με πολλά φυτά στην καθημερινή του διατροφή που ταξινομούνται ως παραδοσιακή κινεζική ιατρική (TCM), τα οποία έχουν μελετηθεί εκτενώς ως ασφαλές, μη τοξικό ή λιγότερο τοξικό διατροφικό πρόσθετο σε πρακτικές ζωικής παραγωγής (Yeh et al., 2011· Gong et al., 2014). Ως εκ τούτου, το TCM προστέθηκε στη διατροφή τους για να αντισταθμιστεί η έλλειψη θρεπτικών ουσιών στην τεχνητή τροφή κατά τη διάρκεια της διαδικασίας αναπαραγωγής στο Weinan, Shaanxi (Yang et al., 2011).

Σε αυτή τη μελέτη, το TCM χορηγήθηκε από το στόμα ως συμπλήρωμα διατροφής στο ελάφι του δάσους. Ένα μείγμα 18 διαφορετικών TCM αλέστηκε σε σκόνη και προστέθηκε στην τροφή ενήλικων και νεαρών ελαφιών μόσχου του δάσους στην περιοχή Weinan του Shaanxi. Ενώ 5 g του TCM χορηγούνταν δύο φορές την ημέρα για αυτά τα ελάφια μόσχου του δάσους, κανένα δεν χορηγήθηκε σε εκείνους στην περιοχή Huailai της επαρχίας Hebei.

Τα κύρια συστατικά των TCM περιλαμβάνουν Dang Shen (Radix Codonopsis) 200 g, Bai Zhu (Rhizoma Atractylodis Macrocephalae) 100 g, Fu Ling (Poria) 60 g, Gan Cao (Radix Glycyrrhizae) 50 g, Sheng Shan Fruae Zhaae ) 200 g, Ji Nei Jin (Endothelium Corneum Gigeriae Galli) 100 g, Chen Pi (Pericarpium Citri Reticulatae) 80 g, Mai Ya (Fructus Hordei Germinatus) 100 g, Shen Qu (Massa Medicata Qigerata Fermentata) 50 g, Astragali) 200 g, Cao Dou Kou (Semen Alpiniae Katsumadai) 50 g, Hou Po (Cortex Magnoliae Officinalis) 100 g, και Bai Kou (Fructus Amomi Rotundus) 50 g; Συστατικά πρόληψης του κρυολογήματος: Jin Yin Hua (Flos Lonicerae) 200 g, Lian Qiao (Fructus Forsythiae) 200 g, Guan Zhong (Rhizoma Cyrtomii) 200 g, Chai Hu (Radix Bupleuri) 200 g και Ban Lan Gen (Radix Isati) σολ.

Ζώα και συλλογή δειγμάτων

Δώδεκα υγιή ενήλικα ελάφια μόσχου του δάσους (6 αρσενικά, 6 θηλυκά, 4–8 ετών) και 12 υγιή νεαρά ελάφια μόσχου του δάσους (6 αρσενικά, 6 θηλυκά, ηλικίας 1–2 ετών) επιλέχθηκαν από τις περιοχές Weinan και Huailai στα μέσα της Δεκέμβριος 2021 (τα ενήλικα ελάφια που μετανάστευσαν στην επαρχία Hebei μεταφέρθηκαν ως ενήλικα στην επαρχία Shaanxi). Τα ελάφια χωρίστηκαν σε δύο ομάδες νεαρών, Huailai juvenile (HJ) και Weinan juvenile (WJ) και δύο ενήλικες ομάδες, Huailai ενήλικες (HA) και Weinan ενήλικες (WA).

Νωπά δείγματα κοπράνων συλλέχθηκαν νωρίς το πρωί από προηγουμένως καθαρισμένους χώρους εκμετάλλευσης. Κατά τη συλλογή του δείγματος φορέθηκαν αποστειρωμένα γάντια μιας χρήσης για να αποφευχθεί η μόλυνση από τον άνθρωπο. Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν σε αποστειρωμένους σωλήνες φυγοκέντρησης αμέσως μετά τη συλλογή και σφραγίστηκαν για να αποφευχθεί η διασταυρούμενη μόλυνση. Αμέσως μετά τη δειγματοληψία, τα δείγματα κοπράνων αποθηκεύτηκαν σε υγρό άζωτο στους -80°C μέχρι την εκχύλιση του DNA.

Εκχύλιση DNA, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης και αλληλούχιση ζευγαρωμένων άκρων

Το συνολικό DNA εξήχθη με το QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Γερμανία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η ακεραιότητα των νουκλεϊκών οξέων προσδιορίστηκε οπτικά με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1,0% που περιέχει βρωμιούχο αιθίδιο. Η συγκέντρωση και η καθαρότητα κάθε εκχυλίσματος DNA προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ Qubit dsDNA HS Assay Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, Ηνωμένες Πολιτείες). Το εξαγόμενο συνολικό DNA διατηρήθηκε στους -80°C.

Αφού εκχυλίστηκε το συνολικό DNA του δείγματος, οι εκκινητές σχεδιάστηκαν σύμφωνα με τη διατηρημένη περιοχή. Η περιοχή V3-V4 του βακτηριακού γονιδίου 16S-rRNA ενισχύθηκε με PCR (95°C για 5 λεπτά, ακολουθούμενο από 25 κύκλους 95°C για 30 δευτερόλεπτα, 50°C για 30 δευτερόλεπτα, 72°C για 40 δευτερόλεπτα, και 72°C για 7 λεπτά) χρησιμοποιώντας τους εκκινητές 338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′) και 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3) και η άρθρωση αλληλουχίας προστέθηκε στο τέλος των εκκινητών. Τα προϊόντα PCR αναμίχθηκαν με το ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης 2 χ και υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης 1,8% για ανίχνευση. Τα προϊόντα καθαρίστηκαν, ποσοτικοποιήθηκαν και ομογενοποιήθηκαν για να σχηματίσουν μια βιβλιοθήκη αλληλουχίας. Η κατασκευασμένη βιβλιοθήκη υποβλήθηκε σε έλεγχο ποιότητας της βιβλιοθήκης από το Qsep-400 και η κατάλληλη βιβλιοθήκη αναλύθηκε με την Illumina Novaseq 6000.

Ανάλυση δεδομένων

Το Trimmomatic v0.33 (Bolger et al., 2014) χρησιμοποιήθηκε για το φιλτράρισμα των ακατέργαστων αναγνώσεων αλληλουχίας. Οι αλληλουχίες εκκινητών ταυτοποιήθηκαν και αφαιρέθηκαν χρησιμοποιώντας το Cutadapt 1.9.1 (Martin, 2011) για να ληφθούν καθαρές αναγνώσεις. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε το Usearch v10 (Magoc και Salzberg, 2011) για τη συνένωση των καθαρών αναγνώσεων κάθε δείγματος χρησιμοποιώντας την εντολή επικάλυψης και τα συνενωμένα δεδομένα φιλτράρονταν κατά μήκος, σύμφωνα με το εύρος των μηκών ακολουθίας για τις διαφορετικές περιοχές. Για να ληφθούν οι τελικές αποτελεσματικές αναγνώσεις, οι χιμαιρικές αλληλουχίες αναγνωρίστηκαν και αφαιρέθηκαν χρησιμοποιώντας το UCHIME v4.2 (Edgar et al., 2011). Η ανάλυση πληροφοριών περιελάμβανε λειτουργικές ταξινομικές μονάδες ταξινόμησης χαρακτηριστικών (OTU) και παραλλαγές ακολουθίας αμπλικονίων (ASVs), ποικιλομορφία, διαφορά, συσχέτιση και αναλύσεις πρόβλεψης συναρτήσεων.

Η ομαδοποίηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Usearch για αναγνώσεις με 97% ομοιότητα για τη λήψη OTU. Χρησιμοποιώντας το SILVA (Quast et al., 2013) ως βάση δεδομένων αναφοράς, χρησιμοποιήθηκε ένας ταξινομητής Naïve Bayes για την εκτέλεση ταξινομικών σχολιασμών των ακολουθιών χαρακτηριστικών, για να ληφθούν οι ταξινομικές πληροφορίες που αντιστοιχούν σε κάθε χαρακτηριστικό που απαιτείται για τον προσδιορισμό της σύνθεσης κοινότητας κάθε δείγματος σε κάθε ταξινομική κατάταξη (φυλή, τάξη, τάξη, οικογένεια, γένος και είδος). Το QIIME (Bolyen et al., 2019) χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία πινάκων αφθονίας ειδών σε διαφορετικές ταξινομικές τάξεις. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν οι συναρτήσεις R για τη δημιουργία χαρτών δομής κοινότητας για τα δείγματα σε κάθε ταξινομική κατάταξη.

Οι δείκτες άλφα ποικιλομορφίας (δηλαδή ACE, Chao1, Shannon και Simpson) των δειγμάτων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας QIIME2 (Bolyen et al., 2019). Η βήτα ποικιλότητα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας QIIME για να συγκριθεί ο βαθμός ομοιότητας στην ποικιλότητα των ειδών μεταξύ διαφορετικών δειγμάτων. Η κύρια ανάλυση συντεταγμένων (PCoA) πραγματοποιήθηκε σε αλλαγές μικροχλωρίδας του εντέρου σε ελάφια μόσχου του δάσους χρησιμοποιώντας binary_jaccard. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση ομοιοτήτων (ANOSIM) για τον προσδιορισμό των διαφορών μεταξύ των ομάδων χρησιμοποιώντας unweighted_UniFrac. Το LEfSe [Linear Discriminant Analysis (LDA) Effect Size] πραγματοποιήθηκε για να υπολογιστεί ο βιοδείκτης διαφοράς στατιστικών μεταξύ διαφορετικών ομάδων. Το τεστ κατάταξης χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της σημαντικής διαφοράς των ειδών σε δύο ή περισσότερες ομάδες και τη διόρθωση της τιμής p χρησιμοποιώντας FDR.

Οι δείκτες διαφοροποίησης άλφα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. Οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν με SPSS 20.0. Οι στατιστικές συγκρίσεις έγιναν με το Student’s t-test. Το επίπεδο σημαντικότητας (P) ορίστηκε στο 0,05.

Αποτελέσματα

Ανάλυση των αποτελεσμάτων αλληλουχίας 16S rRNA

Συνολικά ελήφθησαν 1.881.135 ζεύγη ακατέργαστων αναγνώσεων από 24 δείγματα. Μετά τον ποιοτικό έλεγχο και το μάτισμα, παρήχθησαν 1.875.191 καθαρές αναγνώσεις—κάθε δείγμα παρήγαγε τουλάχιστον 58.501 καθαρές αναγνώσεις, με μέσο όρο 78.133 καθαρές αναγνώσεις. Τα στατιστικά στοιχεία των φιλτραρισμένων δεδομένων αλληλουχίας κάθε δείγματος φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 2 και η αποτελεσματική κατανομή μήκους αλληλουχίας σε όλα τα δείγματα φαίνεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 1.

Οι καμπύλες αραίωσης χρησιμοποιήθηκαν για να επαληθευτεί εάν τα δεδομένα αλληλουχίας ήταν επαρκή για να αντικατοπτρίζουν την ποικιλομορφία των ειδών και να αντικατοπτρίζουν έμμεσα την αφθονία των ειδών των δειγμάτων. Η τελική καμπύλη έγινε σταθερή, υποδηλώνοντας ότι οι ακολουθίες δειγμάτων ήταν επαρκείς για ανάλυση δεδομένων (Εικόνα 1). Τα βακτήρια που ανιχνεύθηκαν ταξινομήθηκαν σε 19 φυλές, 28 κατηγορίες, 53 τάξεις, 86 οικογένειες, 196 γένη και 208 είδη. Ο αριθμός κάθε είδους σε διαφορετικά επίπεδα παρουσιάζεται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 3 και ο συνολικός αριθμός OTU που καλύπτονται από κάθε δείγμα στα δευτερεύοντα επίπεδα παρουσιάζεται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 4.

Εικόνα 1. Καμπύλη σπανιότητας. Η συντεταγμένη x είναι ο αριθμός των ακολουθιών που δειγματολήφθηκαν και η συντεταγμένη y είναι ο αριθμός των παρατηρούμενων OTU. Κάθε καμπύλη στο γράφημα αντιπροσωπεύει ένα δείγμα, το οποίο επισημαίνεται με διαφορετικό χρώμα. Ο αριθμός των OTU αυξάνεται με το βάθος αλληλουχίας. Όταν η καμπύλη γίνεται σταθερή, ο αριθμός των ανιχνευόμενων OTU δεν αυξάνεται με την επέκταση των εξαγόμενων δεδομένων, υποδεικνύοντας μια στιγμή που η ποσότητα των δεδομένων αλληλουχίας είναι λογική.

Βακτηριακή σύνθεση και σχετική αφθονία

Τα διαγράμματα Venn χρησιμοποιήθηκαν για να επιβεβαιώσουν την εντερική μικροχλωρίδα του δασικού ελαφιού μόσχου στις περιοχές Weinan και Huailai. Οι βακτηριακοί πληθυσμοί που είναι κοινοί στα άτομα σε κάθε ομάδα θεωρήθηκαν ο πυρήνας μικροχλωρίδας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, ο αριθμός των OTU που μοιράζονταν τα ελάφια του δάσους ήταν 980 στις ομάδες WJ και HJ (Εικόνα 2Α), 1.003 στις ομάδες WA και HA (Εικόνα 2Β), 993 στις ομάδες HJ και HA (Εικόνα 2C ), και 1.066 στις ομάδες WJ και WA (Εικόνα 2D).

Εικόνα 2. Διάγραμμα Venn. Τα διαγράμματα Venn δείχνουν τους αριθμούς των OTU (97% ταυτότητα ακολουθίας) που μοιράζονταν ή δεν μοιράζονταν ενήλικα και νεαρά ελάφια μόσχου του δάσους στις περιοχές Weinan και Huailai. (Α) Ο αριθμός των OTU που μοιράζονται οι HJ και WJ. (Β) Ο αριθμός των OTU που μοιράζονται οι HA και WA. (Γ) Ο αριθμός των OTU που μοιράζονται οι HJ και HA. (Δ) Ο αριθμός των OTU που μοιράζονται οι WJ και WA.

Οι κορυφαίες 10 φυλές και 10 γένη που βασίζονται στη σχετική αφθονία των βακτηρίων των κοπράνων στα δείγματα WJ, HJ, WA και HA εμφανίζονται στο Σχήμα 3. Σε επίπεδο φυλής, το Firmicutes (61,184%) ήταν το κυρίαρχο φυλάκιο, ακολουθούμενο από το Bacteroidetes ( 18.801%) και Proteobacteria (8.401%) στην ομάδα WJ. Τα Firmicutes (68,554%) και τα Bacteroidetes (26,927%) ήταν τα κυρίαρχα φυτά, ακολουθούμενα από τα Tenericutes (1,667%) στην ομάδα HJ. Τα Firmicutes (66,894%) και τα Bacteroidetes (21,379%) ήταν τα κυρίαρχα φυτά, ακολουθούμενα από τα Tenericutes (3,094%) στην ομάδα WA. Τα Firmicutes (67,891%) και τα Bacteroidetes (27,809%) ήταν τα κυρίαρχα φυτά, ακολουθούμενα από τα Tenericutes (1,126%) στην ομάδα HA (Εικόνα 3Α). Σε επίπεδο γένους, τα Ruminococcaceae_UCG-005, Ruminococcaceae_UCG-014 και Christensenellaceae_R-7_group, που ανήκουν όλα στα Firmicutes, ήταν τα επικρατέστερα γένη στην ομάδα WJ. Οι Ruminococcaceae_UCG-005, Alistipes και η ομάδα [Eubacterium]_coprostanoligenes_ ήταν τα πιο κοινά γένη στην ομάδα HJ. Τα Ruminococcaceae_UCG-005, Ruminococcaceae_UCG-014 και Bacteroides ήταν τα πιο κοινά γένη στην ομάδα WA. Οι Ruminococcaceae_UCG-005, [Eubacterium]_coprostanoligenes_group και Alistipes ήταν τα πιο κοινά γένη στην ομάδα ΗΑ (Εικόνα 3Β).

Εικόνα 3. Μικροβιακή σύνθεση κοπράνων των WJ, HJ, WA και HA σε επίπεδο φυλής (Α) και γένους (Β) . Κάθε μπάρα αντιπροσωπεύει τη μέση σχετική αφθονία σε κάθε ομάδα.

Ο θερμικός χάρτης για την ομαδοποίηση της σχετικής αφθονίας ειδών σε επίπεδο γένους φαίνεται στο Σχήμα 4. Επιλέξαμε τα κορυφαία 20 taxa μετά την κανονικοποίηση (λογάριθμο) των δεδομένων OTU. Στη συνέχεια, σχεδιάστε το σχήμα με βάση το R heatmap. Κάθε μπλοκ χρώματος στον χάρτη θερμότητας αντιπροσωπεύει την αφθονία ενός γένους ενός δείγματος, με δείγματα τοποθετημένα οριζόντια και είδη κατακόρυφα. Η ομαδοποίηση του χάρτη θερμότητας δείχνει ότι υπάρχει μια ξεχωριστή συστάδα των νεαρών ζώων από τους HJ και WJ (Εικόνα 4Α), ενώ δεν υπάρχει διαχωρισμός στις άλλες τρεις συγκρίσεις (HA και WA, και HA και HJ, και WA και WJ) ( Σχήματα 4B–D).

Εικόνα 4. Ανάλυση Heatmap. (ΕΝΑ Δ)Τα 20 πιο άφθονα γένη μεταξύ των ομάδων HJ και WJ, και HA και WA, και HA και HJ, και WA και WJ. Οι αντίστοιχες τιμές του θερμικού χάρτη είναι οι τιμές Z που λαμβάνονται με την κανονικοποίηση της σχετικής αφθονίας των γενών σε κάθε σειρά. Η χρωματική διαβάθμιση από μπλε σε κόκκινο υποδηλώνει μια χαμηλή έως υψηλή σχετική αφθονία. Η κατακόρυφη ομαδοποίηση υποδηλώνει την ομοιότητα στον πλούτο διαφορετικών γενών μεταξύ διαφορετικών δειγμάτων. Όσο πιο κοντινή είναι η απόσταση μεταξύ δύο γενών, τόσο μικρότερο είναι το μήκος του κλάδου, υποδηλώνοντας μεγαλύτερη ομοιότητα στον πλούτο μεταξύ των δύο γενών. Η οριζόντια ομαδοποίηση υποδεικνύει την ομοιότητα του πλούτου των γενών σε διαφορετικά δείγματα. Ομοίως, όσο πιο κοντινή είναι η απόσταση μεταξύ δύο δειγμάτων, τόσο μικρότερο είναι το μήκος διακλάδωσης, υποδηλώνοντας μεγαλύτερη ομοιότητα στον πλούτο των γενών μεταξύ των δύο δειγμάτων.

Ανάλυση ποικιλότητας μικροβιακών κοινοτήτων σε ελάφια μόσχου σε διαφορετικές ομάδες

Ανάλυση άλφα ποικιλομορφίας

Υπολογίσαμε την ποικιλότητα άλφα (ACE, Chao1, Shannon και Simpson) για τη μικροχλωρίδα του εντέρου σε ενήλικα και νεαρά ελάφια μόσχου του δάσους στις περιοχές Weinan και Huailai (Εικόνα 5). Υπήρξε σημαντική διαφορά στους δείκτες ΜΕΑ μεταξύ της ομάδας WJ και HJ και σημαντική διαφορά στους δείκτες ACE και Chao1 μεταξύ της ομάδας WA και HA (P lt;0,05) (Εικόνες 5Α, Β), αλλά δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ τις ομάδες HA και HJ, ή WA και WJ (P gt; 0,05) (Εικόνες 5C,D).

Εικόνα 5. Δείκτες άλφα ποικιλομορφίας. (A–D) Σύγκριση των δεικτών άλφα ποικιλομορφίας της μικροχλωρίδας του εντέρου μεταξύ των ομάδων HJ και WJ, και HA και WA, και HA και HJ, και WA και WJ. ACE: ένας δείκτης που χρησιμοποιείται για την εκτίμηση του αριθμού των OTU σε μια κοινότητα. Είναι ένας από τους πιο συχνά χρησιμοποιούμενους δείκτες για την εκτίμηση των ειδών στην οικολογία. Chao: ένας δείκτης που χρησιμοποιεί τον αλγόριθμο Chao1 για να εκτιμήσει τον αριθμό των OTU που περιλαμβάνονται σε ένα δείγμα. Το Chao χρησιμοποιείται συνήθως στην οικολογία για την αξιολόγηση του συνολικού αριθμού των ειδών. Shannon: ένας δείκτης που χρησιμοποιείται συχνά για να αντικατοπτρίζει την άλφα ποικιλομορφία και να εκτιμά τη μικροβιακή ποικιλότητα σε ένα δείγμα. Simpson: ένας δείκτης ποικιλότητας που χρησιμοποιείται συνήθως στην οικολογία για να περιγράψει ποσοτικά τη βιοποικιλότητα μιας γεωγραφικής περιοχής. *αντιπροσωπεύει P lt;0,05.

Βήτα ανάλυση ποικιλομορφίας

Το PC1 έναντι του PC2 στο Σχήμα 6 δείχνει ότι τα δείγματα πιο κοντά μεταξύ τους στο γράφημα παρουσιάζουν μεγαλύτερη ομοιότητα. Η απόσταση μεταξύ των κουκκίδων με δύο χρώματα δείχνει την ομοιότητα στη δομή της βακτηριακής κοινότητας. Το διάγραμμα PCoA δείχνει την ανομοιότητα των μικροβιακών κοινοτήτων και αποκαλύπτει σαφώς διαφορετικές δομές μεταξύ των ομάδων HJ και WJ και HA και WA (Εικόνες 6Α, Β). Στην ίδια περιοχή, οι ενήλικες και οι νεαροί υποδεικνύουν παρόμοια δομή μεταξύ της ομάδας HJ και HA αλλά διαφορετική δομή μεταξύ της ομάδας WJ και WA (Εικόνες 6C,D).

Εικόνα 6. Διάγραμμα ανάλυσης κύριας συντεταγμένων (PCoA). (A–D) Διαφορές δειγμάτων μεταξύ των ομάδων HJ και WJ, και HA και WA, και HA και HJ, και WA και WJ. Οικόπεδο PCoA. Το PC1 έναντι του PC2 είναι το διάγραμμα PCoA που λαμβάνεται από την πρώτη και τη δεύτερη κύρια συντεταγμένη. ο άξονας x και ο άξονας y αντιπροσωπεύουν την πρώτη και τη δεύτερη κύρια συντεταγμένη, αντίστοιχα. Το ποσοστό των κύριων συντεταγμένων αντιπροσωπεύει τη σχετική συμβολή αυτής της συντεταγμένης στις διαφορές δειγμάτων, η οποία είναι ένα μέτρο της ποσότητας των αρχικών πληροφοριών που εξάγονται από αυτήν την κύρια συντεταγμένη. Οι αποστάσεις μεταξύ των σημείων του δείγματος αντιπροσωπεύουν την ομοιότητα της μικροχλωρίδας στα δείγματα. Μια πιο κοντινή απόσταση αντιπροσωπεύει μεγαλύτερη ομοιότητα και τα δείγματα που συγκεντρώνονται μαζί αποτελούνται από παρόμοια μικροχλωρίδα.

Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε ανάλυση ομοιοτήτων (ANOSIM) για να ελέγξουμε περαιτέρω τις διαφορές μεταξύ των ομάδων. Οι αποστάσεις μεταξύ και εντός της ομάδας βήτα φαίνονται σε ένα διάγραμμα πλαισίου (Εικόνα 7), με τα αποτελέσματα να δείχνουν πολύ σημαντικές διαφορές στις βακτηριακές κοινότητες μεταξύ των HJ και WJ (R = 1.000, P = 0.003 lt; 0.01) και HA και Ομάδες WA (R = 0,989, Ρ = 0,003 lt; 0,01) (Εικόνες 7Α, Β). Στην ίδια περιοχή, τα αποτελέσματα δεν δείχνουν σημαντικές διαφορές στις βακτηριακές κοινότητες μεταξύ των ομάδων HA και HJ (R = 0,159, P = 0,054 gt; 0,05) αλλά σημαντική διαφορά στις βακτηριακές κοινότητες μεταξύ της ομάδας WA και WJ (R = 0,437, P = 0,012 lt; 0,05) (Εικόνες 7C,D). Τα αποτελέσματα του ANOSIM ήταν σύμφωνα με το PCoA.

Εικόνα 7. Ανάλυση ANOSIM. (Α) Βήτα απόσταση των HJ και WJ. (Β) Βήτα απόσταση των HA και WA. (Γ) Απόσταση βήτα HA και HJ. (Δ) Βήτα απόσταση των WA και WJ. Ο άξονας x αντιπροσωπεύει την ομαδοποίηση και ο άξονας y αντιπροσωπεύει την απόσταση που υπολογίζεται από το Unweighted_unifrac. Τα δεδομένα στο πλαίσιο είναι η απόσταση μεταξύ των ομάδων και των ενδιάμεσων ομάδων, αντίστοιχα. Το εύρος του R είναι (−1, 1). Το R gt; 0 υποδηλώνει ότι η διαφορά μεταξύ των ομάδων είναι μεγαλύτερη από αυτή εντός των ομάδων και το R lt; 0 δείχνει ότι η διαφορά μεταξύ των ομάδων είναι μικρότερη από εκείνη εντός των ομάδων. Τιμή P: P lt; 0,05 υποδηλώνει υψηλή αξιοπιστία της δοκιμής.

Ανάλυση διαφορών στη μικροχλωρίδα του εντέρου σε διαφορετικές ομάδες

Οι αναλύσεις μεγέθους επίδρασης LDA (LEfSe) και η δοκιμή κατάταξης-αθροίσματος χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των συγκεκριμένων ειδών που εμφάνισαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων.

Πραγματοποιήθηκε ανάλυση μεγέθους γραμμικής διακριτικής ανάλυσης για να αποκαλύψει τη σημαντική κατάταξη των άφθονων ενοτήτων. Το κλαδόγραμμα (Εικόνα 8) εμφανίζει τα μικροβιακά είδη με σημαντικές διαφορές στα ενήλικα και νεαρά ελάφια μόσχου του δάσους στις περιοχές Weinan και Huailai μεταξύ διαφορετικών ομάδων. Τα αποτελέσματα έδειξαν 12 και 11 taxa με διαφορές στη σχετική αφθονία σε WJ και HJ, αντίστοιχα (Εικόνα 8Α), και 10 και 6 taxa με διαφορές σε WA και HA, αντίστοιχα (Εικόνα 8Β). Δύο ταξινομήσεις στο HA (Εικόνα 8C) και οκτώ και τρία είδη στο WJ και WA, αντίστοιχα (Εικόνα 8D), έδειξαν διαφορές στη σχετική αφθονία.

Εικόνα 8. Ανάλυση LEfSe (LDA effect size). (A–D) Τα είδη που παίζουν σημαντικό ρόλο μεταξύ των ομάδων HJ και WJ, και HA και WA, και HA και HJ, και WA και WJ. Ο κύκλος που εκπέμπεται από μέσα προς τα έξω απέδειξε την ταξινόμηση (από φυλή σε γένος). Κάθε μικρός κύκλος σε διαφορετική ταξινόμηση αντιπροσώπευε ένα taxa και η διάμετρος του κύκλου είναι ανάλογη με τη σχετική αφθονία. Τα είδη που δεν είχαν σημαντικές διαφορές χρωματίστηκαν με κίτρινο και οι βιοδείκτες χρωματίστηκαν από διαφορετικές ομάδες. Οι κόκκινες και οι πράσινες κουκκίδες αντιπροσωπεύουν τους βασικούς βακτηριακούς πληθυσμούς στην αντίστοιχη ομάδα.

Η δοκιμή αθροίσματος κατάταξης δείχνει τις διαφορές σχετικής αφθονίας σε επίπεδο γένους στις 20 κορυφαίες βακτηριακές κοινότητες στα δείγματα ελαφιού δασικού μόσχου από τις διαφορετικές ομάδες (Εικόνα 9). Οι σχετικές αφθονίες των Prevotella-1, Plesiomonas, Petrimonas, Nitrospira, Muribaculum, Methylobacterium, Mesotoga, Marmoricola, Macelibacteroides, Lentimicrobium, Lactobacillus, Lachnospiraceae_NK4A136_group, Helicobacter lt;J. Αντίθετα, η σχετική αφθονία των Phascolarctobacterium, Papillibacter, Intestinimonas και GCA-900066225 στο WJ ήταν σημαντικά χαμηλότερη από αυτή στο HJ (P lt;0,05). Και η σχετική αφθονία των Syner-01, Spirosoma, Sphingomonas, RB41, Prevotellaceae_UCG-003, Prevotellaceae_UCG-001, Prevotella_9, Prevotella_1, Petrimonas, Nitrospira, Muribaculum, Το Methylobacterium, Mesotoga, Macellibacteriides και Lenmicrobium στο WA ήταν σημαντικά υψηλότερο από αυτό στο HA (P lt;0,05). Αντίθετα, η σχετική αφθονία των Ruminococcaceae_UCG-010 στο WA ήταν σημαντικά χαμηλότερη από αυτή στο HA (P lt; 0,05) (Εικόνες 9Α, Β). Ωστόσο, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στη μικροβιακή αφθονία της εντερικής μικροχλωρίδας μεταξύ νεαρών και ενήλικων ελαφιών μόσχου στην ίδια περιοχή (Εικόνες 9C,D).

Εικόνα 9. Το τεστ κατάταξης. (A–D) Σχετική αφθονία (μέση % SD) 20 μεγάλων βακτηριακών φυλών μεταξύ των ομάδων HJ και WJ, και HA και WA, και HA και HJ, και WA και WJ. Ο άξονας x αντιπροσωπεύει είδη (διαφορές σχετικής αφθονίας στις 20 κορυφαίες βακτηριακές κοινότητες) και ο άξονας y αντιπροσωπεύει τη σχετική αφθονία. *αντιπροσωπεύει P lt;0,05.

Φυλογενετική διερεύνηση κοινοτήτων με ανακατασκευή ανάλυσης συναρτήσεων μη παρατηρημένων καταστάσεων

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα λειτουργικά γονίδια επιπέδου 2 22 και 5 KEGG έδειξαν σημαντικές διαφορές (P lt;0,05) μεταξύ WJ και HJ και WA και HA, αντίστοιχα (Εικόνα 10). Τα γονίδια διαφορικής λειτουργίας μεταξύ WJ και HJ συσχετίστηκαν κυρίως με «Μεταφορά μεμβράνης», «Μεταβολισμό συμπαραγόντων και βιταμινών», «Μετάφραση», «Μεταβολισμό ενέργειας», «Μεταβολισμό άλλων αμινοξέων», «Μεταβολισμό νουκλεοτιδίων», «Αντιγραφή και επιδιόρθωση», «Παγκόσμοι και επισκόπηση χάρτες», «Μεταβολισμός αμινοξέων» και «Βιοαποικοδόμηση και μεταβολισμός ξενοβιοτικών» (Εικόνα 10Α). Τα γονίδια διαφορικής λειτουργίας μεταξύ WA και HA συσχετίστηκαν κυρίως με το «Ανοσοποιητικό σύστημα», «Βιοαποικοδόμηση και μεταβολισμό ξενοβιοτικών» και «Περιβαλλοντική προσαρμογή» (Εικόνα 10Β).

Εικόνα 10. Φυλογενετική Διερεύνηση Κοινοτήτων με Ανάλυση Ανασυγκρότησης Μη Παρατηρημένων Καταστάσεων. (Α) Η αναλογία αφθονίας των διαφορετικών συναρτήσεων μεταξύ HJ και WJ. (Β) Η αναλογία αφθονίας των διαφορετικών συναρτήσεων μεταξύ HA και WA. Ανάλυση διακύμανσης των μεταβολικών οδών KEGG στο δεύτερο επίπεδο. Τα γραφήματα δείχνουν την αναλογία αφθονίας διαφορετικών συναρτήσεων σε δύο ομάδες δειγμάτων. Η μέση δείχνει τη διαφορά μεταξύ των αναλογιών της λειτουργικής αφθονίας στο διάστημα εμπιστοσύνης 95% και η τιμή στα δεξιά είναι η τιμή P. Το P lt;0,05 αντιπροσωπεύει τη σημαντική διαφορά.

Συζήτηση

Η ex situ διατήρηση είναι μια σημαντική τεχνική για την προστασία της σπάνιας και απειλούμενης άγριας ζωής που επιτρέπει την αποκατάσταση του πληθυσμού και την ταχεία επέκταση. Για να μειωθεί ο κίνδυνος δυσπροσαρμοστικών παραγόντων στα ζώα λόγω ex situ διατήρησης, η κατάσταση της υγείας τους θα πρέπει να παρακολουθείται συνεχώς. Η εντερική υγεία είναι ένας ζωτικός παράγοντας που ρυθμίζει την υγεία και η δυναμική ισορροπία μεταξύ των εντερικών μικροοργανισμών και του σώματος επηρεάζει την πέψη, την απορρόφηση των θρεπτικών συστατικών, το μεταβολισμό και την ανοσία (Nicholson et al., 2012; Ottman et al., 2012). Οι ανισορροπίες στην εντερική μικροχλωρίδα μπορεί να προκαλέσουν αρκετές σοβαρές ασθένειες και σοβαρή βλάβη στο σώμα (Wang et al., 2016; Houttu et al., 2020; Wu et al., 2021). Ο πληθυσμός των δασικών ελαφιών που μετανάστευσαν τεχνητά από το Shaanxi στην επαρχία Hebei το 2016 αυξήθηκε από περίπου 50–260 άτομα. Ωστόσο, Δεν ήταν σαφές εάν η μικροχλωρίδα του εντέρου είχε αλλάξει κατά τη διάρκεια της ex situ διαδικασίας διατήρησης. Κατά συνέπεια, ήταν απαραίτητο να παρακολουθούνται οι αλλαγές στη μικροχλωρίδα του εντέρου για να αξιολογηθεί η κατάσταση της υγείας τους μετά από ex situ διατήρηση και, από όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη έρευνα αυτού του είδους. Σε αυτή τη μελέτη, συλλέξαμε φρέσκα περιττώματα από ενήλικα και νεαρά ελάφια μόσχου δασών σε αιχμαλωσία στις περιοχές Weinan και Huailai και πραγματοποιήσαμε αλληλουχία του γονιδίου 16S-rRNA Illumina HiSeq για να συγκρίνουμε τη μικροχλωρίδα του πυρήνα του εντέρου μεταξύ των δύο πληθυσμών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ελάφι μόσχου εντερικής μικροχλωρίδας από το Weinan, Shaanxi εμφάνισε υψηλό πλούτο σε βακτήρια. Συγκριτικά, ο πλούτος των βακτηριακών ειδών που βρέθηκε στα έντερα του μόσχου ελαφιού από το Huailai του Hebei ήταν σημαντικά χαμηλότερος.

Η ισορροπία της μικροχλωρίδας του εντέρου επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες (De Filippo et al., 2010; Scott et al., 2013; Schnorr et al., 2014; Zhao et al., 2019; Li et al., 2020). Στη μελέτη μας, το ελάφι του δάσους μόσχου στην επαρχία Hebei προέρχεται από την επαρχία Shaanxi και ο χρόνος που πέρασε από την άφιξη του πρόσφατα μεταναστευμένου πληθυσμού δεν ήταν αρκετός για να περάσουν αρκετές γενιές και να συμβούν σημαντικές γενετικές αλλαγές. Με βάση αυτή την παρατήρηση, το γενετικό υπόβαθρο του πληθυσμού ex situ μπορεί να θεωρηθεί ότι παραμένει αμετάβλητο. Επιπλέον, κατά τη διαδικασία της ex situ διατήρησης, εξετάσαμε τις επιπτώσεις του περιβάλλοντος στον πληθυσμό των ελαφιών και το πιθανό άγχος που μπορεί να προκληθεί από την περιβαλλοντική μετεγκατάσταση. Από την άποψη αυτή, Στόχος μας ήταν να επιλέξουμε μια τοποθεσία παρόμοια με την άγρια ​​κατάσταση του μόσχου ελαφιού και παρόμοια με το περιβάλλον της αρχικής τοποθεσίας μετεγκατάστασης για αναπαραγωγή. Το είδος ελαφιού είναι θερμόαιμα με σταθερή εντερική θερμοκρασία, επομένως, οι επιδράσεις των γενετικών, των περιβαλλοντικών παραγόντων και της θερμοκρασίας στη δομή της μικροχλωρίδας του εντέρου αποκλείστηκαν από την εξέταση. Ωστόσο, μετά τη μετανάστευσή τους από το Shaanxi στην επαρχία Hebei, η διατροφή των ελαφιών δεν περιείχε πρόσθετα υλικά TCM λόγω των περιορισμένων τύπων TCM και της απρόσιτης πρόσβασης τους. Με άλλα λόγια, ο πληθυσμός Shaanxi είχε μια πιο πλούσια διατροφή ενώ ο πληθυσμός του Hebei δεν είχε ποικιλομορφία στη διατροφή του. Στη συνέχεια, ερευνήσαμε εάν αυτή η διατροφική διαφορά μπορεί να επηρέασε τη σύνθεση της μικροχλωρίδας του εντέρου και να επηρεάσει έμμεσα την κατάσταση της υγείας τους. Το είδος ελαφιού είναι θερμόαιμα με σταθερή εντερική θερμοκρασία, επομένως, οι επιδράσεις των γενετικών, των περιβαλλοντικών παραγόντων και της θερμοκρασίας στη δομή της μικροχλωρίδας του εντέρου αποκλείστηκαν από την εξέταση. Ωστόσο, μετά τη μετανάστευσή τους από το Shaanxi στην επαρχία Hebei, η διατροφή των ελαφιών δεν περιείχε πρόσθετα υλικά TCM λόγω των περιορισμένων τύπων TCM και της απρόσιτης πρόσβασης τους. Με άλλα λόγια, ο πληθυσμός Shaanxi είχε μια πιο πλούσια διατροφή ενώ ο πληθυσμός του Hebei δεν είχε ποικιλομορφία στη διατροφή του. Στη συνέχεια, ερευνήσαμε εάν αυτή η διατροφική διαφορά μπορεί να επηρέασε τη σύνθεση της μικροχλωρίδας του εντέρου και να επηρεάσει έμμεσα την κατάσταση της υγείας τους. Το είδος ελαφιού είναι θερμόαιμα με σταθερή εντερική θερμοκρασία, επομένως, οι επιδράσεις των γενετικών, των περιβαλλοντικών παραγόντων και της θερμοκρασίας στη δομή της μικροχλωρίδας του εντέρου αποκλείστηκαν από την εξέταση. Ωστόσο, μετά τη μετανάστευσή τους από το Shaanxi στην επαρχία Hebei, η διατροφή των ελαφιών δεν περιείχε πρόσθετα υλικά TCM λόγω των περιορισμένων τύπων TCM και της απρόσιτης πρόσβασης τους. Με άλλα λόγια, ο πληθυσμός Shaanxi είχε μια πιο πλούσια διατροφή ενώ ο πληθυσμός του Hebei δεν είχε ποικιλομορφία στη διατροφή του. Στη συνέχεια, ερευνήσαμε εάν αυτή η διατροφική διαφορά μπορεί να επηρέασε τη σύνθεση της μικροχλωρίδας του εντέρου και να επηρεάσει έμμεσα την κατάσταση της υγείας τους. μετά τη μετανάστευσή τους από το Shaanxi στην επαρχία Hebei, η διατροφή των ελαφιών δεν περιείχε πρόσθετα υλικά TCM λόγω των περιορισμένων τύπων TCM και της απρόσιτης πρόσβασης τους. Με άλλα λόγια, ο πληθυσμός Shaanxi είχε μια πιο πλούσια διατροφή ενώ ο πληθυσμός του Hebei δεν είχε ποικιλομορφία στη διατροφή του. Στη συνέχεια, ερευνήσαμε εάν αυτή η διατροφική διαφορά μπορεί να επηρέασε τη σύνθεση της μικροχλωρίδας του εντέρου και να επηρεάσει έμμεσα την κατάσταση της υγείας τους. μετά τη μετανάστευσή τους από το Shaanxi στην επαρχία Hebei, η διατροφή των ελαφιών δεν περιείχε πρόσθετα υλικά TCM λόγω των περιορισμένων τύπων TCM και της απρόσιτης πρόσβασης τους. Με άλλα λόγια, ο πληθυσμός Shaanxi είχε μια πιο πλούσια διατροφή ενώ ο πληθυσμός του Hebei δεν είχε ποικιλομορφία στη διατροφή του. Στη συνέχεια, ερευνήσαμε εάν αυτή η διατροφική διαφορά μπορεί να επηρέασε τη σύνθεση της μικροχλωρίδας του εντέρου και να επηρεάσει έμμεσα την κατάσταση της υγείας τους.

Η σχετική αφθονία φυλής έδειξε ότι τα Firmicutes και τα Bacteroidetes ήταν τα κυρίαρχα βακτήρια και στους δύο πληθυσμούς. Αυτό το εύρημα συνάδει με μελέτες σχετικά με τη μικροχλωρίδα του εντέρου μηρυκαστικών ζώων, όπως το ελάφι των Άλπεων, το ελάφι Sika και το ελάφι του Père David (Guan et al., 2017; Zhang et al., 2018; Sun et al., 2019; Jiang et al., 2021). Τα Firmicutes μπορούν να επεξεργάζονται σύνθετους υδατάνθρακες, παίζοντας σημαντικό ρόλο στην παραγωγή λιπαρών οξέων βραχείας αλυσίδας από διαιτητικούς υδατάνθρακες και στη διατήρηση της υγείας (Rahat-Rozenbloom et al., 2014· Sheridan et al., 2016). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα Firmicutes ήταν η κυρίαρχη μικροχλωρίδα σε επίπεδο φυλής σε κάθε πληθυσμό χωρίς σημαντική διαφορά πυκνότητας μεταξύ των ομάδων, υποδηλώνοντας ότι έπαιζε πανταχού σημαντικό ρόλο στην εξαγωγή ενέργειας από μη χωνεμένους υδατάνθρακες. Το Bacteroidetes ήταν επίσης σημαντικό γένος και ήταν σημαντικά πιο άφθονο (P lt; 0,05) στο HJ (26,927%) από το WJ (18,801%). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα Bacteroidetes βοηθούν στην πέψη των σύνθετων υδατανθράκων, στη ζύμωση της οργανικής ύλης (Spence et al., 2006) και στην αποικοδόμηση του αμύλου, της β-γλυκάνης, των αραβινοξυλάνων και των γλυκανών (Flint et al., 2012). Η αφθονία του αντανακλά την ικανότητα του σώματος να αποκτά μεταβολική ενέργεια από φυτικούς πολυσακχαρίτες (Wang et al., 2019). Μια άλλη σημαντική ομάδα που παρατηρήθηκε ήταν τα Tenericutes, τα οποία κατατάσσονταν υψηλότερα από τα Proteobacteria. Τα Tenericutes είναι μια μοναδική κατηγορία βακτηρίων που στερούνται κυτταρικού τοιχώματος και είναι τυπικά παράσιτα ή συντρίμμια ευκαρυωτικών ξενιστών, που βρίσκονται στη μικροχλωρίδα του εντέρου και των δύο χερσαίων (Szekely et al., 2010; Skennerton et al., 2016; Gao et al., 2019) και υδρόβια ζώα (Zhang et al., 2014, 2016; Fogarty et al., 2019). Μελέτες έχουν δείξει ότι τα βακτήρια της φυλής Tenericutes σχετίζονται με ασθένειες και αρκετές ασθένειες των καρκινοειδών (Ghadersohi and Owens, 1999· Wang et al., 2003· Chen et al., 2011). Ως εκ τούτου, θα πρέπει να δοθεί μεγαλύτερη προσοχή στην υψηλότερη σχετική αφθονία και λειτουργία των Tenericutes στα ελάφια μόσχου του δάσους.

Η ομαδοποίηση χαρτών θερμότητας έδειξε ότι σχηματίστηκαν σημαντικά διαφορετικές δομές μικροχλωρίδας του εντέρου μεταξύ του νεαρού ελαφιού μόσχου του δάσους στις δύο περιοχές. Αυτό δεν αποδείχθηκε στους ενήλικους πληθυσμούς μεταξύ των περιοχών, ούτε μεταξύ των ενηλίκων και των ανηλίκων της ίδιας περιοχής. Υποθέσαμε ότι αυτό το φαινόμενο συνέβη επειδή η δομή της μικροχλωρίδας του εντέρου επηρεάστηκε από περιεκτικούς παράγοντες. Στα νεαρά άτομα, η μικροχλωρίδα του εντέρου είναι πιθανό να επηρεάζεται περισσότερο από την πρόσληψη τροφής, και έτσι οι διαφορές στην ποικιλία των τροφίμων μεταξύ των δύο περιοχών οδήγησαν σε σημαντικές διαφορές στη μικροχλωρίδα του εντέρου του νεαρού ελαφιού. Καθώς τα ελάφια ωριμάζουν, τα γενετικά αποτελέσματα μπορεί να έχουν ισχυρότερη επιρροή, ωστόσο, καθώς τα ελάφια μόσχου του δάσους στο Weinan, Shaanxi και Huailai, Hebei έχουν το ίδιο γενετικό υπόβαθρο, δεν υπάρχει πλήρης διαχωρισμός μεταξύ των ατόμων WA και HA. Περαιτέρω, το πανομοιότυπο γενετικό υπόβαθρο, το περιβάλλον και η τροφή των ελαφιών μόσχου του δάσους στην ίδια γεωγραφική θέση έχουν ως αποτέλεσμα παρόμοια μικροβιακή χλωρίδα του εντέρου. Αυτά τα αποτελέσματα και οι παρατηρήσεις επαλήθευσαν επίσης τον σημαντικό ρόλο της τροφής στη διαμόρφωση της μικροχλωρίδας του εντέρου του ελαφιού δασικού μόσχου κατά τη διάρκεια της ex situ διατήρησης.

Τα αποτελέσματα της ανάλυσης άλφα ποικιλομορφίας αποκάλυψαν ότι ο πλούτος μικροβίων ήταν μεγαλύτερος στα ελάφια μόσχου δασών της περιοχής Weinan σε σύγκριση με την περιοχή Huailai, ωστόσο, τα ελάφια μόσχου δασών στις ίδιες περιοχές δεν εμφάνισαν σημαντικές διαφορές στους δείκτες άλφα, υποδεικνύοντας ότι αυτά τα άτομα είχαν συγκρίσιμο πλούτο και ποικιλομορφία μικροβίων του εντέρου. Επιπλέον, η σύγκριση της ποικιλομορφίας βήτα έδειξε σημαντικές διαφορές στις κοινότητες μικροχλωρίδας του εντέρου μεταξύ διαφορετικών περιοχών, ωστόσο, τα ελάφια στην ίδια περιοχή έτειναν να είναι παρόμοια. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν και πάλι ότι η μείωση της ποικιλίας τροφίμων μπορεί να έχει επηρεάσει τη μικροχλωρίδα του εντέρου του ελαφιού μόσχου του δάσους μετά από ex situ διατήρηση, με αποτέλεσμα σημαντική μείωση του πλούτου και σημαντικά διαφορετική δομή της μικροχλωρίδας του εντέρου στο τεχνητά μεταναστευμένο ελάφι δασικού μόσχου. Αυτό είναι παρόμοιο με προηγούμενες παρατηρήσεις που έδειξαν ότι τα άγρια ​​ζώα παρουσιάζουν μεγαλύτερο πλούτο στη μικροβιακή χλωρίδα του εντέρου από αυτά που βρίσκονται σε αιχμαλωσία, επειδή τα ζώα στη φύση μπορούν να αναζητούν τροφή ελεύθερα με πρόσβαση σε διάφορους τύπους και πηγές τροφίμων. Επιπλέον, οι άφθονες πηγές τροφίμων θα μπορούσαν να προάγουν τον αποικισμό υψηλότερης ποικιλομορφίας της μικροχλωρίδας του εντέρου (Passos et al., 2018; Chi et al., 2019; Jiang et al., 2020).

Η δοκιμή κατάταξης έδειξε ότι ο πλούτος της μη κυρίαρχης εντερικής μικροχλωρίδας μειώθηκε σημαντικά στα άτομα που μετανάστευσαν σε σύγκριση με εκείνα της περιοχής Shaanxi. Τα περισσότερα από αυτά τα μη κυρίαρχα εντερικά μικροχλωρίδια θεωρούνται ωφέλιμα βακτήρια που θα μπορούσαν να διευκολύνουν την πέψη και την απορρόφηση και να διατηρούν την υγεία του εντέρου, όπως Prevotella_1, Prevotellaceae_UGG-003, Prevotellaceae_UGG-001, Prevotella_1, Prevotella_1, Prevotellaceup9,30000, NK_3, 2004, 2011, 3,1,1,3,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,3,1,3,1,1,1,3,1,1,1,6,1,1,1,1,1,1 και Lapiraceae. Αυτά τα ωφέλιμα βακτήρια συμβάλλουν στη χρήση φυτικών υλικών αποικοδομώντας τις γλυκοπρωτεΐνες, προάγοντας την ανάπτυξη του ξενιστή και διευκολύνοντας την πέψη με την αποικοδόμηση της ημικυτταρίνης και της ξυλάνης. Συμμετέχουν επίσης στην πέψη υδατανθράκων και πρωτεϊνών (Rho et al., 2005; Biddle et al., 2013; Chen et al., 2017; Tian et al., 2021; Wang et al., 2022). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η μικροχλωρίδα του εντέρου του ελαφιού μόσχου του δάσους στην περιοχή μετανάστευσης είχε υψηλότερο πλούτο σε ωφέλιμα βακτήρια για την υγεία του εντέρου, την πέψη και την απορρόφηση σε σύγκριση με αυτά στο μεταναστευμένο ελάφι με μόσχο του δάσους. Αυτό περαιτέρω συμπεραίνει ότι η χαμηλότερη ποικιλία τροφίμων ήταν η αιτία της χαμηλότερης ποικιλότητας των μικροβίων του εντέρου.

Η φυλογενετική διερεύνηση κοινοτήτων με ανάλυση ανακατασκευής απαρατήρητων καταστάσεων έδειξε ότι η αφθονία των λειτουργικών γονιδίων για τις μεταβολικές οδούς πέψης και απορρόφησης των θρεπτικών ουσιών του εντέρου και η αποδόμηση επιβλαβών ουσιών μειώθηκε σημαντικά στα μεταναστευμένα ελάφια σε σύγκριση με εκείνα της περιοχής Shaanxi. Η εντερική μικροχλωρίδα είναι βασικό συστατικό της πέψης, διασπώντας σύνθετους υδατάνθρακες, πρωτεΐνες και ίνες (Oliphant και Allen-Vercoe, 2019) και σχετίζεται στενά με τις πεπτικές λειτουργίες του ξενιστή. Τα αποτελέσματα προσδιόρισαν ότι μετά την ex situ διατήρηση, η μειωμένη ποικιλομορφία των τροφίμων επηρέασε την πεπτική λειτουργία του ελαφιού δασικού μόσχου, το οποίο με τη σειρά του επηρέασε περαιτέρω την κατάσταση της υγείας. Ενόψει αυτού,

Μέχρι σήμερα, η εκτροφή ελαφιών δασικού μόσχου στην Κίνα έχει πραγματοποιηθεί κυρίως σε δύο περιοχές: την ορεινή περιοχή Qinling στη νότια επαρχία Shaanxi και τη δυτική ορεινή περιοχή στην επαρχία Sichuan. Αυτές οι δύο περιοχές αντιπροσωπεύουν το 90% του αιχμάλωτου πληθυσμού ελαφιών μόσχου στην Κίνα, εκ των οποίων η επαρχία Shaanxi περιλαμβάνει το 70%. Οι αρχικοί πόροι των δασικών ελαφιών μόσχου σε άλλες περιοχές της Κίνας έχουν σχεδόν εκλείψει εντελώς και πολύ λίγα από τα προγράμματα τεχνητής αναπαραγωγής ελαφιών δασικού μόσχου έχουν πραγματοποιηθεί σε μεγάλη κλίμακα. Ως εκ τούτου, για την ταχεία αποκατάσταση του πληθυσμού και της ιστορικής κατανομής των δασικών ελαφιών, η προώθηση της ex situ διατήρησής τους είναι μια πιθανή μελλοντική τάση. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι οι τοποθεσίες με μεταναστευτικά ή αιχμάλωτα ελάφια δασικού μόσχου θα πρέπει να επικεντρωθούν στην επίδραση των διατροφικών διαφορών, στις μεθόδους διατροφής, και τη συμπλήρωση τύπων ζωοτροφών για τη βελτίωση του πλούτου της εντερικής μικροχλωρίδας του ελαφιού για τη διασφάλιση της υγείας του εντέρου κατά την εκ των υστέρων αναπαραγωγή. Επιπλέον, δείξαμε ότι τα TCM μπορεί να έχουν καλές δυνατότητες ως συμπλήρωμα τροφής στη ζωική παραγωγή, καθώς μπορούν να βελτιώσουν την αφθονία της μικροχλωρίδας του εντέρου (ιδιαίτερα των ωφέλιμων βακτηρίων) και να ενισχύσουν την ικανότητα του εντέρου να αφομοιώνει και να απορροφά θρεπτικά συστατικά και να αποδομεί τις τοξίνες. Η τεχνητή προσθήκη TCM διασφαλίζει ότι η διατροφή των ελαφιών μόσχου σε αιχμαλωσία είναι παρόμοια με αυτή των άγριων ομολόγων τους, κάτι που είναι ιδιαίτερα σημαντικό κατά την εκ των υστέρων αναπαραγωγή. Ως εκ τούτου, θα πρέπει να διερευνηθεί η επίδραση των TCM στη λειτουργία της μικροχλωρίδας του εντέρου του ελαφιού δασικού μόσχου και η ανάπτυξη επαρκών πρόσθετων ζωοτροφών.

Δήλωση διαθεσιμότητας δεδομένων

Τα σύνολα δεδομένων που παρουσιάζονται σε αυτή τη μελέτη μπορούν να βρεθούν σε διαδικτυακά αποθετήρια. Τα ονόματα του αποθετηρίου/αποθετηρίων και οι αριθμοί πρόσβασης βρίσκονται παρακάτω: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

Δήλωση ηθικής

Η μελέτη σε ζώα επανεξετάστηκε και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας και Ευημερίας των Ζώων του Δασικού Πανεπιστημίου του Πεκίνου (Αρ. έγκρισης EAWC_BJFU_20200001).

Συνεισφορές συγγραφέα

YJ: εννοιολόγηση, επικύρωση, επίσημη ανάλυση και γραφή – πρωτότυπο προσχέδιο, αναθεώρηση και επιμέλεια. XH: εννοιολόγηση, επίσημη ανάλυση, λογισμικό και γραφή – αναθεώρηση και επεξεργασία. ML και NF: έρευνα και γραφή – αναθεώρηση και επεξεργασία. PY, HZ και CZ: έρευνα, λογισμικό και γραφή – αναθεώρηση και επεξεργασία. MS: επίσημη ανάλυση και γραφή – αναθεώρηση και επιμέλεια. ZH και RS: συλλογή δειγμάτων. SL: εννοιολόγηση, μεθοδολογία, επίβλεψη, συγγραφή – αναθεώρηση και επιμέλεια και διαχείριση έργου. DH: εννοιολόγηση και διαχείριση έργου. Όλοι οι συγγραφείς συνέβαλαν στο άρθρο και ενέκριναν την υποβληθείσα έκδοση.

Χρηματοδότηση

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από το πρόγραμμα εκπαίδευσης καινοτομίας και επιχειρηματικότητας των φοιτητών του Εθνικού Κολλεγίου: Σύστημα διάγνωσης και αξιολόγησης των φυσιολογικών και ανοσοποιητικών παραμέτρων της κατάστασης υγείας των ελαφιών σε αιχμαλωσία (Αριθ. επιχορήγησης X202110022211) και Μελέτη για την Παθογένεση και τον Τρόπο Σπάσιμο της Νόσου του Μάλλινα Forest Musk Deer (Grant No. 2021HXFWBH-LSQ-01).

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε το School of Ecology and Nature Conservation Innovation Laboratory, Beijing Forestry University για την παροχή πειραματικών υλικών.

Σύγκρουση συμφερόντων

Η ZH εργάστηκε από την Zhangzhou Pien Tze Huang Pharmaceutical Co., Ltd. Η RS απασχολήθηκε από την Huailai Zhiyangtianbao Technical Development Co., Ltd.

Οι υπόλοιποι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη απουσία εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.

Σημείωση εκδότη

Όλοι οι ισχυρισμοί που εκφράζονται σε αυτό το άρθρο είναι αποκλειστικά εκείνοι των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραιτήτως αυτούς των συνδεδεμένων οργανισμών τους ή του εκδότη, των εκδοτών και των κριτικών. Οποιοδήποτε προϊόν μπορεί να αξιολογηθεί σε αυτό το άρθρο ή ισχυρισμός που μπορεί να προβληθεί από τον κατασκευαστή του, δεν είναι εγγυημένο ή εγκεκριμένο από τον εκδότη.

Συμπληρωματικό υλικό

Το συμπληρωματικό υλικό για αυτό το άρθρο βρίσκεται στο διαδίκτυο στη διεύθυνση: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2022.969593/full#supplementary-material

Ελάφια μόσχου του δάσους, Μικροβίωση εντέρου, Τεχνητή αναπαραγωγή, ex situ, Τρόφιμα