Ανάλυση σε όλο το γονιδίωμα της οικογένειας γονιδίων CaHsp20 στο πιπέρι: ολοκληρωμένη ανάλυση αλληλουχίας και προφίλ έκφρασης υπό θερμική καταπόνηση
- 1 Department of Vegetable Science, College of Horticulture, Northwest Aamp;F University, Yangling, Κίνα
- 2 Laboratory for Solanaceous Fruit Vegetable, Institute of Vegetable Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing, Κίνα
Τα γονίδια Hsp20 υπάρχουν σε όλα τα είδη φυτών και παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανακούφιση του θερμικού στρες και στην ενίσχυση της θερμοανοχής των φυτών, αποτρέποντας τη μη αναστρέψιμη συσσώρευση μετουσιωτικών πρωτεϊνών. Ωστόσο, πολύ λίγα είναι γνωστά για την οικογένεια γονιδίων CaHsp20 στην πιπεριά (Capsicum annuum L.), μια σημαντική καλλιέργεια λαχανικών με χαρακτήρα εύκρατου αλλά θερμοευαίσθητου. Σε αυτή τη μελέτη, συνολικά 35 υποτιθέμενα γονίδια πιπεριού Hsp20 (CaHsp20s) ταυτοποιήθηκαν και μετονομάστηκαν με βάση το μοριακό τους βάρος και στη συνέχεια αναλύθηκαν η γονιδιακή δομή, η θέση του γονιδιώματος, ο διπλασιασμός γονιδίων, η φυλογενετική σχέση και το δίκτυο αλληλεπίδρασης. Τα πρότυπα έκφρασης των γονιδίων CaHsp20 σε τέσσερις διαφορετικούς ιστούς (ρίζα, στέλεχος, φύλλο και άνθος) από τη θερμοανεκτική γραμμή R9 υπό συνθήκες θερμικής καταπόνησης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ημι-ποσοτική RT-PCR. Οι μεταγραφές των περισσότερων γονιδίων CaHsp20 διατήρησαν χαμηλό επίπεδο και στους τέσσερις ιστούς υπό κανονικές συνθήκες θερμοκρασίας, αλλά προκλήθηκαν σε μεγάλο βαθμό από το θερμικό στρες, ενώ η έκφραση των CaHsp16.6b, 16.7 και 23.8 ανιχνεύθηκε μόνο σε συγκεκριμένους ιστούς και δεν εντοπίστηκε τόσο ευαίσθητο στο θερμικό στρες όπως άλλα γονίδια CaHsp20. Επιπλέον, σε σύγκριση με εκείνα της θερμοανεκτικής σειράς R9, η κορυφή έκφρασης των περισσότερων γονιδίων CaHsp20 στη θερμοευαίσθητη γραμμή Β6 υπό θερμική καταπόνηση ήταν υστερητική και αρκετά γονίδια CaHsp20 (CaHsp16.4, 18.2a, 18.7, 21.2, 22.0, 225.8, και ) έδειξε υψηλότερα επίπεδα έκφρασης και στις δύο γραμμές Β6 και R9. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι τα γονίδια CaHsp20 μπορεί να εμπλέκονται στο θερμικό στρες και στις αμυντικές αποκρίσεις στο πιπέρι, γεγονός που παρέχει τη βάση για περαιτέρω λειτουργικές αναλύσεις του CaHsp20 στον σχηματισμό θερμοανεκτικότητας που αποκτάται από το πιπέρι.
Εισαγωγή
Ως άμισχοι οργανισμοί, τα φυτά δεν μπορούν να ξεφύγουν από τις ακραίες συνθήκες περιβάλλοντος, συμπεριλαμβανομένων των βιοτικών και αβιοτικών στρες, όπως παράσιτα και παθογόνα, ξηρασία, αλατότητα, κρύο, ζέστη και καταπονήσεις βαρέων μετάλλων (Wang et al., 2003; Mittler, 2006; Mittler et al., 2012). Η αύξηση της υπερθέρμανσης του πλανήτη με δυσμενείς επιπτώσεις του θερμικού στρες (HS) στην ανάπτυξη, ανάπτυξη και παραγωγικότητα των φυτών είναι πιο σοβαρή, επομένως η προσαρμοστική απόκριση των φυτών στις υψηλές θερμοκρασίες, π.χ., η υπερευαισθησία (HSR) είναι πολύ σημαντική για την παγκόσμια επισιτιστική ασφάλεια (Glazebrook, 2001, Giorno et al., 2010). Υπό συνθήκες HS, οι παράγοντες μεταγραφής θερμικού σοκ (Hsfs) συνδέονται με τα στοιχεία θερμικού σοκ (HSEs) των προαγωγέων των γονιδίων που αποκρίνονται στη θερμότητα, κυρίως των πρωτεϊνών θερμικού σοκ (Hsps), για να ενεργοποιήσουν ή να ρυθμίσουν την έκφρασή τους (Scharf et al. ., 2012· Waters, 2013).
Τα φυτά Hsps ομαδοποιούνται σε πέντε οικογένειες με βάση το μοριακό βάρος και την ομολογία αλληλουχίας, συμπεριλαμβανομένων των Hsp100s, Hsp90s, Hsp70s, Hsp60s και Hsp20s (Sarkar et al., 2009· Waters, 2013). Μεταξύ και των πέντε διατηρημένων οικογενειών, οι Hsp20s, μια ομάδα μικρών πρωτεϊνών θερμικού σοκ (sHsps) με μοριακό μέγεθος που κυμαίνεται από 15 έως 42 kDa, είναι η πιο διαδεδομένη και άφθονη οικογένεια που προκαλείται από το HS σε πολλά ανώτερα φυτά. Επιπλέον, μπορούν να λειτουργήσουν ως μοριακός συνοδός χωρίς ATP για να διατηρήσουν τη σταθερότητα των πρωτεϊνών, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα Hsp20s μπορεί να διαδραματίσουν ζωτικό ρόλο κατά τον σχηματισμό της θερμοανοχής που αποκτάται από τα φυτά (Vierling, 1991; Sun et al., 2002; Wang et al., 2004· Waters, 2013· Haslbeck and Vierling, 2015).
Τα Hsp20s μοιράζονται μια συντηρημένη αρθρωτή δομή και το πιο εντυπωσιακό χαρακτηριστικό είναι μια διατηρημένη περιοχή άλφα-κρυσταλλίνης (ACD, η περιοχή Hsp20) που περιέχει ~ 90 αμινοξέα πλαισιωμένα από μια μεταβλητή Ν-τερματική περιοχή και μια C-τερματική επέκταση (Vierling, 1991 Scharf et al., 2001; Waters, 2013), όπου το ACD εμπλέκεται σε αλληλεπιδράσεις υποστρώματος, το Ν-άκρο είναι υπεύθυνο για τη δέσμευση του υποστρώματος και το C-άκρο συμμετέχει στον ομο-ολιγομερισμό και στο σχηματισμό κοκκίων HS (Kirschner et al., 2000· Giese and Vierling, 2004· Basha et al., 2006· Jaya et al., 2009). Το ACD αποτελείται από δύο αντιπαράλληλα φύλλα τεσσάρων και τριών β-κλώνων, δηλαδή, διατηρημένες περιοχές I (CRI, β2-β3-β4-β5) στο Ν-τερματικό συναίνεση και CRII (β7-β8-β9) στο C -τερματική συναίνεση, αντίστοιχα, συνδεδεμένη με βρόχο υδρόφοβης περιοχής (β6-βρόχος; Bondino et al., 2012; Haslbeck και Vierling, 2015). Επιπλέον, το Ν-άκρο περιέχει τις αλληλουχίες διέλευσης, στόχευσης ή σήματος και το Ο-τελικό μπορεί επίσης να περιέχει μοτίβα αμινοξέων κατακράτησης ειδικά για τα οργανίδια (Waters, 2013).
Τα Hsp20 αποτελούν μια πιο ποικιλόμορφη οικογένεια από άλλες τέσσερις οικογένειες Hsp στα φυτά και είναι επίσης πολύ περισσότερα από τα μέλη των οικογενειών Hsp20 στα ζώα (Wang et al., 2004· Waters, 2013). Τα φυτά Hsp20 κωδικοποιούνται από πυρηνικά γονίδια και χωρίζονται σε διάφορες υποοικογένειες με βάση την κυτταρική θέση, την ομολογία αλληλουχίας και τη λειτουργία (Vierling, 1991· Waters et al., 1996). Δεκαεννέα γονίδια Hsp20 στο Arabidopsis (Scharf et al., 2001· Waters, 2013), 23 στο Oryza sativa, 36 στο Populus trichocarpa (Waters et al., 2008) και 51 στο Glycine max ταυτοποιήθηκαν, επιπλέον, τα γονίδια Hsp20, Τα Arabidopsis ομαδοποιήθηκαν σε 11 υποοικογένειες (Scharf et al., 2001; Waters, 2013), ενώ αυτές από το G. max ομαδοποιήθηκαν σε 15 υποοικογένειες με βάση τη φυλογενετική ανάλυση, την πρόβλεψη του υποκυτταρικού εντοπισμού και την πρόβλεψη μοντέλων δευτερογενούς δομής πρωτεΐνης (Lopes-Caitar et al., 2013). Ωστόσο, από ό,τι γνωρίζουμε, η ανάλυση της οικογένειας Hsp20 στο πιπέρι σε επίπεδο γονιδιώματος εξακολουθεί να λείπει.
Η πιπεριά (Capsicum annuum L.) είναι μια σημαντική καλλιέργεια λαχανικών παγκοσμίως και αγαπιέται βαθιά από έναν μεγάλο πληθυσμό λόγω του κύριου συστατικού της στις κουζίνες, των απαραίτητων βιταμινών και άλλων υγιεινών θρεπτικών συστατικών (Kim et al., 2014). Ωστόσο, το πιπέρι είναι ευαίσθητο στην υψηλή θερμοκρασία, ειδικά στο αναπαραγωγικό στάδιο (Guo et al., 2014). Μόλις πάσχετε από συνεχές HS, η επικονίαση και η λίπανση της πιπεριάς θα υποστεί σοβαρή βλάβη, γεγονός που μπορεί να μειώσει σημαντικά την απόδοση και την ποιότητα των καρπών της πιπεριάς. Επομένως, η μελέτη των Hsp20s είναι σημαντική για την κατανόηση του μηχανισμού της θερμικής απόκρισης στο πιπέρι, ενώ εκτός από αρκετά γονίδια CaHsp20, όπως τα CaHsp24 (Zhu et al., 2011), CaHsp26 (Guo et al., 2007), λίγα είναι επί του παρόντος γνωστά για την οικογένεια της πρωτεΐνης θερμικού σοκ C. annuum 20 (CaHsp20).
Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίζουμε και αναλύουμε 35 γονίδια CaHsp20 από το γονιδίωμα της πιπεριάς, εστιάζοντας στην έκφρασή τους που προκαλείται από τη θερμότητα σε διάφορους ιστούς και στα μοτίβα δυναμικής έκφρασής τους σε δύο διαφορετικές θερμοανεκτικές γραμμές πιπεριού υπό συνθήκες HS. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν τη βάση για περαιτέρω λειτουργική ανάλυση των μελών CaHsp20 και θα είναι πολύτιμα για τον φωτισμό του μηχανισμού της θερμοανοχής που αποκτάται από το πιπέρι, ακόμη και της προσαρμοστικότητας του πιπεριού σε άλλες συνθήκες στρες.
Υλικά και μέθοδοι
Ταυτοποίηση γονιδίων CaHsp20 στο πιπέρι σε όλο το γονιδίωμα
Οι πρωτεΐνες Hsp20 ορίζονται από την κατοχή ενός εξαιρετικά διατηρημένου υπολείμματος αμινοξέων 80-100 που ονομάζονται ACD και χαμηλού μοριακού βάρους (15-42 kDa, Vierling, 1991, Scharf et al., 2001). Για τον εντοπισμό των μελών της οικογένειας Hsp20 στο πιπέρι, το προφίλ Hidden Markov Model (HMM) ACD (PF00011) που λήφθηκε από τη βάση δεδομένων της οικογένειας πρωτεϊνών Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk) χρησιμοποιήθηκε ως ερωτήματα για την αναζήτηση του Pepper Βάση δεδομένων γονιδιώματος (PGD, http://peppergenome.snu.ac.kr/, CM334, Zunla-1 and glabriusculum genomes; Kim et al., 2014; Qin et al., 2014). Δεύτερον, όλες οι αλληλουχίες πρωτεΐνης O. sativa και G. max Hsp20 (Ouyang et al., 2009; Lopes-Caitar et al., 2013) χρησιμοποιήθηκαν ως αλληλουχίες ερωτημάτων για την αναζήτηση με βάση τη βάση δεδομένων PGD και NCBI. Όλα τα υποτιθέμενα γονίδια Hsp20 πιπεριού εξόδου με τιμή e-τιμής ≤0,001 συγκεντρώθηκαν για την αφαίρεση του πλεονασμού, και στη συνέχεια υποβλήθηκε στην Pfam και στη SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) για να επιβεβαιώσει την παρουσία του τομέα ACD. Η Ευθυγράμμιση Πολλαπλής Αλληλουχίας (MSA) στη συνέχεια περικόπηκε προκειμένου να αφαιρεθούν οι υποακολουθίες που δεν ήταν πραγματικά ομόλογες. Τα προβλεπόμενα γονίδια που στερούνται πεδίου ACD και/ή τα γονίδια των οποίων το μοριακό βάρος ήταν εκτός του εύρους από 15 έως 42 kDa απορρίφθηκαν. Όλα τα μη περιττά και σίγουρα γονίδια εκχωρήθηκαν ως γονίδια Hsp20 πιπεριού (CaHsp20s) και σχολιάστηκαν με βάση το μοριακό τους βάρος όπως με τη σόγια (Lopes-Caitar et al., 2013). Το λογικό διάγραμμα ροής της ταυτοποίησης των γονιδίων πιπεριού Hsp20 φαίνεται στο Σχήμα S1. Τα προβλεπόμενα γονίδια που στερούνται πεδίου ACD και/ή τα γονίδια των οποίων το μοριακό βάρος ήταν εκτός του εύρους από 15 έως 42 kDa απορρίφθηκαν. Όλα τα μη περιττά και σίγουρα γονίδια εκχωρήθηκαν ως γονίδια Hsp20 πιπεριού (CaHsp20s) και σχολιάστηκαν με βάση το μοριακό τους βάρος όπως με τη σόγια (Lopes-Caitar et al., 2013). Το λογικό διάγραμμα ροής της ταυτοποίησης των γονιδίων πιπεριού Hsp20 φαίνεται στο Σχήμα S1. Τα προβλεπόμενα γονίδια που στερούνται πεδίου ACD και/ή τα γονίδια των οποίων το μοριακό βάρος ήταν εκτός του εύρους από 15 έως 42 kDa απορρίφθηκαν. Όλα τα μη περιττά και σίγουρα γονίδια εκχωρήθηκαν ως γονίδια Hsp20 πιπεριού (CaHsp20s) και σχολιάστηκαν με βάση το μοριακό τους βάρος όπως με τη σόγια (Lopes-Caitar et al., 2013). Το λογικό διάγραμμα ροής της ταυτοποίησης των γονιδίων πιπεριού Hsp20 φαίνεται στο Σχήμα S1.
Χρησιμοποιώντας την ίδια μέθοδο, τα υποτιθέμενα ομόλογα Hsp20 σε ντομάτα, Arabidopsis, ρύζι και αραβόσιτο ελήφθησαν από τη βάση δεδομένων SOL Genomics Network (SGN) (http://solgenomics.net/organism/Solanum_lycopersicum/genome), τη βάση δεδομένων TAIR (https ://www.arabidopsis.org/index.jsp), το Rice Genome Annotation Project (http://rice.plantbiology.msu.edu/) και τη βάση δεδομένων TIGR Maize (http://maize.jcvi.org/ ), αντίστοιχα.
Οι πρωτεϊνικές αλληλουχίες των υποτιθέμενων μελών CaHsp20 αναλύθηκαν με EXPASY PROTOPARAM (http://www.expasy.org/tools/protparam.html) για να ληφθεί ο αριθμός αμινοξέων, το μοριακό βάρος, το θεωρητικό ισοηλεκτρικό σημείο (pI) και ο δείκτης αστάθειας ( με τιμή gt;40 που θεωρείται ασταθής· Lopes-Caitar et al., 2013). Τα δεδομένα χρωμοσωμικής θέσης και οι αριθμοί εσωνίων των υποτιθέμενων CaHsp20s ανακτήθηκαν από την PGD. Το πρόγραμμα WoLF PSORT (http://wolfpsort.org/) και το TargetP (Emanuelsson et al., 2000) χρησιμοποιήθηκαν για την πρόβλεψη των υποκυτταρικών θέσεων.
Ανάλυση Συντηρημένων Μοτίβων Οικογένειας Πιπεριών CaHsp20
Οι διατηρημένες περιοχές των πρωτεϊνών CaHsp20 (ACD) επιβεβαιώθηκαν από το Pfam και το SMART. Το πρόγραμμα MEME (έκδοση 4.10.0, http://meme.nbcr.net/meme/tools/meme) χρησιμοποιήθηκε για την αναγνώριση των συντηρημένων μοτίβων, με τις ακόλουθες παραμέτρους: αριθμός επαναλήψεων-οποιαδήποτε, μέγιστος αριθμός μοτίβων- 10, τα βέλτιστα πλάτη μοτίβων ορίζονται από 6 έως 200 υπολείμματα αμινοξέων. τα διατηρημένα μοτίβα σχολιάστηκαν με το InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search; Ouyang et al., 2009). Οι αλληλουχίες ACD όλων των μελών CaHsp20 ευθυγραμμίστηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα δομικής ευθυγράμμισης Promals3D (http://prodata.swmed.edu/promals3d/promals3d.php).
Φυλογενετική Ανάλυση και Ταξινόμηση Γονιδίων Πιπεριού CaHsp20
Οι πλήρεις αλληλουχίες αμινοξέων των μελών Hsp20 από πιπεριά, ντομάτα, Arabidopsis, ρύζι και αραβόσιτο ευθυγραμμίστηκαν με το πρόγραμμα CLUSTALW. Τα αναγνωριστικά γονιδίων των μελών Hsp20 από ντομάτα, Arabidopsis, ρύζι και αραβόσιτο φαίνονται στον Πίνακα S1. Ένα μη ριζωμένο φυλογενετικό δέντρο που ενώνει γείτονες κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό MEGA 5.10 (Tamura et al., 2011) με τη δοκιμή εκκίνησης να επαναλαμβάνεται 1000 φορές, με διαγραφή ζευγών και ένα μοντέλο Poisson. Τα γονίδια CaHsp20 της πιπεριάς κατανεμήθηκαν σε διαφορετικές ομάδες με βάση την ευθυγράμμιση πολλαπλών αλληλουχιών και την ταξινόμηση των γονιδίων Hsp20 στα άλλα τέσσερα είδη.
Χρωμοσωμικός εντοπισμός και γονιδιακός διπλασιασμός
Καθένα από τα γονίδια CaHsp20 χαρτογραφήθηκε σε χρωμοσώματα χρησιμοποιώντας MapDraw (Liu and Meng, 2003) με βάση τη χρωμοσωμική τους θέση και τη σχετική απόσταση μεταξύ αυτών των γονιδίων στο ίδιο χρωμόσωμα που προέρχεται από την PGD. Ο διπλασιασμός του γονιδίου CaHsp20 ορίστηκε με βάση τα ακόλουθα κριτήρια: (1) το μήκος της ευθυγράμμισης της αλληλουχίας που κάλυπτε ≥70% του μακρύτερου γονιδίου. και (2) η ομοιότητα των ευθυγραμμισμένων περιοχών γονιδίου ≥70% (Gu et al., 2002; Yang et al., 2008). Τα γονίδια που διαχωρίζονται από πέντε ή λιγότερα γονίδια σε μια περιοχή 100 kb θεωρήθηκαν ως διπλά διπλά (Wang et al., 2010). Τα γονίδια θεωρήθηκαν ως τμηματικός διπλασιασμός εάν βρέθηκε ότι είναι ομοπαράλογοι που βρίσκονται σε διπλά χρωμοσωμικά μπλοκ, όπως προτείνεται από τους Wei et al. (2007).
Πρόβλεψη δικτύου αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης CaHsp20s
Κατασκευάστηκε ένα δίκτυο αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών CaHsp20 από πιπέρι για την κατανόηση του δικτύου ρύθμισης σε όλο το γονιδίωμα. το interolog από το Arabidopsis χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη του δικτύου αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης των μελών CaHsp20. Κατασκευάστηκε ένα έργο αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών Arabidopsis Hsp20 χρησιμοποιώντας το Arabidopsis Interactions Viewer (http://bar.utoronto.ca/interactions/cgi-bin/arabidopsis_interactions_viewer.cgi). Οι πρωτεΐνες Arabidopsis Hsp20 χαρτογραφήθηκαν σε πρωτεΐνες CaHsp20 πιπεριού με βάση την ομόλογη σχέση τους και ένα δίκτυο αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών CaHsp20 σχεδιάστηκε από το Cytoscape_v2.8.3 (Εθνικό Ινστιτούτο Γενικών Ιατρικών Επιστημών, MD, ΗΠΑ).
Φυτικά Υλικά και Θεραπείες Θερμικού Στρες
Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν η θερμοανεκτική γραμμή πιπεριού R9 και η θερμοευαίσθητη γραμμή Β6. Και οι δύο σειρές αναπτύχθηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης στους 26°C (ημέρα για 16 ώρες)/20°C (νύχτα για 8 ώρες) μέχρι να φτάσουν στην ηλικία των 6-8 αληθινών φύλλων. Τα φυτά R9 χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση έκφρασης ειδικής ιστού, τα σπορόφυτα με 6-8 αληθινά φύλλα και τα φυτά με μπουμπούκια ανθέων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με HS 40°C για 2 ώρες τοποθετώντας σε ένα ελαφρύ επωαστήρα (GXZ-380C, Jiangnan Instrument Factory , Ningbo, Κίνα) και άλλοι κάτω από 26°C για 2 ώρες χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Συλλέχθηκαν τα νεαρά φύλλα, οι μίσχοι και οι ρίζες από σπορόφυτα και τα μπουμπούκια ανθέων από ενήλικα φυτά με ή χωρίς θεραπείες HS. Για τη δυναμική ανάλυση έκφρασης των CaHsp20s υπό HS, αφού υποβλήθηκαν σε 40°C για 0, 0,5, 1, 2, 4 ώρες, συλλέχθηκαν τα φύλλα στο B6 και R9, αντίστοιχα. Η επεξεργασία θερμοκρασίας ξεκίνησε κατά τη διάρκεια της περιόδου φωτός και όλα τα δείγματα συλλέχθηκαν εντός της περιόδου φωτός. Αυτά τα δείγματα που συλλέχθηκαν καταψύχθηκαν με υγρό άζωτο για εκχύλιση ολικού RNA και σύνθεση cDNA. Κάθε επεξεργασία διεξήχθη με τρία βιολογικά αντίγραφα και συλλέχθηκαν δείγματα από πέντε φυτά για κάθε αντίγραφο.
RNA Απομόνωση και Ανάλυση Έκφρασης Γονιδίων CaHsp20 πιπεριού
Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας κιτ Ολικού RNA (BioTeke, Πεκίνο, Κίνα) και αντιστρόφως μεταγράφηκε χρησιμοποιώντας Αντίστροφη Μεταγραφάση SuperScriptIII (Takara, Dalian, Κίνα), η λειτουργική διαδικασία ακολούθησε τη διαδικασία του κατασκευαστή και το cDNA αραιώθηκε στα 50 ng/μL με ddH2O για περαιτέρω εξέταση. Για ανάλυση έκφρασης CaHsp20s πιπεριού σε διαφορετικούς ιστούς, χρησιμοποιήθηκαν αντιδράσεις PCR ημι-ποσοτικής αντίστροφης μεταγραφής (RT). Τα ζεύγη εκκινητών (Πίνακας S2) σχεδιάστηκαν από την Primer Premier 5.0 και δοκιμάστηκαν από την NCBI Primer BLAST. Ως γονίδια αναφοράς χρησιμοποιήθηκε το γονίδιο πρωτεΐνης που δεσμεύει την ουβικιτίνη CaUBI-3 (Wan et al., 2011). Οι αντιδράσεις PCR για όλα τα γονίδια διεξήχθησαν με το ακόλουθο πρόγραμμα: αρχική μετουσίωση στους 94°C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από μετουσίωση στους 94°C για 30 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 52°C για 30 δευτερόλεπτα, επέκταση στους 72°C για 30 δευτερόλεπτα με 30 κύκλους, και τελική επέκταση στους 72°C για 10 λεπτά. Τα προϊόντα PCR ανιχνεύθηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης με συγκέντρωση πηκτής 1,5%. Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων CaHsp20 σε κάθε δείγμα συγκρίθηκαν με το γονίδιο εσωτερικού ελέγχου, CaUBI-3.
Πραγματοποιήθηκε ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο (qRT-PCR) χρησιμοποιώντας SYBR Green Supermix (Takara, Dalian, Κίνα) με συνολικό όγκο συστήματος αντίδρασης 20 μL στον θερμοκυκλωτή iQ5.0 Bio-Rad iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA , ΗΠΑ). Οι εκκινητές των γονιδίων CaHsp20 ήταν οι ίδιοι με αυτούς που χρησιμοποιήθηκαν για την ημιποσοτική RT-PCR. Οι αντιδράσεις qRT-PCR πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται (Guo et al., 2014). Το γονίδιο CaUBI-3 χρησιμοποιήθηκε ως το εσωτερικό γονίδιο αναφοράς. Πραγματοποιήθηκαν τρία ανεξάρτητα βιολογικά αντίγραφα και η qRT-PCR για κάθε αντίγραφο εκτελέστηκε εις τριπλούν. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των γονιδίων Hsp20 της πιπεριάς υπολογίστηκαν ως μέθοδος 2 -ΔΔCT (Schmittgen and Livak, 2008).
Αναζητήστε στοιχεία που δρουν cis στους υποκινητές των γονιδίων CaHsp20 του πιπεριού
Οι ανοδικές περιοχές (0,5 kb) των γονιδίων CaHsp20 προήλθαν από PGD και αναζητήθηκαν για ρυθμιστικά στοιχεία, συμπεριλαμβανομένων των HSEs (στοιχείο που ενεργεί με cis που εμπλέκεται στην απόκριση στο θερμικό στρες), TATA-box (στοιχείο προαγωγέα πυρήνα περίπου -30 από την έναρξη της μεταγραφής ), πλούσιες σε TC επαναλήψεις (στοιχείο που δρά σε cis εμπλέκεται στην άμυνα και απόκριση στο στρες), W-box (θέση δέσμευσης για τον μεταγραφικό παράγοντα WRKY στην αμυντική απόκριση) και αλληλουχίες CCAAT (παράγοντες πρωτεΐνης που δεσμεύουν ενισχυτή) στους προαγωγείς στο PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/; Lescot et al., 2002) και στη βάση δεδομένων PLACE (Higo et al., 1999).
Αποτελέσματα
Ταυτοποίηση και ανάλυση μελών οικογένειας γονιδίου CaHsp20 στο Pepper
Συνολικά 41 αλληλουχίες του γονιδίου Hsp20 ελήφθησαν από την PGD με ανάλυση HMM, από τις οποίες οι 35 σχολιάστηκαν ως γονίδια πιπεριού Hsp20 με βάση την επιβεβαίωση των σαρώσεων Pfam και SMART, και αλληλουχίες χωρίς πλήρη τομέα (CA09g15370, CA12g1594030, ) και αλληλουχίες των οποίων το μοριακό βάρος εκτός του εύρους των Hsp20s (CA08g09970, CA04g23450 και CA00g46140) αφαιρέθηκαν. Τα 35 γονίδια CaHsp20 ονομάστηκαν σύμφωνα με το μοριακό τους βάρος (Πίνακας 1).
Πίνακας 1. Ο κατάλογος των μελών CaHsp20 που εντοπίστηκαν .
Το μήκος των πρωτεϊνών CaHsp20 κυμαινόταν από 141 (CaHsp16.4) έως 313 αμινοξέα (CaHsp35.5) και τα προβλεπόμενα μοριακά βάρη των CaHsp20s ήταν μεταξύ 16.33 kDa (CaHsp16.3) και 35.53 kDa35.C. Τα CaHsp20s μοιράζονταν ένα διατηρημένο ACD αποτελούμενο από περίπου 90 αμινοξέα, στα οποία το CaHsp24.3b κατείχε το συντομότερο ACD με 74 αμινοξέα, ενώ το ACD του CaHsp16.3 (116 αμινοξέα) ήταν το μακρύτερο. Οι προβλεπόμενες τιμές pI των πρωτεϊνών CaHsp20 κυμαίνονταν από 5,07 (CaHsp18,4a) έως 9,52 (CaHsp26,5) και οι προβλεπόμενοι δείκτες αστάθειας έδειξαν ότι μόνο εννέα από τις 35 CaHsp20 ήταν σταθερές πρωτεΐνες (δείκτης αστάθειας =40). Επιπλέον, βρέθηκε επίσης ότι 16 (45,71%) από τα συνολικά 35 γονίδια CaHsp20 δεν είχαν εσώνια, 18 γονίδια (51,43%) είχαν ένα μόνο εσώνιο, ενώ μόνο το CaHsp27,6 είχε πέντε εσώνια.
Χαρακτηρισμός των Συναγόμενων Αλληλουχιών Αμινοξέων του CaHsp20s
Δέκα συναινετικά μοτίβα βρέθηκαν σε πρωτεΐνες CaHsp20 από το εργαλείο αναζήτησης μοτίβων MEME (Εικόνα 1, Πίνακας 2). Με βάση την ανάλυση των Pfam, SMART και InterProScan, οι πλήρεις αλληλουχίες των μοτίβων 1, 2, 3 και 4 σχημάτισαν το εξαιρετικά διατηρημένο ACD (Εικόνα 2Α), στο οποίο η συνδυασμένη ακολουθία του μοτίβου 2 και 4 περιείχε το CRI του ACD , ενώ η συνδυασμένη αλληλουχία του μοτίβου 3 και 1 περιείχε τον β6-βρόχο και το CRII. Τα τέσσερα μοτίβα ανιχνεύθηκαν στην πλειονότητα των πρωτεϊνών CaHsp20, ενώ μόνο το μοτίβο 2 βρέθηκε στα CaHsp16.7 και CaHsp30.1 και το CaHsp16.6b δεν περιείχε το μοτίβο 2. Το μοτίβο 6 ανιχνεύτηκε στα CaHsp22.1, 23.8 και 26.5 , και το μοτίβο 8 βρέθηκε πίσω από το μοτίβο 5 στα CaHsp18.1a, 18.1b, 18.2a και 18.2b, ενώ το μοτίβο 10 βρέθηκε μόνο στο μπροστινό μέρος του μοτίβου 2 στα CaHsp17.7a, 17.7b και 25.8 (Εικόνα 1 ). Μόνο το μοτίβο 6 βρέθηκε στις C-τερματικές περιοχές, άλλα μοτίβα όπως το μοτίβο 5, 7, 8, 9 και 10 βρέθηκαν κυρίως στις Ν-τερματικές περιοχές. Αξίζει να σημειωθεί ότι το μοτίβο 9 (η αλληλουχία σήματος-πεπτιδίου) βρέθηκε στα CaHsp18.7, 21.1, 21.2, 22.0 και 22.6, το οποίο ήταν σύμφωνο με την πρόβλεψή τους για τον εντοπισμό της εκκριτικής οδού (Πίνακας 1).
Εικόνα 1. Κατανομή διατηρημένων μοτίβων στα μέλη της οικογένειας CaHsp20 . Δέκα υποτιθέμενα μοτίβα αντιπροσωπεύονται από έναν αριθμό σε έγχρωμο πλαίσιο. Τα ονόματα όλων των μελών και οι συνδυασμένες τιμές p εμφανίζονται στην αριστερή πλευρά του σχήματος και τα μεγέθη των μοτίβων υποδεικνύονται στο κάτω μέρος του σχήματος. Για λεπτομέρειες σχετικά με τα μοτίβα, ανατρέξτε στον Πίνακα 2.
Πίνακας 2. Ακολουθίες μοτίβων που προσδιορίζονται από εργαλεία MEME .
Εικόνα 2. Ευθυγραμμίστε τα ACD του CaHsp20. (Α) Ευθυγράμμιση του ACD από τα αποτελέσματα MEME για το CaHsp20 με το Hsp20 από την Pfam. Το μοτίβο 2, 4, 3 και 1 που ελήφθη μέσω ανάλυσης MEME σχημάτισε το πιθανολογούμενο CaHsp20 ACD και το λογότυπο HMM από την Pfam που αντιπροσωπεύει τον τομέα Hsp20 (PF00011). Τα αμινοξέα με κόκκινο χρώμα υποδεικνύουν τις αντιστοιχίες μεταξύ των μοτίβων MEME και των αλληλουχιών HMM. (Β) Ευθυγράμμιση των ACD του CaHsp20s από πιπέρι. Τα ονόματα όλων των μελών εμφανίζονται στην αριστερή πλευρά του σχήματος. Η ευθυγράμμιση πραγματοποιείται από το πρόγραμμα δομικής ευθυγράμμισης Promals3D. Κάθε προβλεπόμενο β-επιμεταλλωμένο φύλλο είναι μπλε. Η κύρια δομή του ACD, συμπεριλαμβανομένων των διατηρημένων περιοχών I (CRI), II (CRII) και β6-βρόχου, φαίνεται στο κάτω μέρος του σχήματος.
Το ACD σχηματίστηκε από δύο διατηρημένες περιοχές, CRI (μοτίβο 2 και 4) με β2, β3, β4 και β5 και CRII (μέρος του μοτίβου 3 και 1) με β7, β8 και β9, οι οποίες διαχωρίστηκαν από μια υδρόφιλη περιοχή β6-βρόχος (μέρος του μοτίβου 3) με μεταβλητό μήκος. Οι πολλαπλές ευθυγραμμίσεις των διατηρημένων περιοχών ACD, που καλύπτουν ~ 90 αμινοξέα σε πρωτεΐνες CaHsp20 φαίνονται ξεκάθαρα στο Σχήμα 2Β. Τα CaHsp16.6b, 16.7, 24.3b, 27.6, 28.4, 30.1 και 35.5 είτε δεν είχαν τον β6-βρόχο είτε περιείχαν αλληλουχίες με άγνωστη συνάρτηση μεταξύ β5 και β7. Τα μικρότερα ACD των CaHsp18.4b, 24.3b και 28.4 δεν είχαν το β2 (Εικόνα 2Β, Πίνακας 1), το οποίο μπορεί να δείχνει τη λειτουργική ποικιλομορφία και μένει να διευκρινιστεί πλήρως.
Phylogenetic Analysis of CaHsp20 Family
Για να αναλυθεί η εξελικτική σχέση των οικογενειών γονιδίων Hsp20 σε πιπεριά, ντομάτα, Arabidopsis, ρύζι και καλαμπόκι, τις αλληλουχίες αμινοξέων 154 πρωτεϊνών Hsp20, συμπεριλαμβανομένων 35 από πιπεριά, 24 από ντομάτα, 25 από Arabidopsis, 35 από ρύζι και 35 από αραβόσιτο ευθυγραμμίστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή ενός μη ριζωμένου φυλογενετικού δέντρου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, 130 Hsp20s θα μπορούσαν να ομαδοποιηθούν σε 12 διακριτές υποοικογένειες, που περιέχουν 47 CI (κυτοσόλιο/πυρήνας Ι), 27 CII, 6 CIII, 1 CIV, 5 CV, 3 CVI, 4 CVII, 5 drioch Imit , 4 MII, 19 Ps (πλαστίδιο), 4 ERs (ενδοπλασματικό δίκτυο) και 5 Pos (υπεροξισωμικό), αντίστοιχα. Ωστόσο, οι αριστερές 24 πρωτεΐνες από πιπέρι, Arabidopsis, ρύζι και καλαμπόκι δεν συγκεντρώθηκαν καλά σε καμία υποοικογένεια. Τα μέλη Hsp20 από τα πέντε είδη ήταν πιο κοντά σε εκείνα της ίδιας κατηγορίας σε διαφορετικά είδη παρά με άλλα στο ίδιο είδος. Πολλά Hsp20 από τα πέντε είδη συγκεντρώθηκαν σε κατηγορίες CI και CII, συμπεριλαμβανομένων 9 και 10 πρωτεϊνών CaHsp20, αντίστοιχα, γεγονός που έδειξε ότι το κυτοσόλιο μπορεί να είναι η κύρια περιοχή λειτουργίας για τα CaHsp20. Η υποοικογένεια CI είχε δύο υποκατηγορίες που αποτελούνταν από μονοκοτυλήδονα Hsp20s (OsHsp20s και ZmHsp20s) και δύο υποκατηγορίες που αποτελούνταν από δικοτυλήδονα Hsp20s (CaHsp20s, SlHsp20s και AtHsp20s), γεγονός που υποδηλώνει ότι έλαβε χώρα ένα μοναδικό γονιδιακό διπλασιασμό (αλληλοδιπλασιασμός) ., 2012). Ήταν ενδιαφέρον ότι τα μέλη των υποοικογενειών P και M (MI και MII) συνδέονταν στενά μεταξύ τους, κάτι που ήταν συνεπές με το Hsp20 της υποοικογένειας M που εξελίχθηκε αργότερα από την υποοικογένεια P (Waters, 2013). Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν συγκεντρώθηκαν πρωτεΐνες Hsp20 από μονοκοτυληδόνια (ρύζι και καλαμπόκι) στο σύμπλεγμα CIV, το οποίο ήταν σύμφωνο με το αποτέλεσμα που προτείνεται από τους Siddique et al. (2008) ότι τα μέλη CIV των πρωτεϊνών Hsp20 βρέθηκαν αποκλειστικά σε δικοτυλήδονα. Για τα τρία είδη δικοτυλήδονων, εντοπίστηκαν 12 ζεύγη ορθολόγων (11 ζεύγη ορθολόγων πιπεριάς/ντομάτας και ένα ζευγάρι πιπεριάς/Arabidopsis otholog), υποδεικνύοντας ότι τα προγονικά γονίδια της οικογένειας Hsp20 μπορεί να υπήρχαν πριν από τη διαφοροποίηση των Arabidopsis, ντομάτας και πιπεριάς είδος. Επιπλέον, αρκετά ζεύγη παραλόγου βρέθηκαν και στις τρεις οικογένειες Hsp20 από πιπεριά, Arabidopsis και ντομάτα, υποδηλώνοντας ότι τα γονίδια CaHsp20 υποβλήθηκαν σε πολλούς γύρους γεγονότων διπλασιασμού που συνέβησαν μετά την ειδοποίηση της πιπεριάς.
Εικόνα 3. Φυλογενετικό δέντρο πρωτεϊνών πιπεριάς, ντομάτας και Arabidopsis Hsp20 . Οι πρωτεΐνες Hsp20 χρησιμοποιούνται για την κατασκευή του φυλογενετικού δέντρου χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα MEGA 5.10. Η ανάλυση Unrooted Neighbor-Jining εκτελείται με διαγραφή κατά ζεύγη και διόρθωση Poisson. Για τις πρωτεΐνες Hsp20 ντομάτας (με πρόθεμα Sl), Arabidopsis (με πρόθεμα At), ρύζι (με πρόθεμα Os) και αραβόσιτο (με πρόθεμα Zm), χρησιμοποιούνται ονόματα γονιδίων και ονόματα υποοικογενειών και σημειώνονται με πράσινο, μαύρο, μπλε , και κυανό τρίγωνα, αντίστοιχα. Οι πρωτεΐνες CaHsp20 σημειώνονται με κόκκινα τρίγωνα. Οι 12 υποοικογένειες σημειώνονται με διαφορετικά χρώματα και οι πρωτεΐνες Hsp20 που δεν έχουν ταξινομηθεί έχουν χρωματιστεί με γκρι χρώμα.
Βρέθηκε ότι η φυλογενετική ταξινόμηση της οικογένειας Hsp20 ήταν συνεπής με το πρότυπο του τύπου ιντρονίου (το πρότυπο 1 δεν είχε ιντρόνιο, το πρότυπο 2 είχε ένα εσώνιο και το πρότυπο 3 είχε περισσότερα από ένα ιντρόνια) σε προηγούμενη αναφορά (Ouyang et al., 2009 ). Τα περισσότερα μέλη CaHsp20 των υποοικογενειών CI και ER δεν είχαν εσώνιο και τα μέλη των CIII, CVII, P και MII έδειξαν ένα εσώνιο (Εικόνα 3, Πίνακας 1). Ωστόσο, έξι μέλη που ανήκαν στην υποοικογένεια CII δεν εμφάνισαν εσώνιο, άλλα τέσσερα μέλη της υποοικογένειας CII είχαν ένα εσώνιο. Αξίζει να σημειωθεί ότι το CaHsp16.3 ανήκε στην υποοικογένεια Po είχε ένα εσώνιο (μοτίβο 2), το οποίο ήταν διαφορετικό από την υποοικογένεια Po από το ρύζι (μοτίβο 1, Ouyang et al., 2009). Μεταξύ των μη ταξινομημένων CaHsp20s, το CaHsp27.6 ήταν ένα ορφανό γονίδιο με πέντε εσώνια (μοτίβο 3), τα οποία έδειχναν ιδιαίτερη φυλογενετική κατάσταση.
Χρωμοσωμικός εντοπισμός και γονιδιακός διπλασιασμός των γονιδίων CaHsp20
Τα 35 γονίδια CaHsp20 κατανεμήθηκαν και στα 12 χρωμοσώματα πιπεριάς (Εικόνα 4, Πίνακας 1). Μεταξύ αυτών των 35 γονιδίων CaHsp20, πέντε (14,3%) γονίδια εντοπίστηκαν σε καθένα από τα χρωμόσωμα 3, 6 και 8, τέσσερα γονίδια (11,4%) στο χρωμόσωμα 1, τρία γονίδια σε καθένα από τα χρωμόσωμα 4, 9, 10, δύο γονίδια στο καθένα από τα χρωμόσωμα 5 και 7, και μόνο ένα γονίδιο σε καθένα από τα χρωμόσωμα 2, 11 και 12. Καθώς τα γεγονότα διπλασιασμού γονιδίων εμπλέκονται στην εξέλιξη των γονιδιωμάτων των φυτών, αναλύθηκαν επίσης οι διπλασιασμοί των CaHsp20s. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, ανιχνεύτηκε ένα συμβάν τμηματικού διπλασιασμού μεταξύ CaHsp24.2 στο χρωμόσωμα 1 και CaHsp24.3a στο χρωμόσωμα 9, και τρία συμβάντα διαδοχικών διπλασιασμού (CaHsp17.7a/17.7b, CaHsp17.6/17.8a/17.8b και Τα CaHsp18.1a/18.1b/18.2a/18.2b) ταυτοποιήθηκαν στο χρωμόσωμα 3, 6 και 8, αντίστοιχα. Ωστόσο, CaHsp18.7, 21.1 και 22. Το 0 ήταν πιθανό να προέρχεται από το ίδιο προγονικό γονίδιο, το οποίο υπέστη έναν τμηματικό διπλασιασμό και ένα γεγονός διπλασιασμού κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του χρωμοσώματος της πιπεριάς. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τόσο τα συμβάντα διαδοχικών όσο και τμηματικών διπλασιασμού συνέβαλαν σημαντικά στην επέκταση των γονιδίων CaHsp20 του πιπεριού.
Εικόνα 4. Θέση και διπλασιασμοί παραλόγων CaHsp20 σε χρωμοσώματα πιπεριάς . Η κλίμακα αντιπροσωπεύει μεγαβάσεις (Mb). Οι αριθμοί των χρωμοσωμάτων υποδεικνύονται στο επάνω μέρος κάθε ράβδου. Τα γονίδια CaHsp20 που υπάρχουν σε διπλά χρωμοσωμικά τμήματα συνδέονται με γκρίζες διακεκομμένες γραμμές και τα διπλά διπλά γονίδια σημειώνονται με γκρι ορθογώνια.
Το Δίκτυο Αλληλεπίδρασης των Γονιδίων CaHsp20
Για να αναλυθεί περαιτέρω η σχέση μεταξύ των γονιδίων CaHsp20 και άλλων γονιδίων, κατασκευάστηκε ένα δίκτυο αλληλεπίδρασης γονιδίων CaHsp20 σύμφωνα με το ορθολογικό στο Arabidopsis (Εικόνα 5). Υπήρχαν 24 (68,6%) από τα 35 γονίδια CaHsp20 που σχετίζονται ορθολογικά με 13 (68,4%) από τα 19 γονίδια Arabidopsis Hsp20. Οι κόκκινες, μπλε και πράσινες γραμμές αντιπροσωπεύουν συντελεστές συσχέτισης Pearson gt;0, lt; 0 και δεν υπολογίζονται, οι οποίοι αντιστοιχούσαν σε θετική συσχέτιση (136 ζεύγη γονιδίων που αλληλεπιδρούν), αρνητική συσχέτιση (99 ζεύγη) και ασαφή συσχέτιση (106 ζεύγη ), αντίστοιχα. Το δίκτυο αλληλεπίδρασης των γονιδίων CaHsp20 έδειξε μια πολύπλοκη λειτουργική σχέση. Για παράδειγμα, το CaHsp24.2 αλληλεπιδρά άμεσα ή έμμεσα με πολλά άλλα γονίδια CaHsp20 (CaHsp17.8a, 17.8b, 22.1, 23.8, 26.5, 18.1a, 18.1b, 18.2a και 18.2b), και είχε επίσης περισσότερα αλληλεπιδρώντα γονίδια από άλλα CaHsp20, ενώ μόνο ένα γονίδιο (CA03g01490) αλληλεπιδρούσε με το CaHsp25.8. Επιπλέον, τα γονίδια CaHsp18.1a, 18.1b, 18.2a και 18.2b αλληλεπιδρούν με γονίδια που σχετίζονται με το θερμικό στρες (γονίδια οικογένειας πρωτεΐνης θερμικού σοκ 70 CA03g30260 και CA01g31330), CaHsp17.7a και 17.7b (γονίδια που σχετίζονται με το στρες βαρέων μετάλλων Γονίδιο πρωτεΐνης υπεροικογένειας μεταφοράς/αποτοξίνωσης βαρέων μετάλλων CA02g24070), CaHsp16.3 που αλληλεπιδρά με γονίδιο που σχετίζεται με τη μεταγωγή σήματος (γονίδιο πρωτεΐνης οικογένειας EF-χεριού που δεσμεύει ασβέστιο CA10g18540) και CaHsp25.9 με παράγοντα μεταγραφής (MADS-box transcription factor4CA50 proteing familyg). ), το οποίο μπορεί να υποδεικνύει ότι τα γονίδια CaHsp20 εμπλέκονται σε πολλούς μηχανισμούς απόκρισης ρυθμίζοντας τα κατάντη γονίδια τους ή ρυθμίζονται από τους ανάντη ρυθμιστές τους στο πιπέρι. ενώ μόνο ένα γονίδιο (CA03g01490) αλληλεπιδρά με το CaHsp25.8. Επιπλέον, τα γονίδια CaHsp18.1a, 18.1b, 18.2a και 18.2b αλληλεπιδρούν με γονίδια που σχετίζονται με το θερμικό στρες (γονίδια οικογένειας πρωτεΐνης θερμικού σοκ 70 CA03g30260 και CA01g31330), CaHsp17.7a και 17.7b (γονίδια που σχετίζονται με το στρες βαρέων μετάλλων Γονίδιο πρωτεΐνης υπεροικογένειας μεταφοράς/αποτοξίνωσης βαρέων μετάλλων CA02g24070), CaHsp16.3 που αλληλεπιδρά με γονίδιο που σχετίζεται με τη μεταγωγή σήματος (γονίδιο πρωτεΐνης οικογένειας EF-χεριού που δεσμεύει ασβέστιο CA10g18540) και CaHsp25.9 με παράγοντα μεταγραφής (MADS-box transcription factor4CA50 proteing familyg). ), το οποίο μπορεί να υποδεικνύει ότι τα γονίδια CaHsp20 εμπλέκονται σε πολλούς μηχανισμούς απόκρισης ρυθμίζοντας τα κατάντη γονίδια τους ή ρυθμίζονται από τους ανάντη ρυθμιστές τους στο πιπέρι. ενώ μόνο ένα γονίδιο (CA03g01490) αλληλεπιδρά με το CaHsp25.8. Επιπλέον, τα γονίδια CaHsp18.1a, 18.1b, 18.2a και 18.2b αλληλεπιδρούν με γονίδια που σχετίζονται με το θερμικό στρες (γονίδια οικογένειας πρωτεΐνης θερμικού σοκ 70 CA03g30260 και CA01g31330), CaHsp17.7a και 17.7b (γονίδια που σχετίζονται με το στρες βαρέων μετάλλων Γονίδιο πρωτεΐνης υπεροικογένειας μεταφοράς/αποτοξίνωσης βαρέων μετάλλων CA02g24070), CaHsp16.3 που αλληλεπιδρά με γονίδιο που σχετίζεται με τη μεταγωγή σήματος (γονίδιο πρωτεΐνης οικογένειας EF-χεριού που δεσμεύει ασβέστιο CA10g18540) και CaHsp25.9 με παράγοντα μεταγραφής (MADS-box transcription factor4CA50 proteing familyg). ), το οποίο μπορεί να υποδεικνύει ότι τα γονίδια CaHsp20 εμπλέκονται σε πολλούς μηχανισμούς απόκρισης ρυθμίζοντας τα κατάντη γονίδια τους ή ρυθμίζονται από τους ανάντη ρυθμιστές τους στο πιπέρι.
Εικόνα 5. Το δίκτυο αλληλεπίδρασης των γονιδίων CaHsp20 στο πιπέρι σύμφωνα με τους ορθολόγους στο Arabidopsis . Οι πράσινοι κύκλοι αντιπροσωπεύουν τα γονίδια CaHsp20 και οι ροζ κύκλοι αντιπροσωπεύουν την αλληλεπίδραση των γονιδίων του πιπεριού με τα γονίδια CaHsp20. Οι κόκκινες γραμμές αντιπροσωπεύουν το PCC gt; 0 (Συντελεστής συσχέτισης Pearson), οι μπλε γραμμές σημαίνουν το PCC lt; 0 και οι πράσινες γραμμές αντιπροσωπεύουν το PCC που δεν υπολογίζεται.
Μοτίβα έκφρασης των γονιδίων CaHsp20 σε διαφορετικούς ιστούς
Για να διερευνηθούν πρωτίστως οι βιολογικές λειτουργίες μεμονωμένων μελών CaHsp20 στο πιπέρι, η προκαλούμενη από τη θερμότητα έκφραση αυτών των γονιδίων CaHsp20 εξετάστηκε με ημι-ποσοτική RT-PCR σε τέσσερις κύριους ιστούς (ρίζα, στέλεχος, φύλλο και άνθος) από τη θερμοανεκτική σειρά R9 ( Εικόνα 6). Υπό κανονικές συνθήκες θερμοκρασίας, 27 από τα 35 γονίδια CaHsp20 δεν έδειξαν σημαντική εξειδίκευση ιστού, καθώς εκφράστηκαν ελάχιστα στους ιστούς που δοκιμάστηκαν, ωστόσο, τα αριστερά οκτώ γονίδια CaHsp20, συμπεριλαμβανομένων των CaHsp16.3, 16.6b, 16.7, 17.7a, 17.7b, Τα 18.1b, 18.2a και 23.8 μπορούσαν να ανιχνευθούν τουλάχιστον σε έναν ιστό. Είκοσι δύο (62,9%) γονίδια CaHsp20 προκλήθηκαν σε μεγάλο βαθμό σε τουλάχιστον έναν ιστό μετά από θεραπεία HS (40°C για 2 ώρες). Για παράδειγμα, τα CaHsp16.3, 16.4, 17.6 και 18.1b εκφράστηκαν σε σχετικά υψηλά επίπεδα σε όλους τους ιστούς, ενώ τα CaHsp16.7 και 23. 8 προκλήθηκαν σε μεγάλο βαθμό από το HS μόνο στο άνθος ή στο φύλλο, αντίστοιχα. Πολλά CaHsp20 που προκαλούνται από τη θερμότητα, όπως τα CaHsp16.6a, 17.6, 21.1, 21.2, 22.0, 24.3a και 25.8 εκφράστηκαν σε υψηλότερα επίπεδα στα επεξεργασμένα φύλλα πιπεριάς από άλλους τρεις ιστούς, ωστόσο, τα υψηλότερα επίπεδα CaHsp16.3 και 22. ανιχνεύθηκαν σε λουλούδια με επεξεργασία HS και το επίπεδο έκφρασης του CaHsp17.7a ήταν υψηλότερο στις επεξεργασμένες ρίζες. Οι μεταγραφές 12 (34,3%) γονιδίων (CaHsp17.8a, 17.8b, 18.4a, 18.4b, 21.7, 22.1, 24.3b, 26.5, 27.6, 28.4, 30.1) και των δύο δεν ήταν ορατές στο 35. θερμοκρασία και συνθήκες HS. 6 ανιχνεύθηκαν σε λουλούδια με επεξεργασία HS και το επίπεδο έκφρασης του CaHsp17.7a ήταν υψηλότερο στις επεξεργασμένες ρίζες. Οι μεταγραφές 12 (34,3%) γονιδίων (CaHsp17.8a, 17.8b, 18.4a, 18.4b, 21.7, 22.1, 24.3b, 26.5, 27.6, 28.4, 30.1) και των δύο δεν ήταν ορατές στο 35. θερμοκρασία και συνθήκες HS. 6 ανιχνεύθηκαν σε λουλούδια με επεξεργασία HS και το επίπεδο έκφρασης του CaHsp17.7a ήταν υψηλότερο στις επεξεργασμένες ρίζες. Οι μεταγραφές 12 (34,3%) γονιδίων (CaHsp17.8a, 17.8b, 18.4a, 18.4b, 21.7, 22.1, 24.3b, 26.5, 27.6, 28.4, 30.1) και των δύο δεν ήταν ορατές στο 35. θερμοκρασία και συνθήκες HS.
Εικόνα 6. Ανάλυση RT-PCR του προτύπου έκφρασης 35 γονιδίων CaHsp20 σε τέσσερις ιστούς πιπεριάς υπό κανονικές συνθήκες και συνθήκες HS . R, ρίζα; S, στέλεχος; L, φύλλο; F, λουλούδι. Κανονική κατάσταση: 26°C για 2 ώρες. Συνθήκη HS: 40°C για 2 ώρες. Το γονίδιο πρωτεΐνης σύζευξης ουβικιτίνης πιπεριού (CaUBI-3) χρησιμοποιείται ως εσωτερικός έλεγχος.
Προφίλ έκφρασης των γονιδίων CaHsp20 σε απόκριση στο θερμικό στρες
Προκειμένου να διερευνηθεί το προφίλ θερμικής απόκρισης για τα γονίδια CaHsp20, συγκρίθηκαν τα μοτίβα μεταγραφής κάθε CaHsp20 σε φύλλα από τη θερμοευαίσθητη γραμμή Β6 και τη θερμοανεκτική γραμμή R9 με συνεχή επεξεργασία θερμικής καταπόνησης (40°C για 4 ώρες). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7, παρατηρήθηκε ισχυρή απόκριση στο HS και στα 35 γονίδια CaHsp20 και από τις δύο σειρές (Β6 και R9), στα οποία η πλειονότητα αυτών των γονιδίων ρυθμίστηκε προς τα πάνω με θεραπεία HS. Για παράδειγμα, τα CaHsp16.4, 18.7, 22.0, 25.8 και 25.9 προκλήθηκαν σε μεγάλο βαθμό μετά από βραχυπρόθεσμο HS (40°C για 0,5 ώρα) και τα υψηλά επίπεδα έκφρασής τους διατηρήθηκαν μέχρι το τέλος της θεραπείας HS, ενώ μόνο το CaHsp21. 7 και 28.4 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω από το HS στο R9. Γενικά, οι κορυφές των σχετικών επιπέδων έκφρασης των γονιδίων CaHsp20 (σε σύγκριση με το HS για 0 ώρα) στη θερμοευαίσθητη γραμμή Β6 που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με HS ήταν υψηλότερες από εκείνες της θερμοανεκτικής γραμμής R9, ωστόσο η εμφάνιση των τιμών κορυφής παρατηρήθηκε στις 2 ή 4 ώρες στο Β6 αλλά σε 0,5 ώρα σε R9 μετά από θεραπεία HS. Επιπλέον, αξίζει να σημειωθεί ότι σε σύγκριση με άλλα μέλη CaHsp20, τα CaHsp16.4, 18.7, 22.0, 25.8 και 25.9 τα οποία ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω στα φύλλα Β6 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με HS, ωστόσο, δεν ανιχνεύθηκαν κύρια γονίδια απόκρισης στη θερμότητα σε γραμμή R9 μετά από θεραπεία HS, αν και πολλά γονίδια CaHsp20 προκλήθηκαν από το HS στο R9.
Εικόνα 7. Χάρτης θερμότητας που δείχνει μοτίβο έκφρασης γονιδίων CaHsp20 στη θερμοευαίσθητη γραμμή πιπεριού B6 και στη θερμοανεκτική γραμμή R9 υπό συνθήκες HS . Τα φύλλα των δενδρυλλίων B6 και R9 (6-8 αληθινά φύλλα) χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο των αλλαγών του επιπέδου έκφρασης των γονιδίων CaHsp20 σε διαφορετικά χρονικά σημεία (0, 0,5, 1, 2 και 4 ώρες) με επεξεργασία HS (40°C). Το CaUBI-3 χρησιμοποιείται ως εσωτερικός έλεγχος. Τα δεδομένα qRT-PCR εμφανίζονται σε σχέση με 0 h. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2 -ΔΔCT και κανονικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας log10. Ο χάρτης θερμότητας δημιουργήθηκε με χρήση MeV.
Ανάλυση cis-στοιχείων που σχετίζονται με το στρες στους Προαγωγείς CaHsp20
Για περαιτέρω διερεύνηση του πιθανού μηχανισμού ρύθμισης των γονιδίων CaHsp20 στην απόκριση HS του πιπεριού, σαρώθηκαν επίσης τα cis-στοιχεία που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση γονιδίων που σχετίζονται με την άμυνα στις περιοχές προαγωγέα του CaHsp20s και οι περιοχές προαγωγέα (–500 bp ανάντη η θέση έναρξης μετάφρασης) χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 30 γονίδια CaHsp20 (περιοχές προαγωγέα των CaHsp18.4a, 21.1, 21.2, 22.1 και 28.4 απουσίαζαν) από PGD (Εικόνα 8). Ένα έως τρία στοιχεία HSE (απόκριση στο θερμικό στρες) βρέθηκαν στις περιοχές προαγωγέα 12 γονιδίων (CaHsp16.3, 16.4, 17.6, 17.8a, 17.8b, 18.1a, 18.2a, 22.0, 25.8, 227.5 και 25.9, 22.0, 25.8, 26.5. ), αντίστοιχα, στην οποία ο αριθμός των στοιχείων HSE στην περιοχή προαγωγέα του CaHsp17.8b ήταν ο μέγιστος. Αν και τα στοιχεία HSE δεν μπορούσαν να βρεθούν σε περιοχές υποκινητή -500 bp άλλων 11 γονιδίων CaHsp20 (CaHsp16.7, 17.2, 17.7b, 18.1b, 18.4b, 21.7, 23.8, 24.2, 24.3b, 30.1 και 35.5), 1–3 στοιχεία HSE ανιχνεύθηκαν στις περιοχές προαγωγέα −1500 bp, ωστόσο, κανένα στοιχείο HSE δεν υπήρχε ούτε στις περιοχές προαγωγέα −1500 ούτε −500 bp του υπόλοιπο επτά CaHsp20 (CaHsp16.6a, 16.6b, 17.7a, 18.2b, 18.7, 22.6 και 24.3a). Επιπλέον, ανιχνεύθηκαν άλλα στοιχεία cis που σχετίζονται με το στρες, συμπεριλαμβανομένων κουτιών TATA και στις 30 επιλεγμένες περιοχές προαγωγέα, μοτίβο CCAAT σε 23 γονίδια, πλούσιες σε TC επαναλήψεις σε επτά γονίδια (CaHsp17.8a, 18.1b, 18.2a, 18.2 b, 18.7, 30.1 και 35.5) και W-box σε τρία γονίδια (CaHsp18.4b, 18.7 και 25.8).
Σχήμα 8. Προβλεπόμενα cis -στοιχεία στις περιοχές προαγωγέα των γονιδίων CaHsp20 . Αναλύονται οι αλληλουχίες υποκινητή (–500 bp) για 30 γονίδια CaHsp20 (περιοχές προαγωγέα των CaHsp18.4a, 21.1, 21.2, 22.1 και 28.4 απουσίαζαν). Τα ονόματα των υποκινητών των γονιδίων CaHsp20 φαίνονται στην αριστερή πλευρά του σχήματος. Ο αριθμός στο κάτω μέρος υποδεικνύει τον αριθμό των νουκλεοτιδίων ανάντη προς το κωδικόνιο έναρξης μετάφρασης, ATG. Τα μπλε τρίγωνα αντιπροσωπεύουν τα στοιχεία θερμικού σοκ (HSE), οι ροζ κύλινδροι για τα στοιχεία TATA-box, τα μπλε βέλη για τις πλούσιες σε TC επαναλήψεις, τα μαύρα ορθογώνια για τα στοιχεία CCAAT και τα κόκκινα πεντάγωνα για το W- στοιχεία κουτιού.
Συζήτηση
Έχει αποδειχθεί ότι τα Hsp20s μπορούν να αποτρέψουν τη μη αναστρέψιμη συσσώρευση μετουσιωτικών πρωτεϊνών και να ενισχύσουν τη θερμοανεκτικότητα που αποκτάται από τα φυτά (Wang et al., 2004; Haslbeck and Vierling, 2015). Επωφελούμενοι από τη διαθεσιμότητα ολόκληρης της αλληλουχίας του γονιδιώματος τα τελευταία χρόνια, αρκετές οικογένειες Hsp20 έχουν ταυτοποιηθεί από Arabidopsis, ρύζι, σόγια και Populus trchocarpa (Waters et al., 2008; Lopes-Caitar et al., 2013), ωστόσο, πολύ λίγο είναι γνωστό για αυτή την οικογένεια στο πιπέρι.
Η παρούσα μελέτη περιγράφει την ταυτοποίηση συνολικά 35 γονιδίων CaHsp20 από το πιπέρι, τη διερεύνηση της δομής τους, τη χρωμοσωμική οργάνωση, τις εξελικτικές σχέσεις, την πρόβλεψη του δικτύου αλληλεπίδρασης και τα μοτίβα έκφρασης στους διαφορετικούς ιστούς και υπό συνθήκες θερμικής καταπόνησης, που παρέχει τη βάση για κατανοώντας πλήρως την οικογένεια γονιδίων CaHsp20 στο πιπέρι και αποτελεί τη βάση για μελλοντική λειτουργική απόκλιση των γονιδίων Hsp20 στην οικογένεια Solanaceae.
Αν και έχουν τη μεγαλύτερη ποικιλομορφία μεταξύ των οικογενειών μοριακών συνοδών, τα Hsp20 μοιράζονται μια συντηρημένη δομική περιοχή, η ACD πλαισιώνεται από μια μη διατηρημένη Ν-τερματική αλληλουχία μεταβλητού μήκους και μια διατηρημένη βραχεία C-τερματική αλληλουχία (Kriehuber et al., 2010; Bondino et al., 2012). Ο χαρακτηρισμός και οι πολλαπλές ευθυγραμμίσεις αλληλουχιών αποκάλυψαν ότι όλα τα επιλεγμένα 35 CaHsp20 περιείχαν το ACD με διάφορες αλληλουχίες. Το CRI (μοτίβο 2 και 4) αποτελούνταν από β2, β3, β4 και β5 και το CRII (μέρος του μοτίβου 3 και 1) που αποτελείται από β7, β8 και β9 στο ACD διατηρήθηκαν δομικά, περιέχοντας τα χαρακτηριστικά υπολείμματα Pro-X (14)-Gly-Val-Leu και Pro-X(14)-X-Val/Leu/Ile-Val/Leu/Ile, αντίστοιχα (Εικόνες 1, 2Β· Caspers et al., 1995· Ouyang et al., 2009). Τα περισσότερα από τα ACD CaHsp20 περιέχουν επίσης το φύλλο β6, το μη διατηρημένο μοτίβο που συνδέει το β5 στο CRI και το β7 στο CRII (Bondino et al., 2012), ενώ αντικαθίσταται από αλληλουχίες άγνωστης λειτουργίας σε τέσσερα μέλη CaHsp20 (CaHsp16.7, 27.6, 30.1 και 35.5) ή απουσιάζει σε τρία μέλη (CaHsp16.6b, 24.3b και 28.4). Οι φυτικές πρωτεΐνες Hsp20 των συστάδων CIV στερούνται το φύλλο β6 (Waters, 2013) αλλά πιο ενδιαφέρον είναι ότι κανένα από τα μέλη Hsp20 από πιπεριά, ντομάτα, ρύζι και καλαμπόκι δεν βρίσκεται στο σύμπλεγμα CIV, ενώ βρίσκεται επιπλέον στην οικογένεια Arabidopsis Hsp20. , τα παραπάνω επτά γονίδια CaHsp20 δεν συγκεντρώνονται σε καμία υποοικογένεια (Εικόνα 3), μπορεί να συναχθεί ότι αυτά τα γονίδια από το πιπέρι ανήκουν στο σύμπλεγμα CIV ή σχηματίζουν ένα νέο σύμπλεγμα. Επειδή το φύλλο β6 είναι κρίσιμο για το σχηματισμό διμερών και τον ολιγομερισμό,
Η γονιδιακή οργάνωση παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη πολλαπλών οικογενειών γονιδίων και ως απάντηση στις συνθήκες στρες (Xu et al., 2012). Δεκαέξι γονίδια CaHsp20 είναι χωρίς εσώνια (μοτίβο 1), 18 γονίδια περιέχουν ένα εσώνιο (μοτίβο 2), μόνο ένα γονίδιο (CaHsp27.6) περιέχει πέντε ιντρόνια (μοτίβο 3, Πίνακας 1). Τα περισσότερα μέλη CaHsp20 των υποοικογενειών CI και ER δεν έχουν εσώνιο (μοτίβο 1) και τα μέλη της υποοικογένειας MII έχουν ένα εσώνιο (μοτίβο 2, Εικόνα 3, Πίνακας 1), το οποίο αποτελείται από την οικογένεια Hsp20 ρυζιού, ενώ τα πρότυπα των μελών CaHsp20 και Τα Hsp20 από το ρύζι ανήκουν στις υποοικογένειες CII, Po και P δεν είναι ίδιες (Ouyang et al., 2009), υποδεικνύοντας ότι αν και τα μοτίβα ιντρονίων ρίχνουν φως στη φυλογενετική σχέση, υπάρχει διαφορά μεταξύ διαφορετικών ειδών. Τα περισσότερα από αυτά τα γονίδια CaHsp20 επάγονται σε μεγάλο βαθμό από το HS σε διαφορετικούς ιστούς (Εικόνα 6), το οποίο μπορεί να υποδεικνύει ότι τα επίπεδα έκφρασης γονιδίων χωρίς εσώνια ή με εσώνιο μικρού μήκους θα ενισχυθούν υπό HS στα φυτά (Lopes-Caitar et al., 2013). Τα συμπαγή γονίδια έχουν ταχύτερη απόκριση στο HS και προστατεύουν τα φυτά από τη βλάβη του HS καλύτερα από ότι αυτά τα γονίδια περιέχουν πολλά ιντρόνια, και τα συμπαγή γονίδια επιλέγονται σταδιακά από συνθήκες στρες κατά τη μακροπρόθεσμη εξέλιξη (Jeffares et al., 2008), που μπορεί να Ο λόγος που τα μέλη της οικογένειας Hsp20 σχηματίζουν μια πρώτη γραμμή άμυνας ενάντια στη συσσώρευση πρωτεϊνών που προκαλείται από την κατάσταση του HS προκειμένου να διατηρηθεί η ομοιόσταση της πρωτεΐνης και να ενισχυθεί η θερμοανεκτικότητα των φυτών (Haslbeck και Vierling, 2015).
Τα γεγονότα διπλασιασμού γονιδίων παίζουν σημαντικό ρόλο στις επεκτάσεις των μελών της οικογένειας των γονιδίων και στους εξελικτικούς μηχανισμούς των γονιδιωμάτων (Vision et al., 2000). Οι διαδοχικοί διπλασιασμοί και οι τμηματικοί διπλασιασμοί είναι τα κύρια εξελικτικά πρότυπα (Kong et al., 2007). Σε αυτή την ανάλυση, εντοπίστηκαν 24 γονίδια Hsp20 στην ντομάτα, ωστόσο, στην πιπεριά με μέγεθος γονιδιώματος τέσσερις φορές μεγαλύτερο από αυτό της ντομάτας, βρέθηκαν μόνο 35 γονίδια CaHsp20. Ο λόγος για αυτό μπορεί να είναι τα γεγονότα διπλασιασμού ολόκληρου του γονιδιώματος (WGD) στην πιπεριά και την ντομάτα (Qin et al., 2014). Συνολικά βρέθηκαν 14 διπλά γονίδια CaHsp20 σε χρωμοσώματα πιπεριού, συμπεριλαμβανομένου ενός γεγονότος τμηματικού διπλασιασμού (CaHsp24.2/CaHsp24.3a) και τριών συμβάντων διπλασιασμού (CaHsp17.7a/17.7b, CaHsp17.6/17.8b και/17). CaHsp18.1a/18.1b/18.2a/18.2b· Εικόνα 4), συμβάλλοντας στην εξέλιξη των γονιδίων MI, CI και CII. Εκτός, Τα CaHsp18.7, 21.1 και 22.0 παρουσίασαν ένα συμβάν τμηματικού διπλασιασμού και ένα συμβάν διπλασιασμού σε σειρά, συμβάλλοντας επίσης στην εξέλιξη των γονιδίων CII. Σε προηγούμενη έκθεση, η υποοικογένεια CI στα φυτά συμπεριλαμβανομένης της ντομάτας, είναι πάντα η μεγαλύτερη (Waters, 2013), ωστόσο ο αριθμός των μελών CaHsp20 που ανήκουν στην υποοικογένεια CII είναι μεγαλύτερος (Εικόνα 3), κάτι που δεν συνάδει με αυτόν των άλλων φυτών. Ο λόγος μπορεί να αποδοθεί στα γονίδια CaHsp20 της υποοικογένειας CII που εμφανίστηκαν μετά την ειδογένεση μέσω πολλαπλών γονιδίων διπλασιασμού. Λόγω της άποψης ότι ο διπλασιασμός γονιδίων σε συνδυασμό συμβαίνει κυρίως στις πρωτεΐνες μεμβρανών που κωδικοποιούνται από γονίδια και στις πρωτεΐνες που σχετίζονται με το στρες, μπορούμε να προτείνουμε ότι οι κυρίαρχοι διπλασιασμοί στα γονίδια CaHsp20 μπορεί να σχετίζονται με το γεγονός ότι τα CaHsp20 ρυθμίζονται από το HS (Cannon et al. ., 2004· Rizzon et al., 2006· Hanada et al., 2008· Giorno et al., 2012). Τα 7, 21.1 και 22.0 παρουσίασαν ένα συμβάν τμηματικού διπλασιασμού και ένα διαδοχικό γεγονός διπλασιασμού, συμβάλλοντας επίσης στην εξέλιξη των γονιδίων CII. Σε προηγούμενη έκθεση, η υποοικογένεια CI στα φυτά συμπεριλαμβανομένης της ντομάτας, είναι πάντα η μεγαλύτερη (Waters, 2013), ωστόσο ο αριθμός των μελών CaHsp20 που ανήκουν στην υποοικογένεια CII είναι μεγαλύτερος (Εικόνα 3), κάτι που δεν συνάδει με αυτόν των άλλων φυτών. Ο λόγος μπορεί να αποδοθεί στα γονίδια CaHsp20 της υποοικογένειας CII που εμφανίστηκαν μετά την ειδογένεση μέσω πολλαπλών γονιδίων διπλασιασμού. Λόγω της άποψης ότι ο διπλασιασμός γονιδίων σε συνδυασμό συμβαίνει κυρίως στις πρωτεΐνες μεμβρανών που κωδικοποιούνται από γονίδια και στις πρωτεΐνες που σχετίζονται με το στρες, μπορούμε να προτείνουμε ότι οι κυρίαρχοι διπλασιασμοί στα γονίδια CaHsp20 μπορεί να σχετίζονται με το γεγονός ότι τα CaHsp20 ρυθμίζονται από το HS (Cannon et al. ., 2004· Rizzon et al., 2006· Hanada et al., 2008· Giorno et al., 2012). Τα 7, 21.1 και 22.0 παρουσίασαν ένα συμβάν τμηματικού διπλασιασμού και ένα διαδοχικό γεγονός διπλασιασμού, συμβάλλοντας επίσης στην εξέλιξη των γονιδίων CII. Σε προηγούμενη έκθεση, η υποοικογένεια CI στα φυτά συμπεριλαμβανομένης της ντομάτας, είναι πάντα η μεγαλύτερη (Waters, 2013), ωστόσο ο αριθμός των μελών CaHsp20 που ανήκουν στην υποοικογένεια CII είναι μεγαλύτερος (Εικόνα 3), κάτι που δεν συνάδει με αυτόν των άλλων φυτών. Ο λόγος μπορεί να αποδοθεί στα γονίδια CaHsp20 της υποοικογένειας CII που εμφανίστηκαν μετά την ειδογένεση μέσω πολλαπλών γονιδίων διπλασιασμού. Λόγω της άποψης ότι ο διπλασιασμός γονιδίων σε συνδυασμό συμβαίνει κυρίως στις πρωτεΐνες μεμβρανών που κωδικοποιούνται από γονίδια και στις πρωτεΐνες που σχετίζονται με το στρες, μπορούμε να προτείνουμε ότι οι κυρίαρχοι διπλασιασμοί στα γονίδια CaHsp20 μπορεί να σχετίζονται με το γεγονός ότι τα CaHsp20 ρυθμίζονται από το HS (Cannon et al. ., 2004· Rizzon et al., 2006· Hanada et al., 2008· Giorno et al., 2012). και το 22.0 παρουσίασαν έναν τμηματικό διπλασιασμό και ένα συμβάν διπλασιασμού σε σειρά, συμβάλλοντας επίσης στην εξέλιξη των γονιδίων CII. Σε προηγούμενη έκθεση, η υποοικογένεια CI στα φυτά συμπεριλαμβανομένης της ντομάτας, είναι πάντα η μεγαλύτερη (Waters, 2013), ωστόσο ο αριθμός των μελών CaHsp20 που ανήκουν στην υποοικογένεια CII είναι μεγαλύτερος (Εικόνα 3), κάτι που δεν συνάδει με αυτόν των άλλων φυτών. Ο λόγος μπορεί να αποδοθεί στα γονίδια CaHsp20 της υποοικογένειας CII που εμφανίστηκαν μετά την ειδογένεση μέσω πολλαπλών γονιδίων διπλασιασμού. Λόγω της άποψης ότι ο διπλασιασμός γονιδίων σε συνδυασμό συμβαίνει κυρίως στις πρωτεΐνες μεμβρανών που κωδικοποιούνται από γονίδια και στις πρωτεΐνες που σχετίζονται με το στρες, μπορούμε να προτείνουμε ότι οι κυρίαρχοι διπλασιασμοί στα γονίδια CaHsp20 μπορεί να σχετίζονται με το γεγονός ότι τα CaHsp20 ρυθμίζονται από το HS (Cannon et al. ., 2004· Rizzon et al., 2006· Hanada et al., 2008· Giorno et al., 2012). και το 22.0 παρουσίασαν έναν τμηματικό διπλασιασμό και ένα συμβάν διπλασιασμού σε σειρά, συμβάλλοντας επίσης στην εξέλιξη των γονιδίων CII. Σε προηγούμενη έκθεση, η υποοικογένεια CI στα φυτά συμπεριλαμβανομένης της ντομάτας, είναι πάντα η μεγαλύτερη (Waters, 2013), ωστόσο ο αριθμός των μελών CaHsp20 που ανήκουν στην υποοικογένεια CII είναι μεγαλύτερος (Εικόνα 3), κάτι που δεν συνάδει με αυτόν των άλλων φυτών. Ο λόγος μπορεί να αποδοθεί στα γονίδια CaHsp20 της υποοικογένειας CII που εμφανίστηκαν μετά την ειδογένεση μέσω πολλαπλών γονιδίων διπλασιασμού. Λόγω της άποψης ότι ο διπλασιασμός γονιδίων σε συνδυασμό συμβαίνει κυρίως στις πρωτεΐνες μεμβρανών που κωδικοποιούνται από γονίδια και στις πρωτεΐνες που σχετίζονται με το στρες, μπορούμε να προτείνουμε ότι οι κυρίαρχοι διπλασιασμοί στα γονίδια CaHsp20 μπορεί να σχετίζονται με το γεγονός ότι τα CaHsp20 ρυθμίζονται από το HS (Cannon et al. ., 2004· Rizzon et al., 2006· Hanada et al., 2008· Giorno et al., 2012). Ο 0 εμφάνισε ένα συμβάν τμηματικού διπλασιασμού και ένα συμβάν διπλασιασμού, συμβάλλοντας επίσης στην εξέλιξη των γονιδίων CII. Σε προηγούμενη έκθεση, η υποοικογένεια CI στα φυτά συμπεριλαμβανομένης της ντομάτας, είναι πάντα η μεγαλύτερη (Waters, 2013), ωστόσο ο αριθμός των μελών CaHsp20 που ανήκουν στην υποοικογένεια CII είναι μεγαλύτερος (Εικόνα 3), κάτι που δεν συνάδει με αυτόν των άλλων φυτών. Ο λόγος μπορεί να αποδοθεί στα γονίδια CaHsp20 της υποοικογένειας CII που εμφανίστηκαν μετά την ειδογένεση μέσω πολλαπλών γονιδίων διπλασιασμού. Λόγω της άποψης ότι ο διπλασιασμός γονιδίων σε συνδυασμό συμβαίνει κυρίως στις πρωτεΐνες μεμβρανών που κωδικοποιούνται από γονίδια και στις πρωτεΐνες που σχετίζονται με το στρες, μπορούμε να προτείνουμε ότι οι κυρίαρχοι διπλασιασμοί στα γονίδια CaHsp20 μπορεί να σχετίζονται με το γεγονός ότι τα CaHsp20 ρυθμίζονται από το HS (Cannon et al. ., 2004· Rizzon et al., 2006· Hanada et al., 2008· Giorno et al., 2012). Ο 0 εμφάνισε ένα συμβάν τμηματικού διπλασιασμού και ένα συμβάν διπλασιασμού, συμβάλλοντας επίσης στην εξέλιξη των γονιδίων CII. Σε προηγούμενη έκθεση, η υποοικογένεια CI στα φυτά συμπεριλαμβανομένης της ντομάτας, είναι πάντα η μεγαλύτερη (Waters, 2013), ωστόσο ο αριθμός των μελών CaHsp20 που ανήκουν στην υποοικογένεια CII είναι μεγαλύτερος (Εικόνα 3), κάτι που δεν συνάδει με αυτόν των άλλων φυτών. Ο λόγος μπορεί να αποδοθεί στα γονίδια CaHsp20 της υποοικογένειας CII που εμφανίστηκαν μετά την ειδογένεση μέσω πολλαπλών γονιδίων διπλασιασμού. Λόγω της άποψης ότι ο διπλασιασμός γονιδίων σε συνδυασμό συμβαίνει κυρίως στις πρωτεΐνες μεμβρανών που κωδικοποιούνται από γονίδια και στις πρωτεΐνες που σχετίζονται με το στρες, μπορούμε να προτείνουμε ότι οι κυρίαρχοι διπλασιασμοί στα γονίδια CaHsp20 μπορεί να σχετίζονται με το γεγονός ότι τα CaHsp20 ρυθμίζονται από το HS (Cannon et al. ., 2004· Rizzon et al., 2006· Hanada et al., 2008· Giorno et al., 2012).
Τα ειδικά για τον ιστό πρότυπα έκφρασης των γονιδίων Hsp20 έχουν αναφερθεί σε διάφορα είδη, όπως το Arabidopsis, το ρύζι και η σόγια, ωστόσο, δεν υπάρχει ομοιόμορφο πρότυπο γονιδιακής έκφρασης για όλα τα φυτικά γονίδια Hsp20 (Lopes-Caitar et al., 2013 Waters, 2013). Τα περισσότερα γονίδια CaHsp20 δεν έχουν καθόλου ή έχουν χαμηλή έκφραση στους τέσσερις εξεταζόμενους ιστούς (ρίζα, στέλεχος, φύλλο και άνθος) από τη θερμοανεκτική γραμμή πιπεριάς R9 υπό κανονικές συνθήκες θερμοκρασίας, αλλά επάγονται έντονα από το HS (Εικόνα 6), το οποίο είναι σε μεγάλο βαθμό σύμφωνο με το προηγουμένως αναφέρθηκε ότι σχεδόν όλα τα φυτικά sHsps προκαλούνται από θερμότητα. Μεταξύ των 35 γονιδίων CaHsp20, το CaHsp23.8 διαθέτει το πιο χαρακτηριστικό μοτίβο έκφρασης σε σύγκριση με άλλα γονίδια CaHsp20, το οποίο εκφράζεται συστατικά σε μίσχους, φύλλα και άνθη, αλλά σχεδόν καθόλου επαγωγή από το HS. Ο Waters (2013) ανέφερε ότι το AtHsp21. Το γονίδιο 7CV που στερείται δραστηριότητας συνοδού από το Arabidopsis εκφράζεται συστατικά σε βλαστούς και δεν ρυθμίζεται προς τα πάνω από το HS, επομένως, μπορεί να υποτεθεί ότι το CaHsp23.8 μπορεί επίσης να μην έχει τη δράση συνοδού, αλλά χρειάζεται περισσότερα επιστημονικά στοιχεία. Επιπλέον, η έκφραση των CaHsp16.6b, 16.7, 17.7a, 17.7b και 18.2a ανιχνεύθηκε σε διάφορους ιστούς υπό κανονικές συνθήκες, μπορούμε να προτείνουμε ότι αυτά τα γονίδια παρουσιάζουν συγκεκριμένες δραστηριότητες καθαριότητας όπως με ορισμένα γονίδια Hsp20 από ρύζι και σόγια ( Ouyang et al., 2009· Lopes-Caitar et al., 2013).
Έχει αποδειχθεί ότι τα sHsps σχετίζονται με τη θερμοανεκτικότητα σε διάφορα είδη φυτών, ωστόσο, υπάρχουν πολλά Hsp20 σε φυτά που μπορεί να οδηγήσουν σε πλεονασμό της λειτουργίας μεμονωμένων γονιδίων (Sun and MacRae, 2005· Waters, 2013). Η ολοκληρωμένη ανάλυση της έκφρασης για μεμονωμένα μέλη Hsp20 υπό HS είναι απαραίτητη για περαιτέρω εις βάθος λειτουργικές αναλύσεις των γονιδίων Hsp20 στη θερμοανεκτικότητα των φυτών. Σε αυτή τη μελέτη, αναλύθηκε η δυναμική έκφραση και των 35 CaHsp20 στη θερμοευαίσθητη γραμμή Β6 και στη θερμοανεκτική γραμμή R9 με επεξεργασία HS (Εικόνα 7). Σχεδόν όλα τα γονίδια CaHsp20 επάγονται από θεραπεία HS στη σειρά B6 και R9, υποδεικνύοντας ότι η συσσώρευση των CaHsp20s μειώνει αποτελεσματικά τη βλάβη από το HS και ενισχύει τη θερμοανοχή του πιπεριού δεσμεύοντας μετουσιωτικές πρωτεΐνες και αποτρέποντάς τους από μη αναστρέψιμη συσσώρευση (Haslbeck and Vierling, 2015). Είναι ευρέως γνωστό ότι τα Hsfs ενεργοποιούνται υπό συνθήκες HS και στη συνέχεια δεσμεύουν τα στοιχεία HSE των προαγωγέων των γονιδίων Hsp για να ρυθμίσουν την έκφραση των γονιδίων Hsp προς τα κάτω. Τα αποτελέσματα ότι οι περιοχές προαγωγέα των γονιδίων CaHsp20 περιέχουν διάφορα στοιχεία cis (Εικόνα 8) και τα CaHsp20s μπορούν να αλληλεπιδράσουν με πολλά λειτουργικά γονίδια (Εικόνα 5) υποδηλώνουν ότι το δίκτυο ρύθμισης έκφρασης των γονιδίων CaHsp20 υπό συνθήκες HS είναι μια σύνθετη οδός μεταγωγής σήματος, όχι απλά Hsfs. Αυτή η υπόθεση μπορεί να υποστηριχθεί από την παρατήρηση ότι ορισμένα γονίδια CaHsp20 (CaHsp16.6a, 17.7a, 18.7, 21.2, 22.6 και 24. 3) των οποίων οι περιοχές προαγωγέα (–1500 bp) δεν περιέχουν τα HSEs μπορεί να προκληθούν σε μεγάλο βαθμό από τη θεραπεία HS. Παραδόξως, τα γονίδια CaHsp17.7a και 17.7b βρίσκονται σε διπλό διπλασιασμό και μοιράζονται παρόμοιο μοτίβο έκφρασης και στις δύο γραμμές B6 και R9 με θεραπεία HS, ωστόσο, ένα άλλο ζεύγος διπλασιασμού CaHsp18.2a και 18.2b εμφανίζει διαφορετικά μοτίβα έκφρασης και στις δύο γραμμές B6 και R9, έτσι φαίνεται ότι δεν έχουν όλα τα μέλη της ίδιας υποοικογένειας sHsp τα ίδια μοτίβα έκφρασης (Waters, 2013). Αξίζει να σημειωθεί ότι η κορυφή της έκφρασης των περισσότερων γονιδίων CaHsp20 στο R9 (HS για 0,5 ή 1 ώρα) εμφανίστηκε νωρίτερα από ό,τι στο B6 (HS για 2 ή 4 ώρες), γεγονός που μπορεί να υποδηλώνει ότι όταν πάσχετε από HS, η θερμοανεκτική πιπεριά Η γραμμή R9 μπορεί να ξεκινήσει τον μηχανισμό θερμικής απόκρισης γρηγορότερα από τη θερμοευαίσθητη γραμμή B6, ωστόσο,
συμπεράσματα
Σε αυτή τη μελέτη, διεξήχθη μια ανάλυση σε όλο το γονιδίωμα της οικογένειας γονιδίων CaHsp20 στην πιπεριά για να αποκαλύψει τη γονιδιακή δομή, τη φυλογενετική σχέση, την εξέλιξη και τα προφίλ έκφρασης σε διαφορετικούς ιστούς (ρίζα, στέλεχος, φύλλα και άνθος) και συνθήκες HS. Τα περισσότερα γονίδια CaHsp20 διατήρησαν το χαμηλό επίπεδο έκφρασης υπό κανονικές συνθήκες θερμοκρασίας και μπορούσαν να προκληθούν σε μεγάλο βαθμό από το HS, υποδεικνύοντας ότι έπαιξαν βασικό ρόλο στη διαδικασία της θερμοανοχής που αποκτήθηκε από το πιπέρι. Τα δεδομένα σε αυτή τη μελέτη θα αποτελέσουν τη βάση για τον λειτουργικό χαρακτηρισμό των μελών της οικογένειας CaHsp20 και θα συμβάλουν στον φωτισμό του μηχανισμού της θερμοανοχής που αποκτάται από το πιπέρι, ακόμη και στην προσαρμοστικότητα του πιπεριού σε άλλες συνθήκες στρες.
Δήλωση Σύγκρουσης Συμφερόντων
Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη απουσία εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.
Ευχαριστίες
Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant No. 31272163, 31572114), τα Shaanxi Agriculture Science and Technology Projects (Grant No. 2014K01-14-01), Jiangsu Agriculture Science and Technology Innovation Fund [CX(12 )1004], το Opening Fund of Key Laboratory for Crop Biotechnology of Xinjiang Uygur αυτόνομης περιοχής (Grant No. XJYS0302-2014-03) και το Tang Zhongying Fund for Breeding of Northwest Aamp;F University.
Συμπληρωματικό υλικό
Το συμπληρωματικό υλικό για αυτό το άρθρο βρίσκεται στο διαδίκτυο στη διεύθυνση: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2015.00806
Εικόνα S1. Το λογικό διάγραμμα ροής της ταυτοποίησης των γονιδίων πιπεριού Hsp20 .
Πίνακας S1. Τα αναγνωριστικά γονιδίων των μελών Hsp20 από Arabidopsis , ντομάτα, καλαμπόκι και ρύζι .
Πίνακας S2. Αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιούνται για ημι-ποσοτική RT-PCR και ποσοτική ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο .
Capsicum annuum L., γονίδια CaHsp20, Θερμικό στρες, προφίλ έκφρασης, οικογένεια γονιδίων