Αναγνώριση και ανάλυση έκφρασης σε όλο το γονιδίωμα της οικογένειας πρωτεϊνών τύπου Tubby στο γονιδίωμα Malus domestica

State Key Laboratory of Crop Biology, College of Life Science, Shandong Agricultural University, Taian, Κίνα

Οι πρωτεΐνες τύπου Tubby (TLPs), οι οποίες έχουν μια εξαιρετικά διατηρημένη περιοχή σωλήνων β βαρελιού, έχει βρεθεί ότι σχετίζονται με ορισμένα ειδικά για τα ζώα χαρακτηριστικά. Στο φυτικό βασίλειο, περισσότερα από 10 μέλη της οικογένειας TLP εντοπίστηκαν στο Arabidopsis, το ρύζι και τον αραβόσιτο και βρέθηκε ότι εμπλέκονται σε αντιδράσεις στο στρες. Η δημοσίευση του γονιδιώματος του μήλου καθιστά εφικτή τη συστηματική μελέτη της οικογένειας TLP στο μήλο. Σε αυτή την έρευνα, ταυτοποιήθηκαν εννέα γονίδια που κωδικοποιούν TLP (συντομία TLP). Όταν συνδυάστηκαν με τα TLP από άλλα είδη φυτών, τα TLP χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες (ομάδα Α, Β και Γ). Τα περισσότερα μέλη TLP φυτών στην ομάδα Α περιείχαν μια πρόσθετη περιοχή F-box στο Ν-άκρο. Ωστόσο, δεν εντοπίστηκε κοινός τομέας εκτός από τον τομέα tubby είτε στην ομάδα Β είτε στην ομάδα C. Μια ανάλυση των κυλινδρικών περιοχών των MdTLPs εντόπισε τρεις τύπους διατηρημένων μοτίβων. Το μοτίβο 1 και 2, τα μοτίβα υπογραφής στα επιβεβαιωμένα TLPs, ήταν πάντα παρόντα στα MdTLPs, ενώ το μοτίβο 3 απουσίαζε από την ομάδα Β. Η μοντελοποίηση ομολογίας έδειξε ότι ο τομέας κυλινδρικού σωλήνα των περισσότερων MdTLPs είχε κλειστό β κύλινδρο, όπως στις περιοχές σωλήνων ζώων. Το προφίλ έκφρασης αποκάλυψε ότι τα γονίδια MdTLP εκφράστηκαν σε πολλαπλά όργανα και ήταν άφθονα στις ρίζες, τους μίσχους και τα φύλλα αλλά με λίγα άνθη. Μια ανάλυση των στοιχείων που δρουν cis έδειξε ότι τα στοιχεία που σχετίζονται με την απόκριση στο στρες ήταν επικρατέστερα στις αλληλουχίες υποκινητή των MdTLP. Το προφίλ έκφρασης με qRT-PCR έδειξε ότι σχεδόν όλα τα MdTLP ρυθμίστηκαν προς τα πάνω σε κάποιο βαθμό υπό αβιοτικό στρες, εξωγενείς θεραπείες ABA και H2O2 σε φύλλα και ρίζες, αν και διαφορετικά μέλη MdTLP παρουσίαζαν διαφορετικά φύλλα και ρίζες. Τα αποτελέσματα και οι πληροφορίες παραπάνω μπορεί να παρέχουν μια βάση για περαιτέρω διερεύνηση της λειτουργίας του TLP στα φυτά.

Εισαγωγή

Οι πρωτεΐνες τύπου Tubby (TLPs) υπάρχουν σε όλους τους ευκαρυώτες, από μονοκύτταρους έως πολυκύτταρους οργανισμούς (Liu, 2008), συμπεριλαμβανομένων των Caenorthabditis elegans, Drosophila, Arabidopsis, ρυζιού, καλαμποκιού, κοτόπουλου και ποντικού (North et al., 1997; Heikenwalder et al., 2001· Ronshaugen et al., 2002· Figlewicz et al., 2004). Τα TLP έχουν μια τυπική περιοχή σωλήνων που σχηματίζει έναν κλειστό β κύλινδρο με 12 αντιπαράλληλους κλώνους και μια κεντρική υδρόφοβη α έλικα (Boggon et al., 1999). Ο αριθμός των TLP κυμαίνεται από 4 στον άνθρωπο έως 15 στον αραβόσιτο (Stone and Callis, 2007; Yulong et al., 2016). Η κατανομή αυτής της οικογένειας σε πολλά είδη υποδηλώνει ότι αυτές οι πρωτεΐνες έχουν μια βασική λειτουργία. Στα θηλαστικά, τα γονίδια TLP παίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση και τη λειτουργία των νευρωνικών κυττάρων και η μετάλλαξη αυτών των γονιδίων μπορεί να οδηγήσει σε παχυσαρκία, απώλεια όρασης και ακοής, στειρότητα, και αντίσταση στην ινσουλίνη (Coleman and Eicher, 1990· Heckenlively et al., 1995· Kleyn et al., 1996· Noben-Trauth et al., 1996). Οι πρωτεΐνες Tubby μπορούν να λειτουργήσουν ως διμερείς μεταγραφικοί ρυθμιστές δεσμεύοντας σε δίκλωνο DNA και ενεργοποιώντας τη μεταγραφή στον πυρήνα (Boggon et al., 1999; Santagata et al., 2001). Παρά το γεγονός ότι οι περιοχές σωλήνων είναι εξαιρετικά διατηρημένες, διαφορετικά μέλη TLP ζώων δεν είναι σε θέση να αντισταθμίσουν το ένα το άλλο ως προς τη λειτουργία τους (Ikeda et al., 1999).

Τα φυτικά TLP περιέχουν ένα διατηρημένο C-τερματικό κυλινδρικό πεδίο. Ωστόσο, σε αντίθεση με τα ζωικά TLP, τα περισσότερα φυτικά TLP περιέχουν επίσης εξαιρετικά διατηρημένες περιοχές F-box στο Ν-άκρο τους (Gagne et al., 2002· Lai et al., 2004). Οι πρωτεΐνες που περιέχουν F-box εμπλέκονται στην ουβικιτίνη πρωτεϊνών ενεργώντας ως γέφυρες μεταξύ συγκεκριμένων υποστρωμάτων και γενικών συστατικών της λιγάσης ουβικιτίνης τύπου SCF (Skp1-Cullin-F-box) ή τύπου ECS (ElonginC-cullin-SOCS-box) λιγάσης ουβικιτίνης E3 σύμπλοκα (Kile et al., 2002). Σε σύγκριση με το ευρύ φάσμα κυτταρικών λειτουργιών που προσδιορίζονται για τα ζωικά TLP, οι λειτουργίες και οι μηχανισμοί των φυτικών TLP είναι σχετικά άγνωστοι. Στο Arabidopsis, οι AtTLP9 και AtTLP3 εμπλέκονται στη σηματοδότηση ABA κατά τη διάρκεια της βλάστησης (Lai et al., 2004). Το AtTLP9 παίζει επίσης ρόλο στις αποκρίσεις στο αλάτι και το στρες ξηρασίας (Bao et al., 2014). Η υπερέκφραση ενός TLP από ρεβίθια αποδείχθηκε πρόσφατα ότι προσδίδει αυξημένη ανοχή στο αλάτι, την ξηρασία και το οξειδωτικό στρες (Wardhan et al., 2012). Επιπλέον, δύο μελέτες σε ρύζι έδειξαν ότι τα TLP παίζουν σημαντικό ρόλο στις αλληλεπιδράσεις ξενιστή-παθογόνου (Cai et al., 2008; Kou et al., 2009). Εντούτοις, η εξαιρετικά διατηρημένη εξέλιξη των πρωτεϊνών σωλήνων (ή σωληνοειδών) και ο πλεονασμός τους υποδηλώνει ότι παίζουν έναν απαραίτητο ρόλο στα φυτά.

Ως ένα από τα πιο ευρέως καλλιεργούμενα οπωροφόρα δέντρα, η μηλιά (Malus domestica) είναι επίσης ένα από τα πιο σημαντικά οικονομικά ξυλώδη φυτά (Hummer and Janick, 2009). Η ολοκλήρωση του χάρτη γονιδιώματος του μήλου (Malus domestica) προσφέρει τη δυνατότητα διερεύνησης της οικογένειας γονιδίων TLP σε αυτό το είδος (Velasco et al., 2010). Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η έκφραση μιας πρωτεΐνης apple tubby (TLP7) μπορεί να ενισχύσει την ανοχή στο στρες (Du et al., 2014). Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε μια έρευνα σε όλο το γονιδίωμα των γονιδίων TLP στο γονιδίωμα της μήλου και αναλύσαμε τις χρωμοσωμικές κατανομές, τους λειτουργικούς τομείς και τα πρότυπα έκφρασης σε διαφορετικά όργανα και διεργασίες. Η τρισδιάστατη δομή της περιοχής tubby και τα διατηρημένα μοτίβα μοντελοποιήθηκαν περαιτέρω και χαρακτηρίστηκαν. Το μεταγραφικό προφίλ κατέδειξε μοτίβα έκφρασης ειδικά οργάνου για μεμονωμένα γονίδια TLP. Η έκφραση ορισμένων MdTLP βρέθηκε να είναι ευαίσθητη στο αβιοτικό στρες, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα γονίδια της οικογένειας TLP μπορεί να είναι ζωτικής σημασίας για την απόκριση και την προσαρμογή σε αβιοτικά στρες στο μήλο. Αυτή η μελέτη παρέχει ένα θεμέλιο για την περαιτέρω λειτουργική ανάλυση των φυτικών TLPs.

Υλικά και μέθοδοι

Αναγνώριση MdTLP στο γονιδίωμα της Apple

Χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικές προσεγγίσεις για τον εντοπισμό των MdTLP στο γονιδίωμα της μήλου. Για την πρώτη προσέγγιση, οι δημοσιευμένες αλληλουχίες πρωτεΐνης Arabidopsis TLP ανακτήθηκαν από τη βάση δεδομένων TIGR ¹ και χρησιμοποιήθηκαν ως ερωτήματα σε αναζητήσεις BLASTP έναντι της βάσης δεδομένων γονιδιώματος Malus domestica (Malus domestica Genome v1.0 ²). Προηγούμενες μελέτες απέτυχαν να ανιχνεύσουν το AtTLP4 στο Arabidopsis χρησιμοποιώντας διάφορες πειραματικές προσεγγίσεις, υποδηλώνοντας ότι μπορεί να είναι ψευδογονίδιο (Lai et al., 2004; Bao et al., 2014). Έτσι, χρησιμοποιήσαμε 10 αλληλουχίες πρωτεΐνης Arabidopsis TLP ως ερωτήματα. Για να αποφευχθεί ο αποκλεισμός οποιωνδήποτε πιθανών υποψηφίων, η τιμή αποκοπής E-value ορίστηκε στο 0,001, όπως είχε γίνει προηγουμένως σε παρόμοια έρευνα (Li et al., 2011; Jia et al., 2013; Cui et al., 2015). Οι περιττές αλληλουχίες με τους ίδιους αριθμούς πρόσβασης αφαιρέθηκαν από το σύνολο δεδομένων. Στη συνέχεια, οι ανακτηθείσες αλληλουχίες ερωτήθηκαν στη βάση δεδομένων InterPro ³ για να εξασφαλιστεί η παρουσία τομέων tubby (Mitchell et al., 2015). Για τη δεύτερη προσέγγιση, το Tuby-domain Hidden Markov Model Profile, το οποίο κατέβηκε από το Pfam ⁴βάσης δεδομένων, χρησιμοποιήθηκε ως ερώτημα για την αναζήτηση όλων των σχολιασμένων πρωτεϊνών στην πλήρη βάση δεδομένων γονιδιώματος της Apple ² χρησιμοποιώντας HMMER 3.0 (Eddy, 1998). Οι αλληλουχίες των υποψήφιων πρωτεϊνών εξήχθησαν με σενάριο Perl και στη συνέχεια εξετάστηκαν για τον τομέα tubby χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων InterPro. Όλες οι αλληλουχίες που ταυτοποιήθηκαν μέσω αυτών των δύο μεθόδων υποβλήθηκαν στο SMART ⁵ για να διασφαλιστεί η ακεραιότητα της αλληλουχίας του τομέα tubby. Διεξήχθη μια αναζήτηση BLASTN (τιμή E ≤E ^{-100 ) στο σύνολο δεδομένων EST της Apple για να βρεθεί η αντίστοιχη εγγραφή έκφρασης για κάθε υποτιθέμενο μέλος της οικογένειας}⁶ .

Πολλαπλές Ευθυγραμμίσεις και Φυλογενετική Ανάλυση

Ευθυγραμμίσεις πολλαπλών αλληλουχιών των αλληλουχιών αμινοξέων TLP σε μήλο (MdTLP1-9), Arabidopsis (AtTLP1-3, AtTLP5-11), ρύζι (OsTLP1-14) και αραβόσιτο (ZmTLP1-15) πραγματοποιήθηκαν με ClustalX (Έκδοση 1 2) ^. ) (Saitou and Nei, 1987· Larkin et al., 2007). Για να βεβαιωθείτε ότι όλες οι ακολουθίες ήταν σωστά ευθυγραμμισμένες, οι ακολουθίες του τομέα tubby προσαρμόστηκαν πρώτα χειροκίνητα και, στη συνέχεια, αφέθηκαν οι άλλες περιοχές να ευθυγραμμιστούν εκ νέου, χρησιμοποιώντας το λογισμικό CLC Sequence Viewer 7 ⁸ . Ένα μη ριζωμένο φυλογενετικό δέντρο κατασκευάστηκε από τις ευθυγραμμίσεις των αλληλουχιών πρωτεΐνης πλήρους μήκους σύμφωνα με τη μέθοδο γειτονικής ένωσης με 1.000 επαναλήψεις και το φυλογενετικό δέντρο σχεδιάστηκε με το πρόγραμμα MEGA5 (Tamura et al., 2011).

Χρωμοσωμική Θέση και Προσδιορισμός της Δομής Εξονίου/Εντρονίου

Τα δεδομένα χρωμοσωμικής τοποθεσίας ανακτήθηκαν από σχολιασμούς γονιδιώματος μήλου που λήφθηκαν από τη βάση δεδομένων γονιδιώματος για Rosaceae ⁹ . Ο χάρτης χρωμοσωμάτων που δείχνει τη φυσική θέση όλων των γονιδίων MdTLP δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας μια αναθεωρημένη έκδοση του MapDraw (Liu and Meng, 2003). Για να εξερευνήσουμε τις ποικίλες οργανώσεις εξωνίου-ιντρονίου των MdTLPs και AtTLPs (AtTLP1-3, AtTLP5-11), συγκρίναμε τις προβλεπόμενες κωδικοποιητικές αλληλουχίες των MdTLP και AtTLP με τις αντίστοιχες γονιδιωματικές αλληλουχίες τους χρησιμοποιώντας το λογισμικό GSDS 10 (Hu et al., ⁾ . Το μοριακό βάρος και το ισοηλεκτρικό σημείο (ρΙ) των πρωτεϊνών υπολογίστηκαν με το Πρόγραμμα ExPASY Compute pI/Mw ¹¹ (Wilkins et al., 1999).

Προσδιορισμός πρόσθετων τομέων και υποκυτταρικών θέσεων πρωτεΐνης

Για τον εντοπισμό πιθανών πρωτεϊνικών μοτίβων και την ανίχνευση τυχόν πρόσθετων περιοχών εκτός των περιοχών apple tubby, ερωτήθηκαν αλληλουχίες πλήρους μήκους MdTLP έναντι της βάσης δεδομένων InterPro ¹² (Mitchell et al., 2015). Οι υποκυτταρικές θέσεις πρωτεΐνης προβλέφθηκαν χρησιμοποιώντας WoLF PSORT ¹³ , μια επέκταση του προγράμματος PSORT II (Horton et al., 2007).

Ανάλυση μοτίβων και μοντελοποίηση ομολογίας του τομέα Tubby

Όλα τα υποτιθέμενα MdTLP αναλύθηκαν από το MEME (έκδοση 4.11.1 ¹⁴ ), ένα εργαλείο αναζήτησης μοτίβων για τον εντοπισμό διατηρημένων μοτίβων τομέων tubby (Bailey et al., 2009). Για να ληφθούν τα πιο σημαντικά συντηρημένα μοτίβα στα εννέα MdTLP, δοκιμάστηκαν διαφορετικοί αριθμοί μοτίβων με προεπιλεγμένες παραμέτρους σε κανονική λειτουργία. Τα αναγνωρισμένα μοτίβα σχολιάστηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης πρωτεϊνών SMART ¹⁵ .

Η τρισδιάστατη δομή του τομέα tubby λήφθηκε με μοντελοποίηση ομολογίας χρησιμοποιώντας τον ιστότοπο CPHmodels 3.2 Server ¹⁶ . Οι εικόνες δημιουργήθηκαν στο πακέτο μοντελοποίησης PyMOL v1.5 ¹⁷ (Nielsen et al., 2010).

Αναζήτηση στοιχείων cis-Acting στο Promoters of MdTLPs

Για τη διερεύνηση στοιχείων που δρουν cis στις αλληλουχίες προαγωγέα των MdTLPs, ελήφθησαν 1.500 bp αλληλουχίας γονιδιωματικού DNA ανάντη των θέσεων έναρξης της μεταγραφής από το γονιδίωμα της μήλου. Οι ανοδικές αλληλουχίες στη συνέχεια σαρώθηκαν στη βάση δεδομένων PlantCARE ¹⁸ για την παρουσία διαφόρων cis-ενεργών στοιχείων (Lescot et al., 2002).

Παρασκευή δείγματος και εξαγωγή ολικού RNA

Για τη διερεύνηση της έκφρασης των MdTLP υπό αβιοτικό στρες, δενδρύλλια μήλων 3 ετών (Malus sieversii) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με ψύξη στους 4°C, 20% PEG6000, 100 mM H2O2 ή 100 μM ABA για 0, 1, 3, 6 και 9 ώρες. Τα φύλλα και οι ρίζες από πέντε μεμονωμένα φυτά συλλέχθηκαν, τοποθετήθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80°C μέχρι περαιτέρω χρήση. Όσον αφορά τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν για έκφραση ειδικής οργάνου, συλλέχθηκαν διαφορετικά όργανα και αποθηκεύτηκαν επίσης στους -80°C. Το ολικό RNA απομονώθηκε από τα φύλλα χρησιμοποιώντας τη διαδικασία CTAB (Gasic et al., 2004). Οι συγκεντρώσεις RNA και οι αναλογίες Α260/Α280 προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop (ND-1000 Spectrophotometer, Peqlab). Η ακεραιότητα των δειγμάτων RNA εξετάστηκε με έναν Agilent 2100 Bioanalyzer (RNA Nano Chip, Agilent, Santa Clara, CA, USA).

Ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR (qRT-PCR).

Τα θραύσματα cDNA συντέθηκαν από ολικό RNA χρησιμοποιώντας TransScript ^ΤΜΈνα βήμα αφαίρεσης gDNA και σύνθεση cDNA SuperMix (TransGen Biotech, Πεκίνο, Κίνα). Για να διασφαλιστεί ότι τα δείγματα cDNA που ελήφθησαν ήταν πιστοποιημένα, δύο γονίδια ειδικά για το στρες (γονίδια DREB: MDP0000147009 και MDP0000218344) στο γονιδίωμα της μήλου επιλέχθηκαν ως γονίδια-δείκτες, οι εκφράσεις των οποίων έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζονται προς τα πάνω κάτω από θεραπείες στρες (Zhao et al., 2012). Οι ειδικοί για το γονίδιο εκκινητές για ενίσχυση από cDNA σχεδιάστηκαν με βάση τις αλληλουχίες γονιδίων-στόχων χρησιμοποιώντας το λογισμικό Beacon Designers 8.10. Οι αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιούνται σε αυτήν την έρευνα παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1. Το qRT-PCR πραγματοποιήθηκε με σύστημα CFX96 σε πραγματικό χρόνο (Bio-Rad, ΗΠΑ) σε τελικό όγκο 20 μl που περιείχε 0,8 μl cDNA, 10 μl 2 × SYBR Premix Ex Taq (SYBR Green; Tiangen, Κίνα) και 0,8 μl εκκινητών (10 μΜ). Οι συνθήκες θερμικού κύκλου ήταν οι εξής: 44 κύκλοι μετουσίωσης 95°C για 15 δευτερόλεπτα, ανόπτηση 55°C για 30 δευτερόλεπτα και επέκταση 72°C για 15 δευτερόλεπτα. Το γονίδιο της ακτίνης του μήλου χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Το πείραμα PCR πραγματικού χρόνου διεξήχθη τουλάχιστον τρεις φορές υπό ίδιες συνθήκες. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης υπολογίστηκαν ως 2^-(Δ^C^{για τη θεραπεία-Δ}^C^{για τον έλεγχο)} . Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των MdTLPs σε δείγματα υπό πίεση (1, 3, 6 και 9 ώρες) συγκρίθηκαν με τους ελέγχους (0 h) με παραμετρική μονόδρομη ANOVA σε επίπεδα σημαντικότητας P ≤ 0,05 και P ≤ 0,01.

Αποτελέσματα

Ταυτοποίηση ευρείας γονιδιώματος και φυλογενετική ανάλυση των MdTLPs στην Apple

Για τον εντοπισμό των γονιδίων που κωδικοποιούν την πρωτεΐνη TLP στο μήλο, χρησιμοποιήθηκαν δύο προσεγγίσεις. Για την πρώτη στρατηγική, οι αλληλουχίες πεπτιδίων των TLP του Arabidopsis χρησιμοποιήθηκαν ως ερωτήματα BLAST έναντι του γονιδιώματος της μήλου (Malus domestica Genome v1.0). Για να εξασφαλιστεί ότι οι πιθανοί TLPs δεν αποκλείστηκαν και για να ληφθούν αξιόπιστα αποτελέσματα, η τιμή E ορίστηκε στο 0,001, όπως έγινε σε μια παρόμοια έρευνα (Li et al., 2011; Jia et al., 2013; Cui et al., 2015 ). Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, 25 πιθανά TLPs εντοπίστηκαν στο γονιδίωμα της μήλου. Για να προσδιοριστεί εάν αυτές οι πρωτεΐνες περιείχαν περιοχές σωλήνων, οι αλληλουχίες συγκρίθηκαν με τη βάση δεδομένων InterPro. Χρησιμοποιώντας αυτήν την προσέγγιση, οκτώ πιθανά TLP αναγνωρίστηκαν από το γονιδίωμα της μήλου. Για τη δεύτερη στρατηγική, ο τομέας tubby Hidden Markov Model Profile (Pfam01167) από τη βάση δεδομένων Pfam ¹⁹χρησιμοποιήθηκε για την αναζήτηση του γονιδιώματος του μήλου. Συνολικά ελήφθησαν 10 πιθανά TLP. Αυτές οι αλληλουχίες αναλύθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων InterPro και οκτώ πιθανά TLP περιείχαν μια περιοχή tubby. Όλα τα πιθανά TLP που λήφθηκαν από τις παραπάνω δύο στρατηγικές υποβλήθηκαν στη βάση δεδομένων SMART ²⁰ για να επαληθευτεί η ακεραιότητα της αλληλουχίας του πεδίου tubby και να επιβεβαιωθεί η παρουσία γονιδίων TLP μήλου. Τέλος, εντοπίστηκαν οκτώ γονίδια.

Στην προηγούμενη μελέτη μας, κλωνοποιήσαμε ένα γονίδιο TLP (με το όνομα MdTLP7) από το μήλο, του οποίου η έκφραση αυξήθηκε σημαντικά υπό ψυχρό στρες (Du et al., 2014). Ωστόσο, η αλληλουχία γονιδίου MdTLP7 δεν ήταν δυνατό να αναγνωριστεί στο δημοσιευμένο γονιδίωμα μήλου. Για να προσδιοριστεί εάν το MdTLP7 υπήρχε στο γονιδίωμα της μήλου και για να ελεγχθεί η έκφραση αυτού και άλλων ταυτοποιημένων γονιδίων TLP της μήλου, οι αλληλουχίες γονιδίων αναζητήθηκαν με βάση τη βάση δεδομένων Apple EST στο NCBI ²¹. Στην ανάλυση BLASTN, καθεμία από τις εννέα αλληλουχίες γονιδίων χτύπησε αρκετές αλληλουχίες ESTs της Apple (Συμπληρωματικός Πίνακας S2), γεγονός που έδειξε ότι αυτά τα εννέα γονίδια εκφράστηκαν πραγματικά στο μήλο. Επομένως, πιστεύουμε ότι το γονιδίωμα του μήλου περιέχει εννέα γονίδια MdTLP (Πίνακας 1). Για να παραμείνουμε συνεπείς με τις προηγούμενες μελέτες μας, το όνομα του γονιδίου MdTLP7 διατηρήθηκε και τα άλλα οκτώ γονίδια MdTLP ονομάστηκαν MdTLP1-6 και MdTLP8-9 με βάση την κατανομή τους στο φυλογενετικό δέντρο (Εικόνα 1). Τα πεπτίδια MdTLP σε μήκος κυμαίνονταν από 269 έως 693 αμινοξέα, με προβλεπόμενα μοριακά βάρη μεταξύ 29,9 και 78 kDa (Πίνακας 1).

ΠΙΝΑΚΑΣ 1. Πληροφορίες οικογένειας TLP για το apple.

ΣΧΗΜΑ 1. Φυλογενετικό δέντρο των πιθανών Md TLPs και των TLPs από Arabidopsis , ρύζι και αραβόσιτο που κατασκευάστηκε από την ClustalX (Έκδοση 2.1). Τα μήκη των κλαδιών δείχνουν την απόσταση. Η τιμή υποστήριξης του bootstrap μικρότερη από 50% ήταν κρυφή.

Η ευθυγράμμιση πολλαπλών αλληλουχιών έδειξε ότι όλα τα φυτικά TLP είχαν μια εξαιρετικά συντηρητική περιοχή σωληνοειδούς στο Ο-τελικό σχεδόν με ένα συντηρητικό υπόλειμμα προλίνης στην αρχή (Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Για να αποκτήσουμε μια εικόνα για τις εξελικτικές σχέσεις μεταξύ όλων των φυτικών πρωτεϊνών TLP, κατασκευάστηκε ένα φυλογενετικό δέντρο με βάση τις πλήρους μήκους αλληλουχίες αμινοξέων από μήλο, Arabidopsis, ρύζι και καλαμπόκι (Lai et al., 2004; Yang et al., 2008 Yulong et al., 2016). Όλα τα γονίδια που κωδικοποιούν TLP από τα παραπάνω τέσσερα είδη φυτών χωρίστηκαν σε τρεις διακριτές ομάδες: Α, Β και Γ (Εικόνα 1). Από 48 μέλη, 41 φυτικά TLP ανήκαν στην ομάδα Α και χωρίστηκαν περαιτέρω στις τέσσερις υποομάδες Α1–Α4. Η ομάδα Β περιείχε πέντε μέλη και η ομάδα Γ περιείχε μόνο δύο TLP αραβοσίτου. Η ομάδα Α και η ομάδα Β περιείχαν μέλη TLP τόσο από δικοτυλήδονα όσο και από μονοκοτυλήδονα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε ορισμένες περιπτώσεις, η εξελικτική σχέση των φυτικών TLPs μεταξύ δικοτυλήδονων και μονοκοτυλήδονων ήταν πιο στενή από εκείνη μεταξύ των δικοτυλήδονων ή μονοκοτυλήδονων (Εικόνα 1). Για παράδειγμα, το MdTLP9 ήταν πιο κοντά με το ZmTLP13 παρά με το MdTLP8 στην ομάδα Β (Εικόνα 1). Για να ελεγχθεί αν αυτό το αποτέλεσμα ήταν έγκυρο, ελέγχθηκε μια λεπτομερής στοίχιση ακολουθίας (Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Πράγματι, το MdTLP9 είχε υψηλότερη ομοιότητα με το ZmTLP13 από το MdTLP8 στις αλληλουχίες, ειδικά στο τμήμα της έλικας του πυρήνα α στην περιοχή κυλινδρικής περιοχής (που υποδεικνύεται στο πλαίσιο του Συμπληρωματικού Σχήματος S1). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα κύρια χαρακτηριστικά των φυτικών TLPs στην ομάδα Α και την ομάδα Β είχαν καθιερωθεί πριν από τη διάσπαση των φυτών δικοτυλήδονων-μονόκοτυλων. Τα TLP από το μήλο (MdTLPs) κατανεμήθηκαν σε δύο ομάδες, την ομάδα Α, συμπεριλαμβανομένων των Α1, Α2 και Α4, και την ομάδα Β (Εικόνα 1). Τα μέλη της υποομάδας Α3, Οι AtTLP3 και AtTLP9 από την Arabidopsis, έχουν μελετηθεί λεπτομερώς και έχει υποδειχθεί ότι εμπλέκονται στην απόκριση στο στρες (Lai et al., 2004; Reitz et al., 2012, 2013; Bao et al., 2014). Το εάν τα MdTLP στις διάφορες υποομάδες ή στις διαφορετικές ομάδες έχουν παρόμοιες λειτουργίες απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση.

MdTLPs χρωμοσωμική θέση, δομή γονιδίου, πρόσθετοι λειτουργικοί τομείς και ανάλυση υποκυτταρικού εντοπισμού

Με βάση τον χάρτη χρωμοσωμικής κατανομής των γονιδίων MdTLP που δημιουργήθηκε σε αυτή τη μελέτη, όλα τα γονίδια MdTLP κατανεμήθηκαν σε έξι από τα δεκαεπτά χρωμοσώματα μήλων, συμπεριλαμβανομένων των 8, 9, 10, 11, 15 και 17 (Συμπληρωματικό Σχήμα S2). Μόνο τα χρωμοσώματα 8 και 11 περιείχαν δύο MdTLP, ενώ άλλα MdTLP χαρτογραφήθηκαν σε διαφορετικά χρωμοσώματα. Τα MdTLP1 και MdTLP2 βρέθηκαν και τα δύο στα χρωμοσώματα 8, που βρίσκονται το ένα κοντά στο άλλο. Συγκεντρώθηκαν επίσης μαζί στο φυλογενετικό δέντρο. Για να κατανοηθεί η πιθανή δομική εξέλιξη των MdTLPs, η δομή ιντρονίων-εξονίων των MdTLPs και AtTLPs αναλύθηκε σε αυτή τη μελέτη (Συμπληρωματικό Σχήμα S3). Οι οργανώσεις ιντρονίων/εξονίων για όλα τα MdTLP προσδιορίστηκαν με βάση τη θέση των εξονίων και το μήκος του γονιδίου τους. Ο αριθμός των εσωνίων στα MdTLP ποικίλλει, κυμαινόμενος από 2 έως 9 (Συμπληρωματικό Σχήμα S3). Σε αντίθεση με άλλα MdTLP, Το MdTLP5 είχε πολύ μεγαλύτερα εσώνια, αν και ο αριθμός των εσωνίων (8) ήταν παρόμοιος με αυτόν των άλλων MdTLP. Τα MdTLPs στην ομάδα Β είχαν παρόμοια χαρακτηριστικά κατανομής δομής ιντρονίου-εξονίου.

Τα περισσότερα MdTLP στην ομάδα Α περιείχαν έναν επιπλέον λειτουργικό τομέα, έναν τομέα F-box στο Ν-άκρο (Εικόνα 2). Οι πρωτεΐνες που περιέχουν F-box αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια σε ευκαρυώτες, οι οποίοι χαρακτηρίζονται από μια διατηρημένη περιοχή F-box που αποτελείται από περίπου 50 αμινοξέα στο Ν-άκρο τους. Η εμφάνιση και των δύο περιοχών σε μία πρωτεΐνη υποδηλώνει ότι μια αλληλεπίδραση μεταξύ των περιοχών tubby και F-box μπορεί να παίζει ρόλο στις φυσιολογικές διεργασίες. Από εννέα MdTLP, τρία μέλη δεν είχαν τομέα F-box (MdTLP1, MdTLP8 και MdTLP9) (Εικόνα 2). Αν και αυτά τα μέλη ήταν αρκετά παρόμοια σε σχήματα πρωτεϊνικής δομής, οι πολλαπλές ευθυγραμμίσεις και η φυλογενετική ανάλυση έδειξαν ότι το MdTLP1 απείχε πολύ από τα MdTLP8 και MdTLP9 (Εικόνα 1, Συμπληρωματικό Σχήμα S1).

ΣΧΗΜΑ 2. Δομή και οργάνωση των Md TLPs στο apple. Εμφανίζεται η θέση του τομέα υπογραφής tubby και του τομέα F-box. Το όνομα του γονιδίου υποδεικνύεται στα αριστερά.

Η υποκυτταρική θέση των MdTLPs είχε προβλεφθεί και τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα 1. Τα περισσότερα MdTLP είχαν προβλεφθεί ότι βρίσκονται στον πυρήνα. Μόνο τα MdTLP2 και MdTLP3 στην υποομάδα Α1 προβλέφθηκε ότι εντοπίζονται σε χλωροπλάστες. Στα ποντίκια, τα TLP εντοπίστηκαν κυρίως εντός του πυρήνα ως παράγοντες μεταγραφής (Boggon et al., 1999). Εδώ, υποθέτουμε ότι τα πυρηνικά εντοπισμένα MdTLP μπορεί επίσης να λειτουργήσουν ως παράγοντες μεταγραφής. Απαιτούνται μελλοντικές έρευνες για να επιβεβαιωθεί πειραματικά η θέση τους και η δραστηριότητα του παράγοντα μεταγραφής.

Ανάλυση μοτίβων και τρισδιάστατης δομής του τομέα Tubby

Όλες οι αλληλουχίες πεπτιδίου MdTLP υποβλήθηκαν στο ΜΕΜΕ ²² , και τρεις τύποι μοτίβων ταυτοποιήθηκαν στην περιοχή κυλινδρικής περιοχής των MdTLPs (Εικόνα 3Α). Οι συναινετικές αλληλουχίες μοτίβων φαίνονται στο Σχήμα 3Β, με το ύψος κάθε στοιβαγμένου γράμματος να αντιπροσωπεύει την πιθανότητα αυτού του αμινοξέος να εμφανίζεται σε κάθε θέση. Τα μοτίβα 1 και 2 ήταν πιο διατηρημένα και συνήθως βρίσκονταν κοντά στο καρβοξυτελικό άκρο του πολυπεπτιδίου, φέρνοντας σημαντικά χαρακτηριστικά περιοχής σωλήνων παρόμοια με άλλα φυτικά και ζωικά TLP. Το μοτίβο 3 υπήρχε συχνά στη μέση της πρωτεΐνης με μια εξαιρετικά διατηρημένη αλληλουχία αμινοξέων (RGPRRM), υποδηλώνοντας ότι αυτή η αλληλουχία μπορεί να έχει μια σημαντική βιολογική λειτουργία.

ΣΧΗΜΑ 3. Διατηρημένα μοτίβα εννέα προβλεπόμενων κυλινδρικών τομέων Md TLP που ταυτοποιούνται με το πρόγραμμα MEME. (Α) Κατανομή των αναγνωρισμένων μοτίβων στον τομέα σωλήνων εννέα MdTLP. (Β) Συναινετική ακολουθία για υποτιθέμενα μοτίβα.

Οι τρισδιάστατες δομές των κυλινδρικών περιοχών MdTLP καθιερώθηκαν με μοντελοποίηση ομολογίας μιας κεντρικής α έλικας που περιβάλλεται από έναν β κύλινδρο (Εικόνα 4). Ορισμένα μέλη MdTLP είχαν μια τυπική αρχιτεκτονική σωλήνων με κλειστό β κύλινδρο που σχηματίζεται από 12 αντιπαράλληλους κλώνους και μια κεντρική α έλικα, για παράδειγμα, MdTLP1, MdTLP2, MdTLP7 και MdTLP8. Άλλα μέλη περιείχαν έναν ατελή β κύλινδρο (λιγότερο από 12 αντιπαράλληλους κλώνους) και μια κεντρική α έλικα, για παράδειγμα, MdTLP3, MdTLP4 και MdTLP6, που είχαν 10, 11 και 6 αντιπαράλληλα φύλλα, αντίστοιχα. Το MdTLP9 αποτελούνταν από έναν πλήρη β κύλινδρο χωρίς κεντρική α έλικα, ενώ ο MdTLP5 είχε έναν ατελή β κύλινδρο χωρίς κεντρική α έλικα. Οι διαφορές στις τρισδιάστατες δομές μπορεί να οδηγήσουν στη λειτουργική διαφοροποίηση διαφορετικών MdTLP.

ΣΧΗΜΑ 4. Μοντελοποίηση ομολογίας της περιοχής σωλήνων των Md TLPs. Η άλφα έλικα εμφανίζεται με ανοιχτό μπλε και η πτυχή βήτα εμφανίζεται με κόκκινο.

Ανάλυση Αλληλουχιών Προαγωγέα MdTLPs

Ο μεταγραφικός έλεγχος των γονιδίων που ανταποκρίνονται στο στρες είναι ένα κρίσιμο μέρος της απόκρισης των φυτών σε μια σειρά αβιοτικών και βιοτικών στρες. Οι παράγοντες μεταγραφής έχουν τη δυνατότητα να ενεργοποιούν ή να καταστέλλουν γονίδια μέσω αλληλουχιών που δρουν cis σε περιοχές προαγωγέα που ανταποκρίνονται σε συγκεκριμένες πιέσεις (Singh et al., 2002). Στα φυτά, ορισμένα TLP παίζουν ρόλο στις αποκρίσεις στο αβιοτικό στρες (Wardhan et al., 2012; Bao et al., 2014; Du et al., 2014). Πραγματοποιήθηκε έρευνα για υποτιθέμενα στοιχεία που δρουν cis εντός των 1.500 bp της γονιδιωματικής αλληλουχίας ανάντη των MdTLP 5′-UTRs. Πολλά στοιχεία που σχετίζονται με την απόκριση στο στρες βρέθηκαν στις περιοχές προαγωγέα των MdTLPs, συμπεριλαμβανομένων των στοιχείων μεταγραφικού παράγοντα ABRE, DRE, LTRE και MYB και MYC (Πίνακας 2). Τα στοιχεία MYB υπάρχουν σε όλους τους προαγωγείς MdTLP. Το MYB έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκεται σε ξηρασία που προκαλείται από το στρες, αποκρίσεις χαμηλής θερμοκρασίας, αλατιού και ΑΒΑ (Xiong et al., 2002; Dai et al., 2007). Το ABRE ανταποκρίνεται στην ξηρασία και το ABA μέσω πρωτεϊνών δέσμευσης ABRE στο Arabidopsis (Hobo et al., 1999; Li et al., 2012). Οι πρωτεΐνες που δεσμεύουν DRE συμμετέχουν σε αποκρίσεις ξηρασίας, αλατιού, χαμηλής θερμοκρασίας και ABA στο ρύζι (Zhang et al., 2009). Το LTRE συμβάλλει κυρίως στη ρύθμιση των αποκρίσεων χαμηλής θερμοκρασίας στη λεύκα (Jiang et al., 1996; Maestrini et al., 2009). Η παρουσία αβιοτικών στοιχείων που ανταποκρίνονται στο στρες υποδηλώνει ότι τα MdTLPs μπορεί να ρυθμίζονται από διάφορες τάσεις. Εκτός από τα στοιχεία που δρουν cis που αναφέρονται παραπάνω, ανιχνεύθηκαν και άλλοι τύποι στοιχείων που δρουν cis και παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3. Δύο προαγωγείς των ταυτοποιημένων MdTLPs δεν αναλύθηκαν επειδή οι αλληλουχίες προαγωγέων τους δεν μπορούσαν να βρεθούν στη βάση δεδομένων του γονιδιώματος της Apple. και απαντήσεις ABA (Xiong et al., 2002; Dai et al., 2007). Το ABRE ανταποκρίνεται στην ξηρασία και το ABA μέσω πρωτεϊνών δέσμευσης ABRE στο Arabidopsis (Hobo et al., 1999; Li et al., 2012). Οι πρωτεΐνες που δεσμεύουν DRE συμμετέχουν σε αποκρίσεις ξηρασίας, αλατιού, χαμηλής θερμοκρασίας και ABA στο ρύζι (Zhang et al., 2009). Το LTRE συμβάλλει κυρίως στη ρύθμιση των αποκρίσεων χαμηλής θερμοκρασίας στη λεύκα (Jiang et al., 1996; Maestrini et al., 2009). Η παρουσία αβιοτικών στοιχείων που ανταποκρίνονται στο στρες υποδηλώνει ότι τα MdTLPs μπορεί να ρυθμίζονται από διάφορες τάσεις. Εκτός από τα στοιχεία που δρουν cis που αναφέρονται παραπάνω, ανιχνεύθηκαν και άλλοι τύποι στοιχείων που δρουν cis και παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3. Δύο προαγωγείς των ταυτοποιημένων MdTLPs δεν αναλύθηκαν επειδή οι αλληλουχίες προαγωγέων τους δεν μπορούσαν να βρεθούν στη βάση δεδομένων του γονιδιώματος της Apple. και απαντήσεις ABA (Xiong et al., 2002; Dai et al., 2007). Το ABRE ανταποκρίνεται στην ξηρασία και το ABA μέσω πρωτεϊνών δέσμευσης ABRE στο Arabidopsis (Hobo et al., 1999; Li et al., 2012). Οι πρωτεΐνες που δεσμεύουν DRE συμμετέχουν σε αποκρίσεις ξηρασίας, αλατιού, χαμηλής θερμοκρασίας και ABA στο ρύζι (Zhang et al., 2009). Το LTRE συμβάλλει κυρίως στη ρύθμιση των αποκρίσεων χαμηλής θερμοκρασίας στη λεύκα (Jiang et al., 1996; Maestrini et al., 2009). Η παρουσία αβιοτικών στοιχείων που ανταποκρίνονται στο στρες υποδηλώνει ότι τα MdTLPs μπορεί να ρυθμίζονται από διάφορες τάσεις. Εκτός από τα στοιχεία που δρουν cis που αναφέρονται παραπάνω, ανιχνεύθηκαν και άλλοι τύποι στοιχείων που δρουν cis και παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3. Δύο προαγωγείς των ταυτοποιημένων MdTLPs δεν αναλύθηκαν επειδή οι αλληλουχίες προαγωγέων τους δεν μπορούσαν να βρεθούν στη βάση δεδομένων του γονιδιώματος της Apple. Dai et al., 2007). Το ABRE ανταποκρίνεται στην ξηρασία και το ABA μέσω πρωτεϊνών δέσμευσης ABRE στο Arabidopsis (Hobo et al., 1999; Li et al., 2012). Οι πρωτεΐνες που δεσμεύουν DRE συμμετέχουν σε αποκρίσεις ξηρασίας, αλατιού, χαμηλής θερμοκρασίας και ABA στο ρύζι (Zhang et al., 2009). Το LTRE συμβάλλει κυρίως στη ρύθμιση των αποκρίσεων χαμηλής θερμοκρασίας στη λεύκα (Jiang et al., 1996; Maestrini et al., 2009). Η παρουσία αβιοτικών στοιχείων που ανταποκρίνονται στο στρες υποδηλώνει ότι τα MdTLPs μπορεί να ρυθμίζονται από διάφορες τάσεις. Εκτός από τα στοιχεία που δρουν cis που αναφέρονται παραπάνω, ανιχνεύθηκαν και άλλοι τύποι στοιχείων που δρουν cis και παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3. Δύο προαγωγείς των ταυτοποιημένων MdTLPs δεν αναλύθηκαν επειδή οι αλληλουχίες προαγωγέων τους δεν μπορούσαν να βρεθούν στη βάση δεδομένων του γονιδιώματος της Apple. Dai et al., 2007). Το ABRE ανταποκρίνεται στην ξηρασία και το ABA μέσω πρωτεϊνών δέσμευσης ABRE στο Arabidopsis (Hobo et al., 1999; Li et al., 2012). Οι πρωτεΐνες που δεσμεύουν DRE συμμετέχουν σε αποκρίσεις ξηρασίας, αλατιού, χαμηλής θερμοκρασίας και ABA στο ρύζι (Zhang et al., 2009). Το LTRE συμβάλλει κυρίως στη ρύθμιση των αποκρίσεων χαμηλής θερμοκρασίας στη λεύκα (Jiang et al., 1996; Maestrini et al., 2009). Η παρουσία αβιοτικών στοιχείων που ανταποκρίνονται στο στρες υποδηλώνει ότι τα MdTLPs μπορεί να ρυθμίζονται από διάφορες τάσεις. Εκτός από τα στοιχεία που δρουν cis που αναφέρονται παραπάνω, ανιχνεύθηκαν και άλλοι τύποι στοιχείων που δρουν cis και παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3. Δύο προαγωγείς των ταυτοποιημένων MdTLPs δεν αναλύθηκαν επειδή οι αλληλουχίες προαγωγέων τους δεν μπορούσαν να βρεθούν στη βάση δεδομένων του γονιδιώματος της Apple. Το ABRE ανταποκρίνεται στην ξηρασία και το ABA μέσω πρωτεϊνών δέσμευσης ABRE στο Arabidopsis (Hobo et al., 1999; Li et al., 2012). Οι πρωτεΐνες που δεσμεύουν DRE συμμετέχουν σε αποκρίσεις ξηρασίας, αλατιού, χαμηλής θερμοκρασίας και ABA στο ρύζι (Zhang et al., 2009). Το LTRE συμβάλλει κυρίως στη ρύθμιση των αποκρίσεων χαμηλής θερμοκρασίας στη λεύκα (Jiang et al., 1996; Maestrini et al., 2009). Η παρουσία αβιοτικών στοιχείων που ανταποκρίνονται στο στρες υποδηλώνει ότι τα MdTLPs μπορεί να ρυθμίζονται από διάφορες τάσεις. Εκτός από τα στοιχεία που δρουν cis που αναφέρονται παραπάνω, ανιχνεύθηκαν και άλλοι τύποι στοιχείων που δρουν cis και παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3. Δύο προαγωγείς των ταυτοποιημένων MdTLPs δεν αναλύθηκαν επειδή οι αλληλουχίες προαγωγέων τους δεν μπορούσαν να βρεθούν στη βάση δεδομένων του γονιδιώματος της Apple. Το ABRE ανταποκρίνεται στην ξηρασία και το ABA μέσω πρωτεϊνών δέσμευσης ABRE στο Arabidopsis (Hobo et al., 1999; Li et al., 2012). Οι πρωτεΐνες που δεσμεύουν DRE συμμετέχουν σε αποκρίσεις ξηρασίας, αλατιού, χαμηλής θερμοκρασίας και ABA στο ρύζι (Zhang et al., 2009). Το LTRE συμβάλλει κυρίως στη ρύθμιση των αποκρίσεων χαμηλής θερμοκρασίας στη λεύκα (Jiang et al., 1996; Maestrini et al., 2009). Η παρουσία αβιοτικών στοιχείων που ανταποκρίνονται στο στρες υποδηλώνει ότι τα MdTLPs μπορεί να ρυθμίζονται από διάφορες τάσεις. Εκτός από τα στοιχεία που δρουν cis που αναφέρονται παραπάνω, ανιχνεύθηκαν και άλλοι τύποι στοιχείων που δρουν cis και παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3. Δύο προαγωγείς των ταυτοποιημένων MdTLPs δεν αναλύθηκαν επειδή οι αλληλουχίες προαγωγέων τους δεν μπορούσαν να βρεθούν στη βάση δεδομένων του γονιδιώματος της Apple. και αποκρίσεις ΑΒΑ στο ρύζι (Zhang et al., 2009). Το LTRE συμβάλλει κυρίως στη ρύθμιση των αποκρίσεων χαμηλής θερμοκρασίας στη λεύκα (Jiang et al., 1996; Maestrini et al., 2009). Η παρουσία αβιοτικών στοιχείων που ανταποκρίνονται στο στρες υποδηλώνει ότι τα MdTLPs μπορεί να ρυθμίζονται από διάφορες τάσεις. Εκτός από τα στοιχεία που δρουν cis που αναφέρονται παραπάνω, ανιχνεύθηκαν και άλλοι τύποι στοιχείων που δρουν cis και παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3. Δύο προαγωγείς των ταυτοποιημένων MdTLPs δεν αναλύθηκαν επειδή οι αλληλουχίες προαγωγέων τους δεν μπορούσαν να βρεθούν στη βάση δεδομένων του γονιδιώματος της Apple. και αποκρίσεις ΑΒΑ στο ρύζι (Zhang et al., 2009). Το LTRE συμβάλλει κυρίως στη ρύθμιση των αποκρίσεων χαμηλής θερμοκρασίας στη λεύκα (Jiang et al., 1996; Maestrini et al., 2009). Η παρουσία αβιοτικών στοιχείων που ανταποκρίνονται στο στρες υποδηλώνει ότι τα MdTLPs μπορεί να ρυθμίζονται από διάφορες τάσεις. Εκτός από τα στοιχεία που δρουν cis που αναφέρονται παραπάνω, ανιχνεύθηκαν και άλλοι τύποι στοιχείων που δρουν cis και παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3. Δύο προαγωγείς των ταυτοποιημένων MdTLPs δεν αναλύθηκαν επειδή οι αλληλουχίες προαγωγέων τους δεν μπορούσαν να βρεθούν στη βάση δεδομένων του γονιδιώματος της Apple. Η παρουσία αβιοτικών στοιχείων που ανταποκρίνονται στο στρες υποδηλώνει ότι τα MdTLPs μπορεί να ρυθμίζονται από διάφορες τάσεις. Εκτός από τα στοιχεία που δρουν cis που αναφέρονται παραπάνω, ανιχνεύθηκαν και άλλοι τύποι στοιχείων που δρουν cis και παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3. Δύο προαγωγείς των ταυτοποιημένων MdTLPs δεν αναλύθηκαν επειδή οι αλληλουχίες προαγωγέων τους δεν μπορούσαν να βρεθούν στη βάση δεδομένων του γονιδιώματος της Apple. Η παρουσία αβιοτικών στοιχείων που ανταποκρίνονται στο στρες υποδηλώνει ότι τα MdTLPs μπορεί να ρυθμίζονται από διάφορες τάσεις. Εκτός από τα στοιχεία που δρουν cis που αναφέρονται παραπάνω, ανιχνεύθηκαν και άλλοι τύποι στοιχείων που δρουν cis και παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3. Δύο προαγωγείς των ταυτοποιημένων MdTLPs δεν αναλύθηκαν επειδή οι αλληλουχίες προαγωγέων τους δεν μπορούσαν να βρεθούν στη βάση δεδομένων του γονιδιώματος της Apple.

ΠΙΝΑΚΑΣ 2. Κατανομή στοιχείων ABRE, DRE, LTRE, MYB και MYC cis -δρώντων σε προαγωγείς MdTLP .

Έκφραση των MdTLPs υπό θεραπείες με αβιοτικό στρες, ABA και H2O2

Με βάση τα αποτελέσματα της ανάλυσης του υποκινητή, τα MdTLPs μπορεί να συσχετιστούν με την απόκριση του αβιοτικού στρες. Έτσι, για την περαιτέρω διερεύνηση των πιθανών λειτουργιών των MdTLPs υπό συνθήκες αβιοτικού στρες, λήφθηκαν δείγματα cDNA χρησιμοποιώντας σπορόφυτα μήλων που εκτέθηκαν είτε σε PEG, H2O2, εξωγενές ABA ή ψυχρό στρες για 0, 1, 3, 6 και 9 ώρες. Για την ανίχνευση της ποιότητας των δειγμάτων cDNA, δύο γονίδια ευαίσθητα στο στρες (γονίδια DREB: MDP0000147009 και MDP0000218344) επιλέχθηκαν ως γονίδια-δείκτες. Παρόμοια με την προηγούμενη έκθεση (Zhao et al., 2012), οι εκφράσεις τους ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω κάτω από διαφορετικές τάσεις τόσο στα φύλλα όσο και στις ρίζες (Συμπληρωματικό Σχήμα S4). Όσον αφορά την έκφραση των MdTLPs, σχεδόν όλα τα MdTLP ήταν επίσης ρυθμισμένα προς τα πάνω τόσο στα φύλλα όσο και στις ρίζες υπό διαφορετικές τάσεις και εξωγενή ΑΒΑ. Κατά τη διάρκεια της θεραπείας με PEG, έξι MdTLPs (MdTLP1-5, Το MdTLP9) ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω στα φύλλα (Εικόνα 5Α). Για παράδειγμα, τα σχετικά επίπεδα μεταγραφής των MdTLP1 και MdTLP9 ρυθμίστηκαν και τα δύο προς τα πάνω κατά περίπου 35 φορές σε σύγκριση με την κατάσταση ελέγχου. Μόνο τρία MdTLPs (MdTLP6, MdTLP7 και MdTLP8) ρυθμίστηκαν προς τα κάτω υπό πίεση PEG. Στις ρίζες, πέντε MdTLPs (MdTLP3, MdTLP4 και MdTLP7-9) ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω ως απόκριση στη θεραπεία με PEG (Εικόνα 5Β). Μεταξύ αυτών, η έκφραση του MdTLP4 άλλαξε το μέγιστο, φτάνοντας σχεδόν 30 φορές. Υπό ψυχρό στρες, σχεδόν όλα τα MdTLP στα φύλλα και στις ρίζες εμφάνισαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα μεταγραφής, υποδηλώνοντας ότι όλα τα MdTLP είναι γονίδια που ανταποκρίνονται στο κρύο. Μεταξύ αυτών των γονιδίων, η έκφραση MdTLP4 αυξήθηκε σχεδόν 70 φορές στα φύλλα σε 6 ώρες και περίπου 150 φορές στις ρίζες σε 3 ώρες. Σε απόκριση στη θεραπεία με H2O2 ή ABA, πέντε μέλη (MdTLP1-5) ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω στα φύλλα, ενώ στις ρίζες, η έκφραση των MdTLP4, MdTLP6, MdTLP8 και MdTLP9 έδειξε σημαντική αύξηση. Συγκεκριμένα, το MdTLP4 ρυθμίστηκε προς τα πάνω σε όλες τις θεραπείες τόσο στα φύλλα όσο και στις ρίζες.

ΣΧΗΜΑ 5. Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο (qRT-PCR) για μήλο υπό PEG, H 2 O 2 , ABA ή ψυχρή καταπόνηση και έκθεση σε 20 % PEG6000, 100 mM H 2 O 2 και 100 μM ABA στους 4°C για 0, 1, 3, 6 και 9 h. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν στο επίπεδο έκφρασης του γονιδίου ακτίνης. Η μέση τιμή έκφρασης υπολογίστηκε από τρία ανεξάρτητα αντίγραφα. Οι κάθετες ράβδοι υποδεικνύουν το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. ^∗∗ P ≤ 0,01 και ^∗ P ≤ 0,05 σε σύγκριση με 0 h. (Α) Τα επίπεδα έκφρασης εννέα MdTLPs σε φύλλα μήλου κάτω από διαφορετικές επεξεργασίες. (Β) Τα επίπεδα έκφρασης εννέα MdTLPs σε ρίζες μήλων κάτω από διαφορετικές θεραπείες.

Έκφραση MdTLPs σε διαφορετικά όργανα

Για την παροχή περαιτέρω ενδείξεων για τους πιθανούς ρόλους των γονιδίων MdTLP στην ανάπτυξη των μήλων, τα πρότυπα έκφρασης και των 9 γονιδίων MdTLP διερευνήθηκαν με qRT-PCR σε έξι διαφορετικά όργανα (φύλλα, ρίζες, μίσχοι, άνθη, σπόροι και μπουμπούκια) και Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 6. Σχετικά υψηλά επίπεδα MdTLPs βρέθηκαν στις ρίζες, τους μίσχους και τα φύλλα. στα λουλούδια, τα επίπεδα μεταγραφής των MdTLP ήταν μάλλον χαμηλά. Σε σύγκριση με άλλα MdTLP, τα MdTLP8 και MdTLP9 είχαν χαμηλά επίπεδα έκφρασης στα περισσότερα όργανα. Τα MdTLP1, MdTLP2, MdTLP3 και MdTLP4 εκφράστηκαν σε μεγάλο βαθμό στις ρίζες, τους μίσχους και τα φύλλα, με χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης σε άνθη, σπόρους και μπουμπούκια. Αντίθετα, τα επίπεδα μεταγραφής MdTLP6, MdTLP7, MdTLP8 και MdTLP9 ήταν σχετικά υψηλά στους οφθαλμούς, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα γονίδια παίζουν σημαντικό ρόλο στη διαδικασία βλάστησης.

ΣΧΗΜΑ 6. Σχέδιο έκφρασης ειδικού οργάνου του MdTLP s. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των MdTLPs σε διαφορετικά όργανα συγκρίθηκαν με τα φύλλα με T-test σε επίπεδα σημαντικότητας ^∗∗ P ≤ 0,01 και ^∗ P ≤ 0,05.

Συζήτηση

Τα πρωτεϊνικά γονίδια τύπου Tubby είναι μέλη μιας διατηρημένης οικογένειας γονιδίων που έχει εντοπιστεί σε πολλά είδη. Σε σύγκριση με τα ζώα, λίγα TLPs έχουν μελετηθεί λειτουργικά σε φυτά. Στο φυτικό βασίλειο, TLPs έχουν αναφερθεί μόνο για μερικά είδη, όπως το Arabidopsis (Lai et al., 2004), το ρύζι (Liu, 2008) και τον αραβόσιτο (Yulong et al., 2016). Η δημοσίευση του γονιδιώματος του μήλου έδωσε την ευκαιρία να μελετηθούν τα χαρακτηριστικά αυτής της οικογένειας στο μήλο (Velasco et al., 2010). Σε αυτή τη μελέτη, εννέα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες TLP εντοπίστηκαν στο μήλο, το οποίο είναι παρόμοιο με τους αριθμούς που αναφέρθηκαν σε άλλα φυτά, 11 για το Arabidopsis, 14 για το ρύζι και 15 για τον αραβόσιτο.

Η φυλογενετική ανάλυση των TLP από τέσσερα είδη φυτών έδειξε ότι όλα τα γονίδια TLP χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες (Εικόνα 1). Τα αποτελέσματα σε αυτή τη μελέτη είναι παρόμοια με εκείνα μιας προηγούμενης έκθεσης που συγκρίνει την εξελικτική σχέση του Arabidopsis και των TLP του ρυζιού (Yang et al., 2008). Εδώ, τα MdTLPs κατανεμήθηκαν στις ομάδες Α και Β. Η ομάδα Α περιλάμβανε τέσσερις υποομάδες και η ομάδα Β περιείχε πέντε πρωτεΐνες: MdTLP8 και MdTLP9 στο μήλο, AtTLP8 στο Arabidopsis, OsTLP4 στο ρύζι και ZmTLP13 στον αραβόσιτο. Ένα προφανές χαρακτηριστικό όλων των μελών της ομάδας Β είναι ότι δεν υπάρχει πεδίο F-box συγχωνευμένο με το πεδίο tubby στο Ν άκρο. Τα μέλη αυτής της ομάδας μπορεί να προέρχονται από ένα γονίδιο σε ένα προγονικό είδος. Τρία μοτίβα εντοπίστηκαν στα MdTLP, και τα τρία αυτά μοτίβα μπορούσαν να βρεθούν σε όλα τα μέλη της ομάδας Α, εκτός από το MdTLP5, που διέθετε μόνο τα μοτίβα 1 και 3. Το μοτίβο 3 δεν βρέθηκε στην ομάδα Β, το MdTLP9 είχε μόνο το μοτίβο 2 και το MdTLP8 είχε μοτίβα 1 και 2. Τα μοτίβα 1 και 2 βρέθηκαν επίσης στην περιοχή σωλήνων άλλων ειδών, όπως το Arabidopsis και το ρύζι (Lai et al., 2004; Kou et al., 2009). Αυτά τα δύο μοτίβα διατηρήθηκαν σε μεγάλο βαθμό μεταξύ των TLP από διάφορους οργανισμούς, υποδηλώνοντας ότι οι δύο αλληλουχίες μοτίβων ήταν υπογραφές της περιοχής tubby. Ωστόσο, το μοτίβο 3 μπορεί να είναι μοναδικό για το apple. υποδηλώνοντας ότι οι δύο αλληλουχίες μοτίβων ήταν υπογραφές της περιοχής tubby. Ωστόσο, το μοτίβο 3 μπορεί να είναι μοναδικό για το apple. υποδηλώνοντας ότι οι δύο αλληλουχίες μοτίβων ήταν υπογραφές της περιοχής tubby. Ωστόσο, το μοτίβο 3 μπορεί να είναι μοναδικό για το apple.

Η μοντελοποίηση των τρισδιάστατων δομών πρότεινε ότι η τυπική κυλινδρική περιοχή των MdTLPs είχε μια κεντρική α έλικα που περιβάλλεται από έναν κλειστό β κύλινδρο που αποτελείται από 12 αντιπαράλληλα φύλλα, όπως βρίσκονται στα MdTLP1, MdTLP2, MdTLP7 και MdTLP8. Στα θηλαστικά, η κρυσταλλική δομή του κυλινδρικού τομέα βρέθηκε να αποτελείται από ένα κύλινδρο β 12 κλώνων με μια κεντρική υδρόφοβη α έλικα. Η περιοχή σωλήνων συνδέεται εύκολα με δίκλωνο DNA λόγω των β αλυσίδων (5, 6, 7, 8, 9 και 10) του βαρελιού β (Boggon et al., 1999). Μια δεσμευμένη στη μεμβράνη ζωική πρωτεΐνη σωληνίσκου μετατοπίζεται από τη μεμβράνη του πλάσματος στον πυρήνα, ενεργώντας ως μεταγραφικός παράγοντας για τη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων όταν το κύτταρο λαμβάνει ένα σήμα (Santagata et al., 2001; Carroll et al., 2004). Ωστόσο, ορισμένα μέλη του MdTLP είχαν μια ελλιπή δομή, όπως μια ατελής β κάννη,

Σε αντίθεση με τα ζωικά TLP, τα περισσότερα φυτικά TLP έχουν μια πρόσθετη περιοχή F-box στη Ν-τερματική αλληλουχία πρωτεΐνης (Lai et al., 2004; Yang et al., 2008; Yulong et al., 2016) και επομένως θεωρούνται επίσης ότι Πρωτεΐνες F-box. Οι πρωτεΐνες F-box έχουν αναφερθεί ότι παίζουν ρόλο στην απόκριση στο αβιοτικό στρες (Stone and Callis, 2007· Yan et al., 2011· Maldonado-Calderon et al., 2012· Chen et al., 2014· Cui et al., 2015). Οι αποκρίσεις στρες των φυτών ρυθμίζονται από πολλαπλά μονοπάτια σηματοδότησης και υπάρχει σημαντική επικάλυψη μεταξύ των προτύπων γονιδιακής έκφρασης που προκαλούνται από διαφορετικές πιέσεις (Durrant et al., 2000; Schenk et al., 2000; Glazebrook, 2001; Knight και Knight, 2001· Seki et al., 2001· Chen et al., 2002). Η γονιδιακή επαγωγή από το στρες συμβαίνει κυρίως στο επίπεδο της μεταγραφής και ρυθμίζει τα χρονικά και χωρικά μοτίβα έκφρασης (Rushton and Somssich, 1998). Πολλοί μεταγραφικοί παράγοντες εμπλέκονται στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με το στρες στα φυτά. Συχνά, αρκετοί στενά συνδεδεμένοι μεταγραφικοί παράγοντες έχουν τη δυνατότητα να ενεργοποιούν ή να καταστέλλουν γονίδια μέσω αλληλουχιών που δρουν cis που ανταποκρίνονται σε συγκεκριμένες πιέσεις (Singh et al., 2002). Σε αυτή τη μελέτη, η ανάλυση των περιοχών προαγωγέα MdTLP αποκάλυψε μια συχνή εμφάνιση στοιχείων που δρουν cis, όπως MYB/MYC, ABRE, DRE και/ή LTRE. Αυτά τα στοιχεία βασικά συμμετέχουν στην ξηρασία, τη χαμηλή θερμοκρασία και τις εξωγενείς αποκρίσεις ABA (Xiong et al., 2002; He et al., 2012; Li et al., 2012). Πολλοί μεταγραφικοί παράγοντες εμπλέκονται στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με το στρες στα φυτά. Συχνά, αρκετοί στενά συνδεδεμένοι μεταγραφικοί παράγοντες έχουν τη δυνατότητα να ενεργοποιούν ή να καταστέλλουν γονίδια μέσω αλληλουχιών που δρουν cis που ανταποκρίνονται σε συγκεκριμένες πιέσεις (Singh et al., 2002). Σε αυτή τη μελέτη, η ανάλυση των περιοχών προαγωγέα MdTLP αποκάλυψε μια συχνή εμφάνιση στοιχείων που δρουν cis, όπως MYB/MYC, ABRE, DRE και/ή LTRE. Αυτά τα στοιχεία βασικά συμμετέχουν στην ξηρασία, τη χαμηλή θερμοκρασία και τις εξωγενείς αποκρίσεις ABA (Xiong et al., 2002; He et al., 2012; Li et al., 2012). Πολλοί μεταγραφικοί παράγοντες εμπλέκονται στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με το στρες στα φυτά. Συχνά, αρκετοί στενά συνδεδεμένοι μεταγραφικοί παράγοντες έχουν τη δυνατότητα να ενεργοποιούν ή να καταστέλλουν γονίδια μέσω αλληλουχιών που δρουν cis που ανταποκρίνονται σε συγκεκριμένες πιέσεις (Singh et al., 2002). Σε αυτή τη μελέτη, η ανάλυση των περιοχών προαγωγέα MdTLP αποκάλυψε μια συχνή εμφάνιση στοιχείων που δρουν cis, όπως MYB/MYC, ABRE, DRE και/ή LTRE. Αυτά τα στοιχεία βασικά συμμετέχουν στην ξηρασία, τη χαμηλή θερμοκρασία και τις εξωγενείς αποκρίσεις ABA (Xiong et al., 2002; He et al., 2012; Li et al., 2012). Η ανάλυση των περιοχών προαγωγέα MdTLP αποκάλυψε συχνή εμφάνιση στοιχείων που δρουν cis, όπως MYB/MYC, ABRE, DRE και/ή LTRE. Αυτά τα στοιχεία βασικά συμμετέχουν στην ξηρασία, τη χαμηλή θερμοκρασία και τις εξωγενείς αποκρίσεις ABA (Xiong et al., 2002; He et al., 2012; Li et al., 2012). Η ανάλυση των περιοχών προαγωγέα MdTLP αποκάλυψε συχνή εμφάνιση στοιχείων που δρουν cis, όπως MYB/MYC, ABRE, DRE και/ή LTRE. Αυτά τα στοιχεία βασικά συμμετέχουν στην ξηρασία, τη χαμηλή θερμοκρασία και τις εξωγενείς αποκρίσεις ABA (Xiong et al., 2002; He et al., 2012; Li et al., 2012).

Για να μελετηθεί περαιτέρω η απόκριση των MdTLP στο αβιοτικό στρες, χρησιμοποιήθηκε qRT-PCR για τον προσδιορισμό των προτύπων έκφρασης εννέα υποτιθέμενων MdTLP στο μήλο. Τα γονίδια MdTLP προκλήθηκαν σε διάφορους βαθμούς κάτω από διαφορετικές επεξεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ξηρασίας, του οξειδωτικού, του εξωγενούς ΑΒΑ και του ψυχρού στρες (Εικόνα 5). Ειδικότερα, τα MdTLP4, MdTLP6, MdTLP8 και MdTLP9 ρυθμίστηκαν προς τα πάνω κατά περισσότερο από 10 φορές υπό εξωγενή επεξεργασία ΑΒΑ στις 3 ώρες στις ρίζες. Τέσσερα γονίδια (MdTLP1, MdTLP2, MdTLP4 και MdTLP5) ρυθμίστηκαν προς τα πάνω κατά περισσότερο από 100 φορές υπό εξωγενή επεξεργασία ΑΒΑ στις 9 ώρες στα φύλλα. Τα περισσότερα γονίδια MdTLP ρυθμίστηκαν επίσης σημαντικά προς τα πάνω κάτω από ξηρασία, οξειδωτικές και ψυχρές καταπονήσεις στα φύλλα και τις ρίζες. Από τα MdTLP, τα MdTLP1, MdTLP8 και MdTLP9 δεν περιέχουν τομέα F-box στο Ν-άκρο. Επομένως, Εικάζουμε ότι οι πρωτεΐνες που περιέχουν μια περιοχή F-box ή περιοχή tubby μπορεί να λειτουργούν ως απόκριση στο στρες. Όταν αυτοί οι δύο τομείς εμφανίζονται μαζί, μπορεί να προκύψει ένα συνεργιστικό αποτέλεσμα. Στο Arabidopsis, τα AtTLP3 και AtTLP9 βρέθηκαν να ρυθμίζονται προς τα πάνω υπό αβιοτικές καταπονήσεις ή θεραπεία με ΑΒΑ (Lai et al., 2004), τα δύο μέλη της οποίας ανήκουν στην υποομάδα Α3 στο φυλογενετικό δέντρο. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι τα MdTLPs στην υποομάδα A1, A2, A4 και ομάδα B ήταν επίσης ευαίσθητα σε αβιοτικές καταπονήσεις. Ειδικά, το MdTLP4 ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω κάτω από διαφορετικές τάσεις τόσο στα φύλλα όσο και στις ρίζες. Τα αποτελέσματά μας πρότειναν ότι τα φυτικά μέλη TLP μπορεί να συμμετέχουν ως απόκριση στο αβιοτικό στρες. Σε σύγκριση με προηγούμενες μελέτες σχετικά με την οικογένεια TLP των φυτών, ειδικά των Arabidopsis TLP,

Συνεισφορές Συγγραφέων

Σχεδίασε τα πειράματα: X-YW, S-SX και J-NX. Πραγματοποιήθηκαν τα πειράματα: S-SX, J-NX και Z-RZ. Ανάλυσαν τα δεδομένα: S-SX, J-NX, Z-RZ και X-SC. Έγραψε το χαρτί: X-YW, J-NX και S-SX.

Δήλωση Σύγκρουσης Συμφερόντων

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη απουσία εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.

Αναγνώριση

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από το Ειδικό Ταμείο Ερευνών Δημόσιας Πρόνοιας του Υπουργείου Γεωργίας της Κίνας (201303093).

Συμπληρωματικό υλικό

Το συμπληρωματικό υλικό για αυτό το άρθρο βρίσκεται στο διαδίκτυο στη διεύθυνση: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2016.01693/full#supplementary-material

ΣΧΗΜΑ S1 | Πολλαπλές ευθυγραμμίσεις της αλληλουχίας πρωτεϊνών πλήρους μήκους όλων των φυτικών TLP. Ο μαύρος αστερίσκος πάνω από ένα αμινοξύ υποδηλώνει την έναρξη της περιοχής tubby. Οι θέσεις του τομέα F-box υποδεικνύονται με μεμονωμένες συμπαγείς γραμμές με μαύρο χρώμα πάνω από τις ακολουθίες. Το τμήμα της έλικας α του πυρήνα στην περιοχή σωλήνων περικλείεται με ένα κόκκινο ορθογώνιο.

ΕΙΚΟΝΑ S2 | Τοποθεσίες των MdTLP s σε χρωμοσώματα μήλου.

ΕΙΚΟΝΑ S3 | Μοτίβα ιντρονίων των TLP από apple και Arabidopsis .

ΕΙΚΟΝΑ S4 | Έκφραση των γονιδίων DREB ( MDP0000147009 και MDP0000218344 ) στα φύλλα (Α) και τις ρίζες (Β) υπό διαφορετικές κατεργασίες. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν στο επίπεδο έκφρασης του γονιδίου ακτίνης. Οι κάθετες ράβδοι υποδεικνύουν το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. **P ≤ 0,01 και *P ≤ 0,05 σε σύγκριση με 0 h.

ΠΙΝΑΚΑΣ S1 | Αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιούνται στην ποσοτική ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο.

ΠΙΝΑΚΑΣ S2 | Το αποτέλεσμα αναζήτησης BLAST για κάθε MdTLP έναντι συγκροτημάτων Apple EST.

ΠΙΝΑΚΑΣ S3 | Ανάλυση στοιχείων Cis -δράσης των MdTLP s χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων PLACE.

Συντομογραφίες

ABA, abscisic acid; ABRE, στοιχείο απόκρισης ABA. DRE, στοιχείο απόκρισης αφυδάτωσης. DREB, πρωτεΐνη δέσμευσης στοιχείων που ανταποκρίνεται στην αφυδάτωση. LTRE, στοιχείο απόκρισης σε χαμηλές θερμοκρασίες. qRT-PCR, Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο. TLP, πρωτεΐνη που μοιάζει με σαμπρέλα.

^ http://www.arabidopsis.org/
^ http://www.rosaceae.org/
^ http://www.ebi.ac.uk/interpro/
^ http://pfam.xfam.org/
^ http://smart.embl-heidelberg.de/
^ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
^ http://www.clustal.org/
^ http://www.clcbio.com
^ http://www.rosaceae.org/
^ http://gsds.cbi.pku.edu.cn
^ http://web.expasy.org/compute_pi/
^ http://www.ebi.ac.uk/interpro/
^ http://psort.nibb.ac.jp/
^ http://meme-suite.org/tools/meme
^ http://smart.embl-heidelberg.de/
^ http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/
^ http://www.pymol.org/
^ http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/
^ http://pfam.xfam.org/
^ http://smart.embl-heidelberg.de/
^ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
^ http://meme-suite.org/tools/meme

πρωτεΐνη που μοιάζει με σαμπρέλα, βιοπληροφορική, μοτίβα υπογραφής, αβιοτικό στρες, μήλο