Διακριτική in vitro δραστηριότητα υδρόλυσης ATP του AtVIPP1, μιας χλωροπλαστικής πρωτεΐνης υπεροικογένειας ESCRT-III στο Arabidopsis
- 1 Institute for Plant Science and Resources, Πανεπιστήμιο Okayama, Kurashiki, Ιαπωνία
- 2 School of Life Sciences, Inner Mongolia University, Hohhot, Κίνα
Η πρωτεΐνη που προκαλεί κυστίδια στο πλαστίδιο 1 (VIPP1), χαρακτηριστική για τους οξυγονικούς φωτοσυνθετικούς οργανισμούς, είναι ένας παράγοντας αναδιαμόρφωσης της μεμβράνης που σχηματίζει ομο-ολιγομερή και λειτουργεί στον σχηματισμό και τη συντήρηση της θυλακοειδής μεμβράνης. Η κυανοβακτηριακή δομή VIPP1 αποκάλυψε ένα μονομερές σχέδιο αναδίπλωσης παρόμοιο με αυτό του συμπλέγματος ενδοσωμικής ταξινόμησης που απαιτείται για τη μεταφορά (ESCRT) III. Χαρακτηριστικό του VIPP1, ωστόσο, είναι η δική του υδρολυτική δράση GTP και ATP χωρίς κανονικές περιοχές. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι το Arabidopsis VIPP1 (AtVIPP1) με ετικέτα ιστιδίνης υδρόλυσε το GTP και το ATP για να παράγει GDP και ADP in vitro, αντίστοιχα. Απροσδόκητα, οι παρατηρούμενες δραστηριότητες GTPase και ATPase ήταν βιοχημικά διακριτές, επειδή η ATPase ήταν βελτιστοποιημένη για αλκαλικές συνθήκες και εξαρτημένη από Ca 2 καθώς και Mg 2 , με υψηλότερη συγγένεια για το ATP από το GTP. Βρήκαμε ότι μια έκδοση της πρωτεΐνης AtVIPP1 με μετάλλαξη στη θέση δέσμευσης νουκλεοτιδίων της, όπως προκύπτει από την κυανοβακτηριακή δομή, διατήρησε την υδρολυτική της δράση, υποδηλώνοντας ότι τα Arabidopsis και τα κυανοβακτηριακά VIPP1 έχουν διαφορετικές ιδιότητες. Η ανάλυση σωματιδίων αρνητικής χρώσης έδειξε ότι το AtVIPP1 σχημάτισε δομές σωματιδίων ή ράβδων που διέφεραν από αυτές των κυανοβακτηρίων και του Chlamydomonas. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η υδρολυτική δραστηριότητα νουκλεοτιδίων και ο σχηματισμός ολιγομερών του VIPP1 είναι κοινά σε φωτοσυνθετικούς οργανισμούς, ενώ οι ιδιότητές τους διαφέρουν μεταξύ των ειδών.
Εισαγωγή
Η αναδιαμόρφωση της μεμβράνης είναι μια κρίσιμη κυτταρική διαδικασία που εμπλέκεται στην ενδοκυττάρωση, την εξωκυττάρωση, τη σχάση, την αποκοπή και την επιδιόρθωση της μεμβράνης. Μεταξύ αυτών, η αποτελεσματική επιδιόρθωση της μεμβράνης είναι απαραίτητη για την αντιμετώπιση της βλάβης σε κύτταρα και οργανίδια, διασφαλίζοντας την επιβίωση των κυττάρων σε αντίξοες συνθήκες. Οι χλωροπλάστες, οι οποίοι είναι ευάλωτοι στο φως λόγω των φωτοσυνθετικών αντιδράσεων που λαμβάνουν χώρα μέσα στο οργανίδιο, δεν αποτελούν εξαίρεση στην απαίτηση για αναδιαμόρφωση μεμβράνης τόσο της μεμβράνης του περιβλήματος όσο και της θυλακοειδής μεμβράνες, ωστόσο λίγα είναι κατανοητά σχετικά με τα μόρια που εμπλέκονται σε αυτήν την αναδιαμόρφωση. Η πρωτεΐνη που προκαλεί κυστίδια στο πλαστίδιο 1 (VIPP1) έχει αποδειχθεί ότι παίζει κεντρικό ρόλο στον σχηματισμό και τη συντήρηση της μεμβράνης του θυλακοειδούς. Αρχικά βρέθηκε ως εντοπισμένο τόσο στο περίβλημα του χλωροπλάστη όσο και στις θυλακοειδείς μεμβράνες (Li et al., 1994),
Με βάση τη σωρευτική έρευνα που εκτείνεται σε περισσότερες από δύο δεκαετίες, έχουν προταθεί πολλαπλοί ρόλοι του VIPP1 που σχετίζονται με την οργάνωση των μεμβρανών χλωροπλαστών (Kroll et al., 2001; Lo and Theg, 2012; Zhang et al., 2012; Hennig et al., 2015· McDonald et al., 2015), μαζί με το σχηματισμό υπερσυμπλεγμάτων φωτοσυνθετικών πρωτεϊνών (Zhang et al., 2014), μέσω της παροχής δομικών λιπιδίων (Nordhues et al., 2012) και του σχηματισμού θυλακοειδών μέσω κυστιδίων (Aseeva et al. , 2007). Έχει επίσης προταθεί η συμμετοχή του VIPP1 στην προστασία από το στρες (Zhang et al., 2016a,b). Αυτές οι μελέτες υποδηλώνουν ότι οι σημαντικές λειτουργίες του VIPP1 συγκλίνουν γύρω από τις λιπιδοδεσμευτικές του ιδιότητες. Πράγματι, προηγούμενες in vitro μελέτες πρότειναν ότι το VIPP1 προκαλεί αναδιαμόρφωση, αποσταθεροποίηση και σύντηξη της μεμβράνης (Hennig et al., 2015; Heidrich et al., 2017; Junglas et al., 2020). Οι ελικοειδείς δομές που κατακλύζουν τα λιποσώματα, που παρατηρούνται στο Chlamydomonas in vitro, υποστηρίζουν επίσης τη δραστηριότητα αναδιαμόρφωσής του (Theis et al., 2019). Πρόσφατες αναφορές σχετικά με τη δομή του δακτυλίου των κυανοβακτηριακών ολιγομερών VIPP1, που επιλύθηκαν με ανάλυση μεμονωμένων σωματιδίων με κρυοηλεκτρονική μικροσκοπία (cryo-EM), έδειξαν ότι η δέσμευσή τους στα λιπίδια ενορχηστρώνεται από υδρόφοβες στήλες του αυλού που προέρχονται από τη Ν-τερματική α-έλικα του VIPP1 (Gupta et al., 2021). Ομοίως, το βακτηριακό PspA, το οποίο θεωρείται ως προγονική πρωτεΐνη του VIPP1, αποδείχθηκε ότι σχηματίζει ελικοειδή ολιγομερή (Junglas et al., 2021). Σε αυτή τη δομή, κάθε μονομερές σχηματίζει μια δομή φουρκέτας παρόμοια όχι μόνο με το VIPP1 αλλά και με το σύμπλεγμα ενδοσωμικής διαλογής που απαιτείται για τη μεταφορά (ESCRT) III, που εμπλέκεται σε διάφορα είδη συμβάντων αναδιαμόρφωσης μεμβράνης και επίσης πρόσφατα αναγνωρίστηκε ως μέρος του μηχανήματος επισκευής μεμβράνης (McCullough et al., 2013; Sonder et al., 2019). Αυτά τα ευρήματα μαζί καταδεικνύουν ότι το VIPP1 διαδραματίζει θεμελιώδη ρόλο στην ακεραιότητα της μεμβράνης του χλωροπλάστη, παρόμοια με το PspA που προστατεύει τις πλασματικές μεμβράνες έναντι διαρροής ιόντων στο Escherichia coli (Kobayashi et al., 2007).
Ένα μοναδικό χαρακτηριστικό του VIPP1 είναι η δραστικότητα υδρόλυσης νουκλεοτιδίων (GTP και ATP), παρά την έλλειψη μιας κανονικής περιοχής δέσμευσης νουκλεοτιδίων. Για την υδρόλυση GTP, αναφέραμε αρχικά ότι η καθαρισμένη πρωτεΐνη με επισήμανση His που προέρχεται από τα Arabidopsis VIPP1 και E. coli PspA είχε δραστηριότητα παρόμοια με την GTPase in vitro (Ohnishi et al., 2018). Γενικά, η συμβολή της δραστηριότητας GTPase στα στάδια σύντηξης μεμβράνης είναι γνωστή, όπως φαίνεται από τη δυναμίνη και την πρωτεϊνική της οικογένεια (Ferguson και De Camilli, 2012). Η δραστηριότητα υδρόλυσης GTP φαίνεται επίσης να συμβάλλει στην αναδιαμόρφωση της μεμβράνης στους χλωροπλάστες. Σύμφωνα με αναφορές, η εκβλάστηση κυστιδίων μπορεί να αποτραπεί από αναστολείς GTPase (Westphal et al., 2001) και η στρωματική GTP απαιτείται για την ενσωμάτωση συμπλόκων πρωτεϊνών που συγκεντρώνουν φως στις μεμβράνες του θυλακοειδούς (Hoffman and Franklin, 1994). Αρκετές εντοπισμένες σε χλωροπλάστες GTPάσες έχουν προταθεί ότι παίζουν ρόλο στη δυναμική της μεμβράνης (Lindquist and Aronsson, 2018). Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε μια διευκολυντική επίδραση της GTP στη δραστηριότητα σύντηξης μεμβράνης του IM30 (Junglas et al., 2020). Αυτά τα γεγονότα υποδηλώνουν τη λειτουργία αναδιαμόρφωσης της μεμβράνης του VIPP1 μέσω της δραστηριότητας GTPase.
Για την υδρόλυση ATP, τα κυανοβακτήρια και τα VIPP1 με πράσινα φύκια αποδείχθηκε πρόσφατα ότι έχουν δραστηριότητες τόσο GTPase όσο και ATPase (Gupta et al., 2021; Siebenaller et al., 2021). Υποστηρίζοντας αυτά τα ευρήματα, έχει εντοπιστεί ένας νέος θύλακος δέσμευσης νουκλεοτιδίων στη δομή του δακτυλίου VIPP1 που σχετίζεται με τον σχηματισμό του ολιγομερούς συμπλόκου. Αυτή η μελέτη των Gupta et al. έδειξε ότι η δραστηριότητα NTPase του VIPP1 είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την πλήρη δραστηριότητά του (Gupta et al., 2021). Το ESCRT-III θεωρείται ότι χρησιμοποιεί υδρόλυση ATP για την αποσυναρμολόγηση πρωτεϊνών ESCRT μετά από σχάση μεμβράνης (McCullough et al., 2013), η οποία προέρχεται από την Vps4 ATPase (Mierzwa et al., 2017; McCullough et al., 2018). Αυτή η ΑΤΡάση προκαλεί επίσης στένωση του λαιμού της μεμβράνης και κόβει τους σωλήνες μεμβράνης (Schöneberg et al., 2018; Maity et al., 2019). Εξάλλου, υπάρχουν αρκετά ένζυμα που υδρολύουν τόσο το GTP όσο και το ATP (Dutta et al., 2009; Cheung et al., 2016; Unciuleac et al., 2016; Shu et al., 2019). Η VIPP1 που φιλοξενεί δραστηριότητα NTPase αυτή καθεαυτή αντιπροσωπεύει μια νέα πρωτεΐνη υπεροικογένειας ESCRT-III, αν και ο ακριβής ρόλος της στην αναδιαμόρφωση της μεμβράνης παραμένει ασαφής.
Για να διερευνήσουμε περαιτέρω τη δραστηριότητα NTPase του Arabidopsis VIPP1 (AtVIPP1), εδώ αξιολογήσαμε τη δραστηριότητα υδρόλυσης ATP. Τα παρόντα δεδομένα έδειξαν ότι το AtVIPP1 είναι ικανό για δέσμευση ATP, ATP-υδρόλυση και παραγωγή ADP επιπλέον της υδρόλυσης GTP. Η διάρρηξη του υποτιθέμενου τομέα δέσμευσης νουκλεοτιδίων που συνάγεται από το Synechocystis VIPP1 δεν διαταράσσει τη δραστηριότητά του, αυξάνοντας την πιθανότητα ότι το VIPP1 λειτουργεί διαφορετικά μεταξύ κυανοβακτηρίων και χλωροπλαστών. Η αντίδραση υδρόλυσης ATP εξαρτιόταν από τα ιόντα Mg 2 και Ca 2 ως συμπαράγοντες, σε αντίθεση με την υψηλή εξάρτηση της δραστικότητας υδρόλυσης GTP μόνο από το Mg 2 . Σημειωτέον, η τιμή KM παρουσία Ca 2 ήταν πολύ χαμηλότερη από αυτή παρουσία Mg 2 , υποδηλώνοντας υψηλή συγγένεια με το ATP. Τα αποτελέσματά μας πρότειναν έναν ξεχωριστό ρόλο αυτής της δραστικότητας υδρόλυσης ATP από τη δραστικότητα υδρόλυσης GTP in vivo.
Υλικά και μέθοδοι
Παρασκευή ανασυνδυασμένων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών με επισήμανση His
Οι φορείς έκφρασης για άγριου τύπου και κολοβωμένη VIPP1 (ΔH1, ΔH5-7) ήταν ένα ευγενικό δώρο από τον Dr. Ute Vothknecht (Otters et al., 2013). Ο φορέας έκφρασης για τη μεταλλαγμένη πρωτεΐνη N16I παρασκευάστηκε με βάση τον φορέα για VIPP1 άγριου τύπου που αναφέρθηκε προηγουμένως (Ohnishi et al., 2018). Οι φορείς έκφρασης για άλλες μεταλλαγμένες πρωτεΐνες (V10E, V11E, R44K, E126Q, E179Q, και E126Q/E179Q) παρασκευάστηκαν επίσης με βάση αυτό για άγριου τύπου AtVIPP1 χρησιμοποιώντας κιτ μεταλλαξογένεσης (PrimeSTAR Mutagenesis Basal kit, Japano, TaKaRa ). Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται για τη μεταλλαξιογένεση συνοψίζονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1.
Όλες οι επισημασμένες με His ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται στους Ohnishi et al. (2018) με μικρές τροποποιήσεις. Η υπερέκφραση των πρωτεϊνών διεξήχθη στους 27°C στο στέλεχος Ε. coli BL21(DE3)pLysS. Τα κύτταρα που έφεραν υπερεκφρασμένη πρωτεΐνη σφαιροποιήθηκαν, καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και στη συνέχεια αποθηκεύτηκαν στους -30°C μέχρι να ξεκινήσει ο καθαρισμός συγγένειας Ni 2 . Οι ακόλουθες διαδικασίες (Ni 2 -καθαρισμός συγγένειας, αντικατάσταση ρυθμιστικού διαλύματος, συγκέντρωση πρωτεΐνης, παρασκευή μητρικού διαλύματος που περιέχει γλυκερίνη) έγιναν εντός μιας ημέρας (συνήθως 10 ώρες) για να αποφευχθεί η απώλεια της δραστικότητας υδρόλυσης ΑΤΡ/ΟΤΡ. Το διαλυτό κλάσμα που εκχυλίστηκε από κύτταρα Ε. coli που είχε ληφθεί από περίπου 25 mL καλλιέργειας αναμίχθηκε με 0,65 mL αγαρόζης Ni-NTA (GE Healthcare, Chicago, IL) και στη συνέχεια επωάστηκε στους 4°C για 2,5 ώρες. Με βάση τα προφίλ έκλουσης που ελήφθησαν στην προηγούμενη μελέτη (Ohnishi et al., 2018), οι διαδικασίες μετά από αυτό το στάδιο τροποποιήθηκαν εκτός από τον καθαρισμό των μεταλλαγμάτων ΔH1 και V11E. Μετά τη συλλογή της ροής ως μη δεσμευμένου κλάσματος, η στήλη Ni-NTA πλύθηκε με 12 mL ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει 150 mM ιμιδαζόλη (150 mM ιμιδαζόλη, 20 mM Tris-HCl [ρΗ 8,0], 500 mM NaCl). Ακολούθως, Οι πρωτεΐνες που δεσμεύτηκαν στη στήλη Ni-NTA εκλούστηκαν σταδιακά με 0,5 mL 1 Μ και 1,5 mL ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει 1,5 Μ ιμιδαζόλη (1 ή 1,5 Μ ιμιδαζόλη, 20 mM Tris-HCl [ρΗ 8,0], 500 mM NaCl). Το πρώτο και το δεύτερο κλάσματα χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω προετοιμασία. Για έκλουση των ΔH1-His και V11E-His, η στήλη Ni-NTA πλύθηκε με 12 mL ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει 25 mM ιμιδαζόλη (25 mM ιμιδαζόλη, 20 mM Tris-HCl [ρΗ 8,0], 500 mM NaCl), και στη συνέχεια το Η δεσμευμένη πρωτεΐνη εκλούστηκε σταδιακά με 0,5 mL ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει ιμιδαζόλη (50, 100, 150, 200, και 250 mM ιμιδαζόλης, 20 mM Tris-HCl [ρΗ 8,0], 500 mM NaCl). Τα κλάσματα της έκλουσης ιμιδαζόλης 200-250 mM συλλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω παρασκευή (Ohnishi et al., 2018). Το πρώτο και το δεύτερο κλάσματα χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω προετοιμασία. Για έκλουση των ΔH1-His και V11E-His, η στήλη Ni-NTA πλύθηκε με 12 mL ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει 25 mM ιμιδαζόλη (25 mM ιμιδαζόλη, 20 mM Tris-HCl [ρΗ 8,0], 500 mM NaCl), και στη συνέχεια το Η δεσμευμένη πρωτεΐνη εκλούστηκε σταδιακά με 0,5 mL ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει ιμιδαζόλη (50, 100, 150, 200, και 250 mM ιμιδαζόλης, 20 mM Tris-HCl [ρΗ 8,0], 500 mM NaCl). Τα κλάσματα της έκλουσης ιμιδαζόλης 200-250 mM συλλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω παρασκευή (Ohnishi et al., 2018). Το πρώτο και το δεύτερο κλάσματα χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω προετοιμασία. Για έκλουση των ΔH1-His και V11E-His, η στήλη Ni-NTA πλύθηκε με 12 mL ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει 25 mM ιμιδαζόλη (25 mM ιμιδαζόλη, 20 mM Tris-HCl [ρΗ 8,0], 500 mM NaCl), και στη συνέχεια το Η δεσμευμένη πρωτεΐνη εκλούστηκε σταδιακά με 0,5 mL ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει ιμιδαζόλη (50, 100, 150, 200, και 250 mM ιμιδαζόλης, 20 mM Tris-HCl [ρΗ 8,0], 500 mM NaCl). Τα κλάσματα της έκλουσης ιμιδαζόλης 200-250 mM συλλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω παρασκευή (Ohnishi et al., 2018). 20 mM Tris-HCl [ρΗ 8,0], 500 mM NaCl). Τα κλάσματα της έκλουσης ιμιδαζόλης 200-250 mM συλλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω παρασκευή (Ohnishi et al., 2018). 20 mM Tris-HCl [ρΗ 8,0], 500 mM NaCl). Τα κλάσματα της έκλουσης ιμιδαζόλης 200-250 mM συλλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω παρασκευή (Ohnishi et al., 2018).
Μετά την έκλουση, το ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει ιμιδαζόλη των ληφθέντων κλασμάτων ανταλλάχθηκε με 2 χ VIPP1 ρυθμιστικό διάλυμα αποθήκευσης (100 mM HEPES-NaOH [ρΗ 7,5], 100 mM KCl) χρησιμοποιώντας στήλη διήθησης γέλης midiTrap G-25 (GE Healthcare). Τα ληφθέντα κλάσματα που περιέχουν την επιθυμητή πρωτεΐνη επιβεβαιώθηκαν με χρώση SDS-PAGE και Coomassie brilliant blue (CBB) (βλ. παρακάτω), και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση (7.500 × g στους 4°C) για gt;2 ώρες με Amicon Ultra-4 Στήλη υπερδιήθησης (10Κ) (Merck KGaA, Darmstadt, Γερμανία) για συμπύκνωση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης Bradford (BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA). Ένα κλάσμα του διαλύματος πρωτεΐνης (~10 μL) αραιώθηκε σε 1,0 μg μL -1με 2 x VIPP1 ρυθμιστικό διάλυμα αποθήκευσης και στη συνέχεια αναμειγνύεται με ίση ποσότητα γλυκερόλης για να σχηματιστεί ένα μητρικό διάλυμα 0,5 μg μL -1 . Τα μητρικά διαλύματα αποθηκεύτηκαν στους -30°C και χρησιμοποιήθηκαν εντός 1 εβδομάδας για προσδιορισμούς υδρόλυσης ATP και GTP. Το υπόλοιπο διάλυμα συμπυκνωμένης πρωτεΐνης χωρίς γλυκερίνη καταψύχθηκε αμέσως σε υγρό άζωτο και διατηρήθηκε στους -80°C και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για αναλύσεις ΗΜ.
Δραστηριότητα υδρόλυσης ATP και GTP
Οι μετρήσεις της δραστηριότητας υδρόλυσης ATP και GTP έγιναν χρησιμοποιώντας ένα κιτ προσδιορισμού ATPase ή GTPase (Expedeon Ltd., Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο), ένα σύστημα ανίχνευσης με βάση τη βαφή με PiColorLock™, το οποίο περιγράφεται ως «ανώτερο αντιδραστήριο πράσινου μαλαχίτη που καταστέλλει μη ενζυματική υδρόλυση ATP/GTP» στις οδηγίες του κατασκευαστή. Διεξάγαμε όλες τις αντιδράσεις σε κλίμακα 200 μL σύμφωνα με το εγχειρίδιο οδηγιών. Το μείγμα της αντίδρασης περιείχε 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2,5 mM MgCl2, 0,5 mM ATP ή GTP, στο οποίο προστέθηκαν 1,0 μg ή 0,5 μg ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης με επισήμανση His για προσδιορισμούς υδρόλυσης ATP ή GTP, αντίστοιχα. Για τις αναλύσεις δισθενών κατιόντων, το MgCl2 αντικαταστάθηκε με άλλα είδη χλωρίου (CaCl2, MnCl2 και ZnCl2) στην ίδια συγκέντρωση. Τα μίγματα της αντίδρασης επωάστηκαν στους 37°C για 30 λεπτά και μετά ψύχθηκαν αμέσως σε παγωμένο νερό για 1 λεπτό. Στη συνέχεια, κάθε αντίδραση τερματίστηκε με την προσθήκη της κατάλληλης ποσότητας PiColorLock™ σε θερμοκρασία δωματίου. Το Pi που απελευθερώθηκε ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 635 nm και σύγκριση με τυπικά διαλύματα. Επειδή το μίγμα της αντίδρασης χωρίς μόνο ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες έδειχνε συχνά ένα ανοιχτό πράσινο χρώμα, η απορρόφησή του αφαιρέθηκε ως φόντο σε κάθε πείραμα. Εκτός εάν περιγράφεται συγκεκριμένα, η σύνθεση του μίγματος της αντίδρασης και ο χρόνος επώασης χρησιμοποιήθηκαν ως τυπικές συνθήκες. Επειδή το μίγμα της αντίδρασης χωρίς μόνο ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες έδειχνε συχνά ένα ανοιχτό πράσινο χρώμα, η απορρόφησή του αφαιρέθηκε ως φόντο σε κάθε πείραμα. Εκτός εάν περιγράφεται συγκεκριμένα, η σύνθεση του μίγματος της αντίδρασης και ο χρόνος επώασης χρησιμοποιήθηκαν ως τυπικές συνθήκες. Επειδή το μίγμα της αντίδρασης χωρίς μόνο ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες έδειχνε συχνά ένα ανοιχτό πράσινο χρώμα, η απορρόφησή του αφαιρέθηκε ως φόντο σε κάθε πείραμα. Εκτός εάν περιγράφεται συγκεκριμένα, η σύνθεση του μίγματος της αντίδρασης και ο χρόνος επώασης χρησιμοποιήθηκαν ως τυπικές συνθήκες.
Δοκιμασία κηλίδας κουκκίδας
Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ AtVIPP1-His και ΑΤΡ αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία κηλίδας κηλίδας όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Diekmann and Hall, 1995) με ορισμένες τροποποιήσεις. Εν συντομία, 5 μg AtVIPP1wt, ΔH1 ή BSA εντοπίστηκαν σε όγκο 5 μL σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Η μεμβράνη στη συνέχεια ξηράνθηκε στον αέρα για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες επωάστηκαν στο ρυθμιστικό κηλίδωσης (100 mM Tris-HCl [ρΗ 7,5], 1 mM MgCl2, 25 mM KCl, 100 mM NaCl) για τουλάχιστον 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από συμπλήρωση με 20.000 μCi [α- 32 P]ATP (ειδική δραστηριότητα 3000 Ci mmol –1), η επώαση συνεχίστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Οι μεμβράνες πλύθηκαν με ρυθμιστικό έκπλυσης (ρυθμιστικό διάλυμα στύπωσης συμπληρωμένο με 0,2% Tween-20) τρεις φορές και στη συνέχεια ξηράνθηκαν στον αέρα. Τα σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή βιο-απεικόνισης (BAS1000; Fuji Photo Film, Τόκιο, Ιαπωνία).
SDS-PAGE και Ανάλυση ανοσοστύπωσης
Δείγματα είτε διαλυτών πρωτεϊνών που ελήφθησαν από κύτταρα Ε. coli είτε καθαρισμένες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες διαλυτοποιήθηκαν με επώαση στους 75°C για 5 λεπτά παρουσία 2% SDS και 0,1 Μ DTT. Τα δείγματα πρωτεΐνης φυγοκεντρήθηκαν για 2 λεπτά σε gt;20.000 χ g και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE χρησιμοποιώντας πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 12,5% (β/ο). Οι πρωτεΐνες στο πήκτωμα εμφανίστηκαν στη συνέχεια με χρώση με CBB Stain ONE (Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Ιαπωνία). Στην περίπτωση των αναλύσεων ανοσοστύπωσης, οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες κηλιδώθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνες φθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) και διερευνήθηκαν με πολυκλωνικά αντισώματα που αναπτύχθηκαν έναντι του AtVIPP1-His. Τα σήματα οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αντιδραστήριο χημειοφωταύγειας (υπόστρωμα Luminata Crescendo Western HRP· Merk KGaA) και ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή ChemiDoc (BioRad Laboratories Inc.).
Αναλύσεις Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης
Τα μείγματα αντίδρασης από την υδρόλυση ATP/GTP για αναλύσεις υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC) παρασκευάστηκαν με αυξημένη ποσότητα VIPP1-His (2,5 μg/200 μL αντίδραση) για να ληφθούν ισχυρά σήματα σε κάθε χρονικό σημείο. Μετά την επώαση στους 37°C όπως περιγράφεται παραπάνω, τα μείγματα της αντίδρασης διατηρήθηκαν σε παγωμένο νερό για 0,5-4 ώρες μέχρι να πραγματοποιηθούν οι αναλύσεις HPLC.
Ένα κλάσμα του μίγματος της αντίδρασης (20 μL) υποβλήθηκε σε HPLC χρησιμοποιώντας στήλη Cosmosil C18 (4,6 × 250 mm, Nacalai Tesque) εξισορροπημένη με 50 mM διόξινο φωσφορικό κάλιο (pH 4,6), 25 mM τετραβουτυλαμμώνιο a% hydrogen0sulfate. ρυθμός ροής 1 mL/min (Akhova and Tkachenko, 2019). Το υπόστρωμα και το προϊόν αντίδρασης ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας απορρόφηση στα 254 nm. Η συγκέντρωση της ADP και του ΑΕΠ σε κάθε χρονική στιγμή υπολογίστηκε με βάση την περιοχή των τυπικών δειγμάτων. Προκειμένου να εκτιμηθούν οι πραγματικές αυξήσεις, η συγκέντρωση τη στιγμή 0 αφαιρέθηκε από τις τιμές κάθε χρονικού σημείου ως φόντο.
Φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας σακχαρόζης
Αφού ένα κλάσμα διαλύματος που περιείχε 2 μg ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών πληρώθηκε έως και 100 μL με ρυθμιστικό διάλυμα αποθήκευσης (50 mM HEPES-NaOH [pH 7,5], 50 mM KCl), επιστρώθηκε σε μια συνεχή βαθμίδα πυκνότητας σακχαρόζης (0,4–1,6 M ) που περιέχει 50 mM HEPES-NaOH (ρΗ 7,5) και 50 mM KCl. Κάθε βαθμίδωση φυγοκεντρήθηκε στα 85.000 χ g για 15 ώρες στους 4°C (ρότορας SW50.1, Beckman Coulter Inc., Brea, CA). Μετά τη φυγοκέντρηση, οι βαθμίδες κλασματώθηκαν σε 25 κλάσματα (200 μL το καθένα) από πάνω προς τα κάτω. Ένα κλάσμα από κάθε κλάσμα υποβλήθηκε σε SDS-PAGE και επακόλουθες αναλύσεις ανοσοστύπωσης με ένα ειδικό αντίσωμα κατά του VIPP1 όπως περιγράφεται παραπάνω.
Ηλεκτρονική μικροσκοπία αρνητικής χρώσης
Το πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε για τις ΗΜ παρατηρήσεις βασίστηκε σε αυτό των Kondo et al. (2009) με μικρές τροποποιήσεις. Χάλκινα πλέγματα σταθεροποιημένα με άνθρακα (400 mesh) επικαλυμμένα με κολλίδιο υδροφιλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας σύστημα υδροφιλοποίησης ΗΜ (DII-29020HD, JEOL, Ltd., Τόκιο, Ιαπωνία) και περίπου 10 μL δειγμάτων πρωτεΐνης AtVIPP1-His (3,5–5,5 μg /μL) τοποθετήθηκαν στο πλέγμα. Στη συνέχεια, τα δείγματα στα πλέγματα χρωματίστηκαν αρνητικά με 2% (w/v) οξικό ουρανύλιο ή με χρώση ΕΜ (EM stainer, Nissin EM Co., Tokyo, Japan) (Nakakoshi et al., 2011). Τα χρωματισμένα δείγματα στη συνέχεια παρατηρήθηκαν με χρήση EM (Hitachi model H-7650 transmission electronic microscope, Tokyo, Japan) και φωτογραφήθηκαν ως ψηφιακές εικόνες.
Αποτελέσματα
Αξιολόγηση της δραστηριότητας υδρόλυσης ATP της πρωτεΐνης που προκαλεί κυστίδια στο Plastid 1-His Protein
Παρασκευάσαμε πρωτεΐνες VIPP1 με επισήμανση C-τελικού άκρου His (AtVIPP1-His) χωρίς το Ν-τερματικό πεπτίδιο διέλευσης όπως χρησιμοποιήθηκε προηγουμένως (Εικόνα 1Α και Συμπληρωματικό Σχήμα 1Α· Ohnishi et al., 2018). Αρχικά, δοκιμάσαμε ένα χρωματομετρικό σύστημα ανίχνευσης με βάση το πράσινο του Μαλαχίτη όπως περιγράφεται στις Μέθοδοι. Η αύξηση του απελευθερωμένου ανόργανου φωσφορικού (Pi), αναλογικά με τις ποσότητες του AtVIPP-His (εντός του εύρους 5 μg), ανιχνεύθηκε εύκολα (Εικόνες 1B,C). Δοκιμάσαμε επίσης άλλα τριφωσφορικά νουκλεοτίδια, CTP και UTP, ως υποστρώματα. Ακόμη και με την παρουσία 2,0 μg AtVIPP1, η απελευθέρωση του Pi ήταν πολύ χαμηλή, υποδεικνύοντας την ειδικότητα του υποστρώματος του AtVIPP1 μόνο σε GTP και ATP (Συμπληρωματικό Σχήμα 2). Επιλέξαμε 1,0 μg πρωτεΐνης VIPP1-His για περαιτέρω αναλύσεις. Η εξαρτώμενη από το VIPP1 απελευθέρωση του Pi από το ATP εξετάστηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας ένα πείραμα χρονικής πορείας.
Σχήμα 1. Υδρόλυση ΑΤΡ και δέσμευση από ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες AtVIPP1. (Α) Σχηματική απεικόνιση της δευτερεύουσας δομής του Arabidopsis VIPP1 (υιοθετήθηκε από τους Ohnishi et al. (2018)). Το H υποδηλώνει μια προβλεπόμενη α-έλικα δομή. Οι αριθμοί δείχνουν τις θέσεις του πρώτου (αριστερά) έως του τελευταίου (δεξιά) αμινοξέος των πρωτεϊνών. Η θέση μετάλλαξης του N16I υποδεικνύεται περίπου με μια αιχμή βέλους. Η λεπτομερής αλληλουχία του Η1 φαίνεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 4. (Β) Μια φωτογραφία τυπικής ανάλυσης με βάση το πράσινο μαλαχίτη για υδρόλυση ΑΤΡ. Το πράσινο χρώμα υποδηλώνει την παρουσία ελεύθερου ανόργανου φωσφορικού άλατος (Pi). (ΝΤΟ)Το επίπεδο του Pi που απελευθερώνεται από το ATP αναλύθηκε χρησιμοποιώντας διάφορες ποσότητες πρωτεΐνης VIPP1 άγριου τύπου (0,25–5,0 μg σε 200 μL μείγματος αντίδρασης) με τη δοκιμασία με βάση το πράσινο του μαλαχίτη. (Δ) Χρονοεξαρτώμενη αύξηση του απελευθερωμένου Pi παρουσία της πρωτεΐνης VIPP1-His. Τα μίγματα της αντίδρασης επωάστηκαν για 0, 7,5, 15 και 30 λεπτά στους 37°C, στη συνέχεια ποσοτικοποιήθηκε το ελεύθερο Pi. Κάθε σημείο δεδομένων και γραμμή σφάλματος αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή και το SE, αντίστοιχα, που υπολογίστηκαν από τα αποτελέσματα από 4-6 ανεξάρτητα πειράματα. (ΜΙ)Αναλύθηκε η δραστικότητα υδρόλυσης ΑΤΡ των πρωτεϊνών VIPP1-His άγριου τύπου, Ν-τερματικού και C-τερματικού μεταλλαγμένου. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε τυπική κατάσταση (βλ. Μέθοδοι). Κάθε ραβδωτό γράφημα και γραμμή σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή και το SE, αντίστοιχα, των αποτελεσμάτων από 4-6 ανεξάρτητα πειράματα. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν σημαντικές διαφορές στη δραστηριότητα από πρωτεΐνες άγριου τύπου (Welch’s t-test με p lt;0,01). (ΣΤ) Άμεση δοκιμή δέσμευσης ATP της πρωτεΐνης VIPP1-His. Τα VIPP1-His, ΔH1 και BSA τοποθετήθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και στη συνέχεια επωάστηκαν με ραδιοσημασμένο ATP ([α− 32 P]ATP) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Τα σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα BAS1000.
Η πρωτεΐνη που επάγει κυστίδια στο πλαστίδιο 1 είχε αρχικά προβλεφθεί ότι θα σχηματίσει επτά α-έλικες (Η1, Η2, Η3, Η4/Η5, Η6 και Η7, Εικόνα 1Α), στις οποίες το Ν-τελικό Η1 είναι σημαντικό για τη δέσμευση των λιπιδίων ( Otters et al., 2013) και H7 σχηματίζει μια εγγενώς διαταραγμένη περιοχή (Zhang et al., 2016a). Για να ελέγξουμε την περιοχή που είναι σημαντική για αυτή τη δραστηριότητα υδρόλυσης ATP, παρασκευάσαμε Ν-τερματικά κολοβωμένα έλικα (ΔH1), H1 μεταλλαγμένα σε σημείο (N16I, βλέπε επίσης συμπληρωματικά σχήματα 5A,B) και C-τερματικά περικομμένα (ΔH5-7) AtVIPP1s (Ohnishi et al., 2018). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Ε, η δραστικότητα του ΔΗ1 καταργήθηκε σχεδόν και το Ν16Ι έδειξε περίπου 50% δραστικότητα σε σύγκριση με την πρωτεΐνη άγριου τύπου. Αντίθετα, η δραστηριότητα του ΔH5-7 ήταν τόσο υψηλή όσο και του άγριου τύπου, αν και τα αποτελέσματα ήταν μεταβλητά. Συνολικά, οι τάσεις ήταν παρόμοιες με αυτές της δραστηριότητας υδρόλυσης GTP (Ohnishi et al., 2018).32 P] ATP έδειξε ότι το AtVIPP1 δέσμευε έντονα το ATP, ενώ το ΔH1 έδειξε ένα αχνό σήμα (Εικόνα 1F). Καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το Η1 είναι κρίσιμο για τις δραστηριότητες υδρόλυσης ATP και GTP του AtVIPP1.
Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης Ανίχνευση ADP/GDP σε αντιδράσεις υδρόλυσης νουκλεοτιδίων
Στη συνέχεια αξιολογήσαμε ποια είδη τελικών προϊόντων λαμβάνονται στην πραγματικότητα από τις αντιδράσεις υδρόλυσης: γενικά, οι ATPάσες και οι GTPάσες απελευθερώνουν το Pi συν ADP και GDP, αντίστοιχα, αλλά υπάρχουν τα ένζυμα που είναι ικανά να καταλύουν τόσο το ATP-to-ADP όσο και ADP-to-AMP (Smith et al., 2002) ή GTP-to-GDP και GDP-to-GMP (Schwemmle and Staeheli, 1994· Hyun et al., 2000). Η ανάλυση HPLC έδειξε μόνο μία κορυφή έκλουσης κατά τη διάρκεια της αντίδρασης εκτός από μια κορυφή υπερβολής που αντιστοιχεί στο υπόστρωμα ΑΤΡ (~19 λεπτά) ή GTP (~27 λεπτά). Με βάση τα προφίλ έκλουσης τυπικών δειγμάτων (Συμπληρωματικό Σχήμα 3Α), οι κορυφές έκλουσης που εμφανίστηκαν στα ~7 λεπτά και ~9 λεπτά προσδιορίστηκαν ως ADP και GDP, αντίστοιχα (Εικόνα 2Α). Σύμφωνα με την εκτίμηση, το ADP αυξήθηκε σε 4,6 ± 0,7 και 8,1 ± 1,0 μM στα 15 και 30 λεπτά, αντίστοιχα. Στην ίδια αντίδραση, Το Pi που υπολογίστηκε με χρωματομετρική ανίχνευση αυξήθηκε σε 3,4 ± 0,4 και 8,9 ± 1,1 μΜ στα 15 και 30 λεπτά, αντίστοιχα (Εικόνα 2Β). Οι στατιστικές αναλύσεις έδειξαν ότι, και στα δύο χρονικά σημεία, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στις συγκεντρώσεις μεταξύ του επιπέδου του ADP και αυτού του Pi, υποδεικνύοντας στοιχειομετρική αύξηση στα δύο προϊόντα. Ομοίως, το GDP και το ελεύθερο Pi ήταν στοιχειομετρικά όταν η αντίδραση διεξήχθη παρουσία GTP (Εικόνα 2Β). Η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ΔΗ1 δεν αύξησε το επίπεδο ούτε του ADP ούτε του GDP (Συμπληρωματικό Σχήμα 3Β). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το AtVIPP1 κατέλυσε τη μετατροπή του ATP σε ADP και του GTP σε GDP επίσης, αλλά ούτε το ADP ούτε το GDP μετατράπηκαν σε μονοφωσφορικά νουκλεοτίδια, τουλάχιστον σε αυτή τη χρονική κλίμακα. αντίστοιχα (Εικόνα 2Β). Οι στατιστικές αναλύσεις έδειξαν ότι, και στα δύο χρονικά σημεία, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στις συγκεντρώσεις μεταξύ του επιπέδου του ADP και αυτού του Pi, υποδεικνύοντας στοιχειομετρική αύξηση στα δύο προϊόντα. Ομοίως, το GDP και το ελεύθερο Pi ήταν στοιχειομετρικά όταν η αντίδραση διεξήχθη παρουσία GTP (Εικόνα 2Β). Η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ΔΗ1 δεν αύξησε το επίπεδο ούτε του ADP ούτε του GDP (Συμπληρωματικό Σχήμα 3Β). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το AtVIPP1 κατέλυσε τη μετατροπή του ATP σε ADP και του GTP σε GDP επίσης, αλλά ούτε το ADP ούτε το GDP μετατράπηκαν σε μονοφωσφορικά νουκλεοτίδια, τουλάχιστον σε αυτή τη χρονική κλίμακα. αντίστοιχα (Εικόνα 2Β). Οι στατιστικές αναλύσεις έδειξαν ότι, και στα δύο χρονικά σημεία, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στις συγκεντρώσεις μεταξύ του επιπέδου του ADP και αυτού του Pi, υποδεικνύοντας στοιχειομετρική αύξηση στα δύο προϊόντα. Ομοίως, το GDP και το ελεύθερο Pi ήταν στοιχειομετρικά όταν η αντίδραση διεξήχθη παρουσία GTP (Εικόνα 2Β). Η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ΔΗ1 δεν αύξησε το επίπεδο ούτε του ADP ούτε του GDP (Συμπληρωματικό Σχήμα 3Β). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το AtVIPP1 κατέλυσε τη μετατροπή του ATP σε ADP και του GTP σε GDP επίσης, αλλά ούτε το ADP ούτε το GDP μετατράπηκαν σε μονοφωσφορικά νουκλεοτίδια, τουλάχιστον σε αυτή τη χρονική κλίμακα. υποδηλώνοντας στοιχειομετρική αύξηση στα δύο προϊόντα. Ομοίως, το GDP και το ελεύθερο Pi ήταν στοιχειομετρικά όταν η αντίδραση διεξήχθη παρουσία GTP (Εικόνα 2Β). Η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ΔΗ1 δεν αύξησε το επίπεδο ούτε του ADP ούτε του GDP (Συμπληρωματικό Σχήμα 3Β). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το AtVIPP1 κατέλυσε τη μετατροπή του ATP σε ADP και του GTP σε GDP επίσης, αλλά ούτε το ADP ούτε το GDP μετατράπηκαν σε μονοφωσφορικά νουκλεοτίδια, τουλάχιστον σε αυτή τη χρονική κλίμακα. υποδηλώνοντας στοιχειομετρική αύξηση στα δύο προϊόντα. Ομοίως, το GDP και το ελεύθερο Pi ήταν στοιχειομετρικά όταν η αντίδραση διεξήχθη παρουσία GTP (Εικόνα 2Β). Η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ΔΗ1 δεν αύξησε το επίπεδο ούτε του ADP ούτε του GDP (Συμπληρωματικό Σχήμα 3Β). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το AtVIPP1 κατέλυσε τη μετατροπή του ATP σε ADP και του GTP σε GDP επίσης, αλλά ούτε το ADP ούτε το GDP μετατράπηκαν σε μονοφωσφορικά νουκλεοτίδια, τουλάχιστον σε αυτή τη χρονική κλίμακα.
Σχήμα 2. Χρονοεξαρτώμενη αύξηση σε ADP/GDP και Pi. (Α) Αντιπροσωπευτικά προφίλ έκλουσης που λαμβάνονται από τα μείγματα αντίδρασης μετά από υδρόλυση ΑΤΡ και GTP. Για να ληφθούν αρκετά υψηλά σήματα για ανίχνευση, οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν με την προσθήκη 2,5 μg πρωτεΐνης VIPP1-His αντί 1,0 μg πρωτεΐνης σε τυπικές συνθήκες. Οι κορυφές έκλουσης που αντιστοιχούν σε ADP (στήλη για υδρόλυση ATP) και GDP (στήλη για υδρόλυση GTP) υποδεικνύονται με κόκκινα βέλη. (Β) Γραφήματα χρονικής πορείας που υποδεικνύουν αυξήσεις στα επίπεδα της ADP και του ΑΕΠ, τα οποία προέκυψαν με ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων από αναλύσεις HPLC στο πλαίσιο (Α). Η αύξηση του επιπέδου του Pi που αναλύθηκε στις ίδιες συνθήκες (με χρήση 2,5 μg πρωτεΐνης VIPP1-His) φαίνεται επίσης στα γραφήματα. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο χρονικών σημείων σύμφωνα με μια στατιστική ανάλυση. § Κάτω από τα σημεία δεδομένων δεν υποδηλώνει καμία σημαντική διαφορά μεταξύ της συγκέντρωσης του ADP/GDP και του ελεύθερου Pi σε κάθε χρονική στιγμή (Welch’s t-test, p lt;0,05). Γραμμές σφάλματος: ± SE.
Προτίμηση pH στις αντιδράσεις υδρόλυσης νουκλεοτιδίων
Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν η δραστηριότητα υδρόλυσης ATP/GTP προτιμά είτε όξινες, ουδέτερες ή αλκαλικές συνθήκες, επειδή κάθε διαλυτό διαμέρισμα του χλωροπλάστη (δηλαδή, ο ενδομεμβρανικός χώρος του φακέλου, του στρώματος και του αυλού του θυλακοειδούς) έχει διαφορετικές τιμές pH (Höhner et al., 2016), η οποία υπόκειται σε δυναμική αλλαγή κατά τη διάρκεια φωτοσυνθετικών αντιδράσεων, ειδικά κάτω από το φυσικό κυμαινόμενο ηλιακό φως. Μεταξύ των εξεταζόμενων συνθηκών pH, η δραστικότητα υδρόλυσης ΑΤΡ ήταν ελαφρώς χαμηλότερη σε pH 6,5. Η δραστηριότητα έτεινε να αυξάνεται σε αλκαλικές συνθήκες, αλλά οι στατιστικές αναλύσεις έδειξαν ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στη δραστηριότητα μεταξύ pH 7,5 και pH 8,5. Από την άλλη πλευρά, η δραστικότητα υδρόλυσης GTP ήταν υψηλότερη σε pH 7,5 από ότι σε pH 6,5 ή 8,5 (Εικόνα 3Α), υποδεικνύοντας ότι οι ουδέτερες συνθήκες ήταν βέλτιστες για τις αντιδράσεις υδρόλυσης GTP του AtVIPP1. Επειδή οι θεωρητικές τιμές KM και Vmax για την υδρόλυση GTP έχουν αναλυθεί σε ρΗ 7,5 προηγουμένως, αυτές οι τιμές για την αντίδραση υδρόλυσης ATP δοκιμάστηκαν επίσης (Πίνακας 1). Μετρήσαμε τη δραστηριότητα υδρόλυσης ATP παρουσία πολλών συγκεντρώσεων ATP και δημιουργήσαμε ένα διάγραμμα Cornish-Bowden και λάβαμε τις τιμές Vmax και KM από τον μέσο όρο των τιμών x και y των σημείων τομής (Eisenthal and Cornish-Bowden, 1974; Berges et. al., 1994). Το Vmax και το KM υπολογίστηκαν ως 1,2 μΜ απελευθέρωση Pi/μg πρωτεΐνης/λεπτό και 3,21 mM, αντίστοιχα (Εικόνα 3Β και Πίνακας 1). Αυτό έδειξε ότι τόσο ο καταλυτικός ρυθμός όσο και η συγγένεια του υποστρώματος ήταν χαμηλότερες από εκείνες για την αντίδραση υδρόλυσης GTP που αναφέραμε προηγουμένως (Πίνακας 1; Ohnishi et al., 2018). Επειδή οι θεωρητικές τιμές KM και Vmax για την υδρόλυση GTP έχουν αναλυθεί σε ρΗ 7,5 προηγουμένως, αυτές οι τιμές για την αντίδραση υδρόλυσης ATP δοκιμάστηκαν επίσης (Πίνακας 1). Μετρήσαμε τη δραστηριότητα υδρόλυσης ATP παρουσία πολλών συγκεντρώσεων ATP και δημιουργήσαμε ένα διάγραμμα Cornish-Bowden και λάβαμε τις τιμές Vmax και KM από τον μέσο όρο των τιμών x και y των σημείων τομής (Eisenthal and Cornish-Bowden, 1974; Berges et. al., 1994). Το Vmax και το KM υπολογίστηκαν ως 1,2 μΜ απελευθέρωση Pi/μg πρωτεΐνης/λεπτό και 3,21 mM, αντίστοιχα (Εικόνα 3Β και Πίνακας 1). Αυτό έδειξε ότι τόσο ο καταλυτικός ρυθμός όσο και η συγγένεια του υποστρώματος ήταν χαμηλότερες από εκείνες για την αντίδραση υδρόλυσης GTP που αναφέραμε προηγουμένως (Πίνακας 1; Ohnishi et al., 2018). Επειδή οι θεωρητικές τιμές KM και Vmax για την υδρόλυση GTP έχουν αναλυθεί σε ρΗ 7,5 προηγουμένως, αυτές οι τιμές για την αντίδραση υδρόλυσης ATP δοκιμάστηκαν επίσης (Πίνακας 1). Μετρήσαμε τη δραστηριότητα υδρόλυσης ATP παρουσία πολλών συγκεντρώσεων ATP και δημιουργήσαμε ένα διάγραμμα Cornish-Bowden και λάβαμε τις τιμές Vmax και KM από τον μέσο όρο των τιμών x και y των σημείων τομής (Eisenthal and Cornish-Bowden, 1974; Berges et. al., 1994). Το Vmax και το KM υπολογίστηκαν ως 1,2 μΜ απελευθέρωση Pi/μg πρωτεΐνης/λεπτό και 3,21 mM, αντίστοιχα (Εικόνα 3Β και Πίνακας 1). Αυτό έδειξε ότι τόσο ο καταλυτικός ρυθμός όσο και η συγγένεια του υποστρώματος ήταν χαμηλότερες από εκείνες για την αντίδραση υδρόλυσης GTP που αναφέραμε προηγουμένως (Πίνακας 1; Ohnishi et al., 2018). Αυτές οι τιμές για την αντίδραση υδρόλυσης ΑΤΡ δοκιμάστηκαν επίσης (Πίνακας 1). Μετρήσαμε τη δραστηριότητα υδρόλυσης ATP παρουσία πολλών συγκεντρώσεων ATP και δημιουργήσαμε ένα διάγραμμα Cornish-Bowden και λάβαμε τις τιμές Vmax και KM από τον μέσο όρο των τιμών x και y των σημείων τομής (Eisenthal and Cornish-Bowden, 1974; Berges et. al., 1994). Το Vmax και το KM υπολογίστηκαν ως 1,2 μΜ απελευθέρωση Pi/μg πρωτεΐνης/λεπτό και 3,21 mM, αντίστοιχα (Εικόνα 3Β και Πίνακας 1). Αυτό έδειξε ότι τόσο ο καταλυτικός ρυθμός όσο και η συγγένεια του υποστρώματος ήταν χαμηλότερες από εκείνες για την αντίδραση υδρόλυσης GTP που αναφέραμε προηγουμένως (Πίνακας 1; Ohnishi et al., 2018). Αυτές οι τιμές για την αντίδραση υδρόλυσης ΑΤΡ δοκιμάστηκαν επίσης (Πίνακας 1). Μετρήσαμε τη δραστηριότητα υδρόλυσης ATP παρουσία πολλών συγκεντρώσεων ATP και δημιουργήσαμε ένα διάγραμμα Cornish-Bowden και λάβαμε τις τιμές Vmax και KM από τον μέσο όρο των τιμών x και y των σημείων τομής (Eisenthal and Cornish-Bowden, 1974; Berges et. al., 1994). Το Vmax και το KM υπολογίστηκαν ως 1,2 μΜ απελευθέρωση Pi/μg πρωτεΐνης/λεπτό και 3,21 mM, αντίστοιχα (Εικόνα 3Β και Πίνακας 1). Αυτό έδειξε ότι τόσο ο καταλυτικός ρυθμός όσο και η συγγένεια του υποστρώματος ήταν χαμηλότερες από εκείνες για την αντίδραση υδρόλυσης GTP που αναφέραμε προηγουμένως (Πίνακας 1; Ohnishi et al., 2018). Μετρήσαμε τη δραστηριότητα υδρόλυσης ATP παρουσία πολλών συγκεντρώσεων ATP και δημιουργήσαμε ένα διάγραμμα Cornish-Bowden και λάβαμε τις τιμές Vmax και KM από τον μέσο όρο των τιμών x και y των σημείων τομής (Eisenthal and Cornish-Bowden, 1974; Berges et. al., 1994). Το Vmax και το KM υπολογίστηκαν ως 1,2 μΜ απελευθέρωση Pi/μg πρωτεΐνης/λεπτό και 3,21 mM, αντίστοιχα (Εικόνα 3Β και Πίνακας 1). Αυτό έδειξε ότι τόσο ο καταλυτικός ρυθμός όσο και η συγγένεια του υποστρώματος ήταν χαμηλότερες από εκείνες για την αντίδραση υδρόλυσης GTP που αναφέραμε προηγουμένως (Πίνακας 1; Ohnishi et al., 2018). Μετρήσαμε τη δραστηριότητα υδρόλυσης ATP παρουσία πολλών συγκεντρώσεων ATP και δημιουργήσαμε ένα διάγραμμα Cornish-Bowden και λάβαμε τις τιμές Vmax και KM από τον μέσο όρο των τιμών x και y των σημείων τομής (Eisenthal and Cornish-Bowden, 1974; Berges et. al., 1994). Το Vmax και το KM υπολογίστηκαν ως 1,2 μΜ απελευθέρωση Pi/μg πρωτεΐνης/λεπτό και 3,21 mM, αντίστοιχα (Εικόνα 3Β και Πίνακας 1). Αυτό έδειξε ότι τόσο ο καταλυτικός ρυθμός όσο και η συγγένεια του υποστρώματος ήταν χαμηλότερες από εκείνες για την αντίδραση υδρόλυσης GTP που αναφέραμε προηγουμένως (Πίνακας 1; Ohnishi et al., 2018).
Εικόνα 3. Χαρακτηρισμός της δραστηριότητας υδρόλυσης ΑΤΡ. (Α) Αναλύθηκαν οι προτιμήσεις του pH τόσο των δράσεων υδρόλυσης ΑΤΡ όσο και GTP. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν σημαντικές διαφορές στη δραστηριότητα από εκείνες σε pH 7,5 (Welch’s t-test με p lt; 0,01). (Β) Αναλύσεις Vmax και KM της δραστικότητας υδρόλυσης ΑΤΡ. Η δραστικότητα υδρόλυσης ATP μετρήθηκε παρουσία τεσσάρων συγκεντρώσεων ATP (0,5-4,0 mM). Κάθε ραβδωτό γράφημα και γραμμή σφάλματος αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο και το SD, αντίστοιχα, των αποτελεσμάτων από 5-9 ανεξάρτητα πειράματα (αριστερό γράφημα). Η συγκέντρωση του ATP και ο μέσος όρος της απελευθέρωσης Pi που εξαρτάται από το VIPP1 απεικονίζονται στο γράφημα σύμφωνα με τη μέθοδο γραφικής παράστασης Cornish–Bowden. Οι τιμές X και Y των σημείων τομής αντιπροσωπεύουν KM και Vmax, αντίστοιχα (δεξιό γράφημα).
Πίνακας 1. Vmax και KM των δραστηριοτήτων υδρόλυσης ΑΤΡ- και GTP του AtVIPP1-His.
Απαίτηση για διαφορετικά δισθενή κατιόντα στις αντιδράσεις υδρόλυσης νουκλεοτιδίων
Δείξαμε προηγουμένως ότι η αντίδραση υδρόλυσης GTP του AtVIPP1 εξαρτάται από ιόντα Mg 2 (Ohnishi et al., 2018), ενώ το Synechocystis VIPP1 (SynVIPP1) δεν απαιτεί δισθενή κατιόντα (Junglas et al., 2020). Στην παρούσα μελέτη, δοκιμάσαμε τις επιδράσεις τεσσάρων διαφορετικών δισθενών κατιόντων (Mg 2 , Mn 2 , Ca 2 και Zn 2 ) τόσο στις δραστηριότητες υδρόλυσης ATP- όσο και σε GTP (Εικόνα 4Α). Η δραστικότητα υδρόλυσης GTP αναλύθηκε προηγουμένως παρουσία Mg2 και Ca2 . Αν και δοκιμάσαμε δύο επιπλέον δισθενή κατιόντα, το Mn 2 και το Zn 2 , κανένα από τα δύο δεν παρείχε πλήρη δραστικότητα υδρόλυσης GTP, υποδεικνύοντας υψηλή εξάρτηση από Mg2 ιόντα. Αντίθετα, η υδρόλυση ATP παρουσία Ca2 ήταν ισοδύναμη με εκείνη παρουσία Mg2 . Τα προϊόντα των αντιδράσεων παρουσία Ca2 αναλύθηκαν επίσης με HPLC, δείχνοντας προφίλ έκλουσης παρόμοια με αυτά στην περίπτωση του Mg 2 (Συμπληρωματικό Σχήμα 4). Η συγκέντρωση του ADP δεν διέφερε σημαντικά από το Pi σε κάθε χρονικό σημείο (Εικόνα 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η δραστικότητα υδρόλυσης ΑΤΡ ήταν σε θέση να λειτουργήσει παρουσία είτε Mg2 είτε Ca2 , σε αντίθεση με τη δραστικότητα υδρόλυσης GTP.
Σχήμα 4. Απαίτηση για δισθενή κατιόντα. (Α) Τόσο οι δραστηριότητες υδρόλυσης ATP- όσο και GTP μετρήθηκαν απουσία (εμφανίζεται ως “-“) ή παρουσία τεσσάρων ειδών δισθενών κατιόντων (Mg 2 , Ca 2 , Mn 2 και Zn 2 ). ns: Δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές σύμφωνα με μια στατιστική ανάλυση (Welch’s t-test, p lt;0,01). (Β) Γραφήματα χρονικής πορείας που υποδεικνύουν την αύξηση της ADP και του ΑΕΠ παρουσία Ca 2 , τα οποία ελήφθησαν από αναλύσεις HPLC στο Συμπληρωματικό Σχήμα 4. Το επίπεδο του Pi που αναλύθηκε στις ίδιες συνθήκες (με 2,5 μg πρωτεΐνης VIPP1-His) απεικονίζεται επίσης στα γραφήματα. Ένας αστερίσκος υποδεικνύει μια σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο χρονικών σημείων, ενώ δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στα χρονικά σημεία που εμφανίζονται ως “ns” σύμφωνα με μια στατιστική ανάλυση. § Υποδηλώνει ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των επιπέδων του ADP/GDP και του ελεύθερου Pi σε κάθε χρονική στιγμή (Welch’s t-test, p lt; 0,01, n = 4-6).
Εξετάσαμε την αμοιβαία επίδραση δύο παραγόντων, Ca 2 και pH, στη δραστηριότητα υδρόλυσης ATP. Τα ιόντα Ca 2 κινούνται στις μεμβράνες των χλωροπλαστών ως απόκριση όχι μόνο στη μετάβαση φωτός-σκότους (Johnson et al., 1995· Sai and Johnson, 2002) αλλά και σε αβιοτικές τάσεις (Sello et al., 2018). Σκεφτήκαμε ότι η λειτουργία του AtVIPP1 in vivo μπορεί να ελέγχεται από το Ca 2 , του οποίου η ροή είναι ένας πιθανός υποψήφιος που παρακολουθεί τη φυσιολογική κατάσταση των μεμβρανών χλωροπλάστη σε συνθήκες πίεσης (Zhang et al., 2012, 2016a; Sello et al., 2018) . Από την άλλη πλευρά, τα διαλυτά διαμερίσματα του χλωροπλάστου υφίστανται αλλαγές pH κατά τη διάρκεια της φωτοσύνθεσης όπως περιγράφεται παραπάνω. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, το αλκαλικό ρΗ φαίνεται να δίνει προτιμώμενες συνθήκες για το Ca 2 -εξαρτώμενη από τη δράση της ΑΤΡάσης, σε αντίθεση με την περίπτωση παρουσία Mg 2 . Σε ρΗ 6,5, η δραστικότητα ήταν μικρότερη από το 50% αυτής σε ρΗ 7,5, ενώ το ρΗ 8,5 παρείχε υψηλή δραστικότητα, η οποία ήταν σχεδόν διπλάσια από αυτή σε ρΗ 7,5 (Εικόνα 5Α, κάτω πλαίσιο). Υπολογίσαμε τις τιμές KM και Vmax για τις δύο συνθήκες pH, 7,5 και 8,5 (Εικόνα 5Β και Πίνακας 1). Σε pH 7,5, τα KM και Vmax ήταν 1,07 mM και 0,39 μM Pi απελευθέρωσης/μg πρωτεΐνης/λεπτό, αντίστοιχα. Σε σύγκριση με αυτές τις τιμές παρουσία Mg 2 , τόσο το KM όσο και το Vmax ήταν χαμηλά. Οι τιμές έδειξαν παρόμοια τάση σε pH 8,5 (KM: 0,22 mM, Vmax: 0,35 μM απελευθέρωση Pi/μg πρωτεΐνης/λεπτό), υποδηλώνοντας προφανώς υψηλή συγγένεια για το ATP. Το χαμηλό Vmax μπορεί να οφείλεται στην υψηλή συγγένεια που προκαλεί αναστολή του υποστρώματος.
Σχήμα 5. Ιδιότητες της υδρόλυσης ΑΤΡ που εξαρτάται από το Ca2 . (Α) Μια φωτογραφία τυπικών αποτελεσμάτων μιας δοκιμασίας με βάση το πράσινο μαλαχίτη (άνω πλαίσιο) και την ποσοτικοποιημένη δραστηριότητα της υδρόλυσης ATP (κάτω πλαίσιο) παρουσία Ca2 . Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε επίπεδα ρΗ (6,5, 7,5 και 8,5). Οι αστερίσκοι στο γράφημα ράβδων υποδηλώνουν σημαντικές διαφορές από τη δραστηριότητα σε pH 7,5 (Welch’s t-test με p lt;0,01). (Β) Αναλύσεις για Vmax και KM για δραστικότητα υδρόλυσης ATP παρουσία Ca 2 σε pH 7,5 και 8,5. Η δραστικότητα υδρόλυσης ΑΤΡ μετρήθηκε παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων ΑΤΡ, οι οποίες υποδεικνύονται στο κάτω μέρος των γραμμικών γραφημάτων. Κάθε ραβδωτό γράφημα και γραμμή σφάλματος αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο και το SD, αντίστοιχα, των αποτελεσμάτων από 5-9 ανεξάρτητα πειράματα (αριστερά γραφήματα). Η συγκέντρωση του ATP και ο μέσος όρος της απελευθέρωσης Pi που εξαρτάται από το VIPP1 απεικονίζονται στο γράφημα σύμφωνα με τη μέθοδο γραφικής παράστασης Cornish–Bowden. Οι τιμές X και Y του σημείου τομής αντιπροσωπεύουν KM και Vmax, αντίστοιχα (δεξιά γραφήματα).
Επιδράσεις της υποκατάστασης αμινοξέων στη δραστηριότητα υδρόλυσης ATP/GTP
Πρόσφατα, η λεπτομερής δομή των κυανοβακτηριακών ολιγομερών VIPP1 αποκάλυψε έναν νέο θύλακα δέσμευσης ATP/GTP, ο οποίος αποτελούνταν από τρία μονομερή του SynVIPP1. Μεταξύ των σημειακών μεταλλάξεων που εισήχθησαν σύμφωνα με τη δομή, τρεις από αυτές (R44K, E126Q και E179Q) μείωσαν τη δραστικότητα υδρόλυσης ATP/GTP και η διπλή μετάλλαξη (E126Q/E179Q) όχι μόνο κατήργησε τη δράση αλλά διέκοψε και τον σχηματισμό ολιγομερών της ( Gupta et al., 2021). Πολλαπλή ευθυγράμμιση με PspA από Escherichia coli και τρεις πρωτεΐνες VIPP1 από Synechocystis sp. Τα PCC6803, Chlamydomonas reinhardtii και Arabidopsis thaliana, έδειξαν ότι τα τρία αμινοξέα, R44, E126 και E179, ήταν όλα διατηρημένα (Εικόνα 6Α). Εισάγαμε αυτές τις πανομοιότυπες σημειακές μεταλλάξεις στο AtVIPP1 (Gupta et al., 2021). Σε αντίθεση με τις προσδοκίες μας, μόνο η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη R44K έδειξε μια ελαφρά μείωση στη δραστικότητα υδρόλυσης GTP. Τα E126Q και E179Q είχαν παρόμοια δράση με την πρωτεΐνη άγριου τύπου. Παραδόξως, η διπλή μεταλλαγμένη πρωτεΐνη E126Q/E179Q έδειξε μάλλον υψηλή δραστικότητα (Εικόνα 6Β). Με συνέπεια, η ανάλυση HPLC έδειξε ότι ανιχνεύθηκε μόνο μια κορυφή που αντιστοιχεί σε ADP ή GDP (Εικόνα 6C), στην οποία η συγκέντρωση του απελευθερωμένου Pi ήταν συγκρίσιμη με εκείνη του ADP και του GDP (Εικόνα 6D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υψηλή δραστικότητα υδρόλυσης ATP/GTP στο Σχήμα 6Β αποδόθηκε σε μια επιταχυνόμενη κατάλυση του ATP σε ADP/GTP σε GDP, αλλά όχι σε άλλες αντιδράσεις όπως η μετατροπή από διφωσφορικό νουκλεοτίδιο σε μονοφωσφορικό νουκλεοτίδιο. η διπλή μεταλλαγμένη πρωτεΐνη E126Q/E179Q έδειξε μάλλον υψηλή δραστικότητα (Εικόνα 6Β). Με συνέπεια, η ανάλυση HPLC έδειξε ότι ανιχνεύθηκε μόνο μια κορυφή που αντιστοιχεί σε ADP ή GDP (Εικόνα 6C), στην οποία η συγκέντρωση του απελευθερωμένου Pi ήταν συγκρίσιμη με εκείνη του ADP και του GDP (Εικόνα 6D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υψηλή δραστικότητα υδρόλυσης ATP/GTP στο Σχήμα 6Β αποδόθηκε σε μια επιταχυνόμενη κατάλυση του ATP σε ADP/GTP σε GDP, αλλά όχι σε άλλες αντιδράσεις όπως η μετατροπή από διφωσφορικό νουκλεοτίδιο σε μονοφωσφορικό νουκλεοτίδιο. η διπλή μεταλλαγμένη πρωτεΐνη E126Q/E179Q έδειξε μάλλον υψηλή δραστικότητα (Εικόνα 6Β). Με συνέπεια, η ανάλυση HPLC έδειξε ότι ανιχνεύθηκε μόνο μια κορυφή που αντιστοιχεί σε ADP ή GDP (Εικόνα 6C), στην οποία η συγκέντρωση του απελευθερωμένου Pi ήταν συγκρίσιμη με εκείνη του ADP και του GDP (Εικόνα 6D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υψηλή δραστικότητα υδρόλυσης ATP/GTP στο Σχήμα 6Β αποδόθηκε σε μια επιταχυνόμενη κατάλυση του ATP σε ADP/GTP σε GDP, αλλά όχι σε άλλες αντιδράσεις όπως η μετατροπή από διφωσφορικό νουκλεοτίδιο σε μονοφωσφορικό νουκλεοτίδιο.
Εικόνα 6. Μεταλλάξεις στον θύλακα δέσμευσης νουκλεοτιδίων που προβλέπονται από τη δομή του SynVIPP1. (Α) Πολλαπλή ευθυγράμμιση μερικής αλληλουχίας αμινοξέων (1–180) μεταξύ ενός PspA (Escherichia coli) και τριών VIPP1 (Synechocystis, Chlamydomonas και Arabidopsis). Τα αμινοξέα που συμβάλλουν στη δέσμευση ATP/GTP στο κυανοβακτηριακό VIPP1 φαίνονται με βέλη (R44, E126 και E179). (Β) Οι δραστηριότητες υδρόλυσης ATP και GTP πρωτεϊνών άγριου τύπου και τεσσάρων σημειακών μεταλλαγμένων αναλύθηκαν με βάση το Synechocystis VIPP1 προηγουμένως. Οι αστερίσκοι στα γραφήματα ράβδων υποδηλώνουν σημαντικές διαφορές στη δραστηριότητα από την άγριου τύπου πρωτεΐνη (Welch’s t-test με p lt; 0,01). (Γ) Αντιπροσωπευτικά προφίλ έκλουσης ADP και GDP που ελήφθησαν από τις αντιδράσεις της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης E126Q/E179Q.(Δ) Το επίπεδο των κύριων προϊόντων που λαμβάνονται σε αντιδράσεις υδρόλυσης 30 λεπτών. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των τιμών των γραφημάτων, οι οποίες εμφανίζονται ως «ns» σύμφωνα με μια στατιστική ανάλυση (Welch’s t-test, p lt;0,01). Γραμμές σφάλματος: ± SE.
Δοκιμάσαμε επίσης δύο είδη σημειακής μετάλλαξης στα H1, V10E και V11E, καθένα από τα οποία μείωσε τη δραστηριότητα υδρόλυσης ATP/GTP του SynVIPP1 (Gupta et al., 2021). Αυτά τα δύο υπολείμματα διατηρούνται όχι μόνο μεταξύ SynVIPP1 και AtVIPP1 αλλά και μεταξύ άλλων ειδών (Ohnishi et al., 2018) και εντοπίζονται στην υδρόφοβη επιφάνεια αυτής της χαρακτηριστικής αμφιπαθούς έλικας (Zhang and Sakamoto, 2015) (Συμπληρωματικές Εικόνες 5A,B) . Παρασκευάσαμε αυτές τις μεταλλαγμένες πρωτεΐνες και αναλύσαμε τη δραστικότητα υδρόλυσης νουκλεοτιδίων τους (Συμπληρωματικά Σχήματα 5C,D). Το V11E είχε μειωμένη δραστηριότητα, η οποία ήταν παρόμοια με την περίπτωση του SynVIPP1, ενώ η δραστηριότητα του V10E ήταν μάλλον υψηλότερη από εκείνη της πρωτεΐνης άγριου τύπου. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι, παρά τη διατήρηση μεταξύ SynVIPP1 και AtVIPP1,
Ολιγομερείς ιδιότητες άγριου τύπου και μεταλλαγμένων AtVIPP1
Για να αποκτήσουμε πληροφορίες σχετικά με τη σχέση μεταξύ της υδρόλυσης νουκλεοτιδίων και του σχηματισμού ολιγομερών, πραγματοποιήσαμε πρώτα φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας σακχαρόζης. Η πλειονότητα του άγριου τύπου AtVIPP1 ανιχνεύθηκε στο κλάσμα 20, με επιπλέον ασθενή σήματα στα κλάσματα 22 και 24 (Συμπληρωματικό Σχήμα 6). Η διπλή μετάλλαξη E126Q/E179Q μετανάστευσε επίσης στα ίδια κλάσματα με την πρωτεΐνη άγριου τύπου. Ωστόσο, τα σήματα στα κλάσματα 22-24 φάνηκαν να είναι ισχυρότερα από εκείνα για την άγριου τύπου πρωτεΐνη, υποδηλώνοντας ότι ένα ποσοστό του E126Q/E179Q θα μπορούσε να σχηματίσει πολύ μεγαλύτερα ολιγομερή από τα άγριου τύπου. Αντίθετα, το μετάλλαγμα V11E βρέθηκε κυρίως στα κλάσματα 2-4 (Συμπληρωματικό Σχήμα 6), υποδεικνύοντας ότι η πυκνότητά του ήταν πολύ χαμηλότερη από αυτή του άγριου τύπου. Αυτά τα αποτελέσματα έμοιαζαν με αυτά του ΔH1, αν και η δραστηριότητα υδρόλυσης νουκλεοτιδίων του V11E ήταν μάλλον παρόμοια με τη μετάλλαξη N16I, η οποία διατηρούσε ελαφρώς τροποποιημένα ολιγομερή υψηλής τάξης (Ohnishi et al., 2018). Το V11E ανιχνεύθηκε επίσης ασθενώς γύρω από τα κλάσματα 20-24, υποδεικνύοντας την παρουσία ενός δευτερεύοντος κλάσματος ολιγομερούς άγριου τύπου.
Τα ολιγομερή VIPP1 από το Synechocystis (Fuhrmann et al., 2009) και το Chlamydomonas (Gao et al., 2015· Theis et al., 2019) συχνά περιείχαν δομές που μοιάζουν με δακτυλίους και ράβδους. Ωστόσο, η κύρια δομή του AtVIPP1 φαινόταν να είναι σφαιρικά σωματίδια χωρίς κεντρική οπή, όταν παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας αρνητική χρώση και EM (Otters et al., 2013; Zhang et al., 2016a). Όπως αναμενόταν, το VIPP1 άγριου τύπου έδειξε ως επί το πλείστον μια σφαιρική δομή, με μικρές δομές που μοιάζουν με ράβδο (Εικόνα 7Α και Συμπληρωματικό Σχήμα 7). Η διάμετρος των σφαιρικών ολιγομερών κυμαινόταν από 30 έως 50 nm, με μερικά πολύ μικρότερα και μεγαλύτερα (βλ. παρακάτω). Αντίθετα, το ΔΗ1 ήταν σπάνια σφαιρικό και εμφάνιζε κυρίως ολιγομερή τύπου ράβδου (Εικόνα 7Α και Συμπληρωματικό Σχήμα 7). Αυτό ήταν κάπως εκπληκτικό, επειδή το ΔΗ1 αναφέρθηκε ότι σχηματίζει μικρά ολιγομερή με βάση το αποτέλεσμα της χρωματογραφίας αποκλεισμού μεγέθους (Otters et al., 2013). Το μετάλλαγμα V11E περιείχε τόσο σφαιρικές όσο και ράβδους (Εικόνα 7Α, Β) και εντοπίσαμε δύο τύπους σφαιρικών δομών, συγκεκριμένα σωματίδια (με λεία επιφάνεια) ή δακτυλίους (με τμήμα χαμηλής πυκνότητας που μοιάζει με τρύπα). περίπου το 60% αποτελούνταν από σωματίδια που έμοιαζαν με άγριου τύπου VIPP1, ενώ το υπόλοιπο είχε μια περιοχή χαμηλής πυκνότητας σαν τρύπα στο κέντρο (Εικόνα 7C, κίτρινα βέλη) και μπορεί να αντιπροσωπεύει τη δομή του δακτυλίου. Παρόμοια με το V11E, το N16I περιείχε επίσης σφαιρικές και ραβδοειδείς δομές. Το μέγεθος των σφαιρικών δομών στο N16I ήταν κοντά στο άγριο τύπο, αλλά το σχήμα τους συχνά παραμορφωνόταν (Εικόνα 7C). Επιπλέον, οι δομές που μοιάζουν με ράβδο φάνηκαν να είναι διαφορετικές από αυτές του άγριου τύπου ΔH1 και V11E (Συμπληρωματικό Σχήμα 7).
Σχήμα 7. Αναλύσεις με βάση ηλεκτρονιακές μικρογραφίες πρωτεϊνών AtVIPP1-His με αρνητική χρώση. (Α) Τυπικές ηλεκτρονιακές μικρογραφίες ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών άγριου τύπου ΔH1, V11E, N16I και E126Q/E179Q. Τα λευκά και κόκκινα βέλη υποδεικνύουν σφαιρικές και ραβδοειδείς δομές, αντίστοιχα. Οι κίτρινες αιχμές βελών στις φωτογραφίες των N16I και E126Q/E179Q δείχνουν σφαιρικές δομές που είναι χαρακτηριστικές σε κάθε είδος. Οι ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 200 nm. (Β) Η αναλογία σφαιρών προς ράβδους σε κάθε παρασκεύασμα πρωτεΐνης εκτιμήθηκε χονδρικά σύμφωνα με τη μέθοδο των Gupta et al. (2021). Οι λεπτομέρειες φαίνονται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 8Α. (ΝΤΟ)Παραδείγματα σφαιρικών δομών που παρατηρήθηκαν σε παρασκευάσματα πρωτεϊνών άγριου τύπου, V11E, N16I και E126Q/E179Q. Για τα τρία μεταλλαγμένα, οι επάνω φωτογραφίες δείχνουν δομές άγριου τύπου και οι δύο κάτω φωτογραφίες αντιπροσωπεύουν τις δομές που παρατηρούνται ειδικά σε κάθε μετάλλαγμα. Τα κίτρινα βέλη υποδεικνύουν σκιές σαν τρύπες που βρίσκονται στο κέντρο των σωματιδίων V11E. Οι ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 100 nm. (Δ) Κατανομή του μεγέθους των σφαιρικών δομών σε παρασκευάσματα πρωτεϊνών άγριου τύπου, V11E, N16I και E126Q/E179Q. Οι διάμετροι 100–280 σφαιρικών δομών μετρήθηκαν χειροκίνητα, όπως φαίνεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 8Β, και απεικονίστηκαν σε γραφήματα πλαισίου. Η κατανομή κάθε είδους πρωτεΐνης διέφερε μεταξύ τους με τιμές p lt;0,001, η οποία υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη στατιστική δοκιμή Brunner–Munzel.
Οι ράβδοι δομές άγριου τύπου, ΔH1 και V11E φάνηκαν να έχουν καλά οργανωμένο σχήμα με μήκος και πλάτος που κυμαίνονταν από 120 έως 300 nm και από 28 έως 34 nm, αντίστοιχα. Το πλάτος ήταν σχεδόν ομοιόμορφο από τη μια άκρη στην άλλη πλευρά κάθε κατασκευής. Επιπλέον, κάθε δομή των ΔH1 και V11E φάνηκε να διαθέτει ένα τμήμα χαμηλής πυκνότητας στο κέντρο κατά μήκος του μακρού άξονα (Συμπληρωματικό Σχήμα 7). Σε αντίθεση με την οργανωμένη δομή αυτών των ειδών, το σχήμα των ραβδοειδών δομών του N16I φαινόταν αποδιοργανωμένο και ανώμαλο. Αν και μερικά από αυτά είχαν μήκος 100–300 nm, παρατηρήθηκαν επίσης περιστασιακά τεράστιες δομές (Εικόνα 7Α, κόκκινα βέλη). Επιπλέον, το πλάτος ήταν μεταβλητό ακόμη και μέσα σε μια ενιαία δομή (Συμπληρωματικό Σχήμα 7). Το διπλό μετάλλαγμα E126Q/E179Q περιείχε ως επί το πλείστον σφαιρικές δομές και σπάνια εμφάνιζε σχήματα που έμοιαζαν με ράβδο.
Υπολογίσαμε την αναλογία μεταξύ σφαιρικών και ραβδόμορφων δομών σε άγριου τύπου και κάθε μεταλλαγμένης πρωτεΐνης σύμφωνα με τους Gupta et al. (2021) (Συμπληρωματικό Σχήμα 8Α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7Β, περίπου το 80% της πρωτεΐνης άγριου τύπου είχε σφαιρική δομή, ενώ το ΔΗ1 ήταν κυρίως ράβδος (~90%). Το V11E είχε υψηλότερη αναλογία ραβδόμορφων δομών σε σύγκριση με την πρωτεΐνη άγριου τύπου. Αντίθετα, το N16I εμφάνισε τόσο σφαιρικές όσο και ραβδοειδείς δομές σε ίσα ποσοστά (~50%) και το E126Q/E179Q περιείχε gt;90% σφαιρικές δομές.
Στη συνέχεια αναλύσαμε το μέγεθος των σφαιρικών δομών. Μετρήσαμε χειροκίνητα το μέγεθος gt;100 σφαιρικών σωματιδίων (Συμπληρωματικό Σχήμα 8Β) σε κάθε παρασκεύασμα πρωτεΐνης και αναλύσαμε την κατανομή τους. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7Δ, η πρωτεΐνη άγριου τύπου περιείχε δομές που κυμαίνονταν από 30 έως 50 nm ως την πλειοψηφία. Το V11E φάνηκε να έχει μικρότερα σωματίδια από το άγριου τύπου. Παρόμοια τάση έδειξα και το N16I. Από την άλλη πλευρά, το E126Q/E179Q παρουσίασε ένα ευρύ φάσμα μεγεθών και έτεινε να περιέχει περισσότερα σφαιρικά που ήταν μεγαλύτερα από το άγριου τύπου. Συνολικά, η δραστηριότητα υδρόλυσης ATP/GTP φάνηκε να συσχετίζεται τόσο με το μέγεθος όσο και με την κατάληψη της σφαιρικής δομής.
Συζήτηση
Στην παρούσα μελέτη, επεκτείναμε την προηγούμενη ανάλυση χρησιμοποιώντας το AtVIPP1-His και βρήκαμε ότι το AtVIPP1 δεν έχει μόνο GTP-αλλά και ATP-υδρολυτική δράση. Επιπλέον, αυτή η δραστηριότητα επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας τόσο τη δοκιμασία μαλαχίτη όσο και την ανάλυση HPLC, που ανίχνευσαν αντίστοιχα Pi και GDP/ADP. Η στοιχειομετρική παραγωγή του Pi και του GDP/ADP σε κάθε αντίδραση μας οδήγησε στο συμπέρασμα ότι η δραστηριότητα υδρόλυσης νουκλεοτιδίων του AtVIPP1 είναι μια αντίδραση που υδρολύει την τριφωσφορική πουρίνη σε διφωσφορική. Δεδομένου ότι το βακτηριακό PspA είχε παρόμοια δράση με το VIPP1 στην προηγούμενη μελέτη μας (Ohnishi et al., 2018), αυτή η δραστηριότητα υδρόλυσης νουκλεοτιδίων είναι πιθανό να είναι μια κοινή ιδιότητα των πρωτεϊνών της οικογένειας VIPP1/PspA.
Η πρωτεΐνη που προκαλεί κυστίδια στο πλαστίδιο 1 δεν έχει αυθεντικές περιοχές δέσμευσης νουκλεοτιδίων, επομένως τίθεται το ερώτημα πού εντοπίζεται η υδρολυτική δράση ATP/GTP στα ολιγομερή. Αν και περιορίζεται στο κυανοβακτηριακό VIPP1 (ονομάζεται επίσης IM30), οι πρόσφατες αναλύσεις σωματιδίων κρυο-ΕΜ δίνουν κάποιες υποδείξεις σχετικά με το συντονισμό της δέσμευσης νουκλεοτιδίων στο ολιγομερές VIPP1 (Gupta et al., 2021). Στη δομή του δακτυλίου που επιλύεται in vitro, το μονομερές VIPP1 σχηματίζει μια δομή φουρκέτας με Η2 και Η3, που συνδέονται με την αμφιπαθητική Ν-τελική έλικα Η1 κατακόρυφα και προς τα κάτω που συντονίζονται στο κέντρο. Στο C-άκρο, η έλικα H4/H5 ευθυγραμμίζεται με το H3 οριζόντια, συνδεδεμένη με το ελαστικό τέντωμα αμινοξέος. Το H6 είναι στριμμένο ελαφρώς προς τα πάνω στο ευθυγραμμισμένο H4/H5 και η γωνία του ποικίλλει λόγω της περιοχής κάμψης που συνδέει τα H3 και H4/H5. Το H7 δεν φιλοξενήθηκε στη δομή, πιθανόν λόγω της διαταραγμένης φύσης του. Το μονομερές υφαίνεται σε μια δομή δακτυλίου (C14-C18) η οποία περαιτέρω αλληλουφαίνεται και συναρμολογείται σε μια στρωματοποιημένη στοίβα, παρόμοια με ένα καλάθι φρούτων. Το Η1, ευθυγραμμισμένο στην πλευρά του αυλού, σχηματίζει έναν υδρόφοβο πυλώνα που δεσμεύει τα λιπίδια. Σε αυτή τη δομή, ένας νέος θύλακας δέσμευσης νουκλεοτιδίων που συντονίζεται από τρία μονομερή έχει ταυτοποιηθεί. Η μεταλλαξιογένεση των υπολειμμάτων αμινοξέων που περιβάλλουν αυτόν τον θύλακα, E126 και E179 σε γλουταμίνη (E126Q/E179Q), κατήργησε πλήρως τη δράση GTPase/ATPase (Gupta et al., 2021). Με βάση αυτό το εύρημα στο SynVIPP1, δημιουργήσαμε και αντίστοιχες μεταλλάξεις στο AtVIPP1. Ωστόσο, οι περισσότερες από τις μεταλλάξεις είχαν μικρή ή καθόλου επίδραση στη δραστικότητα υδρόλυσης νουκλεοτιδίων και κάπως απροσδόκητα το E126Q/E179Q είχε μια αυξητική επίδραση. Επομένως, αν και ο ακριβής λόγος θα πρέπει να διερευνηθεί στη μελλοντική εργασία, εξετάσαμε την πιθανότητα η δραστηριότητα GTPase/ATPase που περιγράφεται εδώ να μην αποδοθεί στον προτεινόμενο θύλακα κυανοβακτηρίων. Παρά την ομοιότητά τους στα αμινοξέα, η λεπτή δομή του ολιγομερούς AtVIPP1 μπορεί να είναι διαφορετική από αυτή του SynVIPP1, επειδή όχι μόνο οι μεταλλάξεις στον θύλακα δέσμευσης νουκλεοτιδίων αλλά και το V10E τα επηρέασαν διαφορετικά. Η ανάλυσή μας ΕΜ αρνητικής χρώσης έδειξε επίσης ότι το AtVIPP1 σχηματίζει ολιγομερείς διατάξεις διαφορετικές από το SynVIPP1 (βλ. παρακάτω). Δεδομένου ότι αρκετές μεταλλάξεις στο Η1 (V11E και N16I) είχαν αρνητική επίδραση στη δραστικότητα υδρόλυσης, είναι πιθανό το Η1 να παίζει ρόλο όχι μόνο στη δέσμευση των λιπιδίων αλλά και στη δραστηριότητα της ΝΤΡάσης. εξετάσαμε την πιθανότητα η δραστηριότητα GTPase/ATPase που περιγράφεται εδώ να μην αποδίδεται στον προτεινόμενο θύλακα κυανοβακτηρίων. Παρά την ομοιότητά τους στα αμινοξέα, η λεπτή δομή του ολιγομερούς AtVIPP1 μπορεί να είναι διαφορετική από αυτή του SynVIPP1, επειδή όχι μόνο οι μεταλλάξεις στον θύλακα δέσμευσης νουκλεοτιδίων αλλά και το V10E τα επηρέασαν διαφορετικά. Η ανάλυσή μας ΕΜ αρνητικής χρώσης έδειξε επίσης ότι το AtVIPP1 σχηματίζει ολιγομερείς διατάξεις διαφορετικές από το SynVIPP1 (βλ. παρακάτω). Δεδομένου ότι αρκετές μεταλλάξεις στο Η1 (V11E και N16I) είχαν αρνητική επίδραση στη δραστικότητα υδρόλυσης, είναι πιθανό το Η1 να παίζει ρόλο όχι μόνο στη δέσμευση των λιπιδίων αλλά και στη δραστηριότητα της ΝΤΡάσης. εξετάσαμε την πιθανότητα η δραστηριότητα GTPase/ATPase που περιγράφεται εδώ να μην αποδίδεται στον προτεινόμενο θύλακα κυανοβακτηρίων. Παρά την ομοιότητά τους στα αμινοξέα, η λεπτή δομή του ολιγομερούς AtVIPP1 μπορεί να είναι διαφορετική από αυτή του SynVIPP1, επειδή όχι μόνο οι μεταλλάξεις στον θύλακα δέσμευσης νουκλεοτιδίων αλλά και το V10E τα επηρέασαν διαφορετικά. Η ανάλυσή μας ΕΜ αρνητικής χρώσης έδειξε επίσης ότι το AtVIPP1 σχηματίζει ολιγομερείς διατάξεις διαφορετικές από το SynVIPP1 (βλ. παρακάτω). Δεδομένου ότι αρκετές μεταλλάξεις στο Η1 (V11E και N16I) είχαν αρνητική επίδραση στη δραστικότητα υδρόλυσης, είναι πιθανό το Η1 να παίζει ρόλο όχι μόνο στη δέσμευση των λιπιδίων αλλά και στη δραστηριότητα της ΝΤΡάσης. επειδή όχι μόνο οι μεταλλάξεις στον θύλακα δέσμευσης νουκλεοτιδίων αλλά και το V10E τις επηρέασαν διαφορετικά. Η ανάλυσή μας ΕΜ αρνητικής χρώσης έδειξε επίσης ότι το AtVIPP1 σχηματίζει ολιγομερείς διατάξεις διαφορετικές από το SynVIPP1 (βλ. παρακάτω). Δεδομένου ότι αρκετές μεταλλάξεις στο Η1 (V11E και N16I) είχαν αρνητική επίδραση στη δραστικότητα υδρόλυσης, είναι πιθανό το Η1 να παίζει ρόλο όχι μόνο στη δέσμευση των λιπιδίων αλλά και στη δραστηριότητα της ΝΤΡάσης. επειδή όχι μόνο οι μεταλλάξεις στον θύλακα δέσμευσης νουκλεοτιδίων αλλά και το V10E τις επηρέασαν διαφορετικά. Η ανάλυσή μας ΕΜ αρνητικής χρώσης έδειξε επίσης ότι το AtVIPP1 σχηματίζει ολιγομερείς διατάξεις διαφορετικές από το SynVIPP1 (βλ. παρακάτω). Δεδομένου ότι αρκετές μεταλλάξεις στο Η1 (V11E και N16I) είχαν αρνητική επίδραση στη δραστικότητα υδρόλυσης, είναι πιθανό το Η1 να παίζει ρόλο όχι μόνο στη δέσμευση των λιπιδίων αλλά και στη δραστηριότητα της ΝΤΡάσης.
Έχει αποδειχθεί ότι όλες οι πρωτεΐνες που σχετίζονται με το VIPP1 σχηματίζουν παρόμοια ολιγομερή. Τα κυανοβακτηριακά ολιγομερή VIPP1 εμφανίζουν μια δομή που μοιάζει με καλάθι που αποτελείται από στοιβαγμένους δακτυλίους, ενώ τα ολιγομερή του PspA και του ESCRT-III είναι σε μορφή που μοιάζει περισσότερο με σπειροειδή σωλήνα (Nguyen et al., 2020; Junglas et al., 2021). Οι σχετικές τομογραφικές αναλύσεις φωτός-EM έδειξαν μια δομή που μοιάζει με ράβδο του Chlamydomonas VIPP1 in vivo (Gupta et al., 2021), η οποία έμοιαζε με τη δομή που παρατηρήθηκε in vitro (Theis et al., 2019). Όσον αφορά το AtVIPP1, η λεπτή δομή δεν έχει επιλυθεί, αλλά τα μεγάλα ομο-ολιγομερή αποδείχθηκε ότι είναι μάλλον σωματιδιακά παρά δομές δακτυλίου in vitro, σύμφωνα με την αρνητική χρώση. Υποστηρίζοντας αυτό, η παρούσα μελέτη διαπίστωσε ότι τα περισσότερα από τα άγριου τύπου και μεταλλαγμένα AtVIPP1 αποδείχθηκε ότι σχηματίζουν ράβδους και σωματίδια, με τα σφαιρικά σωματίδια να κυριαρχούν στον άγριο τύπο (~80%). Είναι αξιοσημείωτο ότι μεταλλάξεις όπως το ΔH1 ανέστρεψαν αυτή την αναλογία, σχηματίζοντας κυρίως ράβδο στοίβαξης. Ομοίως, τα μεταλλαγμένα V11E και N16I, τα οποία μείωσαν τη δραστηριότητα της ΝΤΡάσης, έδειξαν την τάση να συσσωρεύουν περισσότερες ράβδους, αν και οι μορφολογίες τους φάνηκαν να διαφέρουν ελαφρώς, τόσο στο μήκος των ράβδων όσο και στο μέγεθος των σωματιδίων. Το μετάλλαγμα E126Q/E179Q σχημάτισε μεγαλύτερες δομές από το άγριου τύπου AtVIPP1, ενώ το V11E έδειξε μικρά σωματίδια ή δομές που μοιάζουν με ράβδο. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, οι σφαιρικές δομές μπορεί να περιλαμβάνουν εκείνες που προσδίδουν υψηλή δραστικότητα υδρόλυσης ATP/GTP. Συμπεράσαμε έντονα ότι οι ολιγομερείς ιδιότητες του VIPP1 διέφεραν σημαντικά μεταξύ των ειδών, επειδή το H1 είναι απαραίτητο για το SynVIPP1 (Thurotte and Schneider, 2019; Junglas et al., 2020), ενώ η αντίστοιχη Ν-τερματική περιοχή είναι ζωτικής σημασίας για τον ολιγομερισμό του AtVIPP1 (Otters et al., 2013; Ohnishi et al., 2018). In vivo, το AtVIPP1 συντηγμένο με το C-τερματικό GFP αποδείχθηκε ότι παρουσιάζει δυναμική συμπεριφορά σωματιδίων, γεγονός που υπογράμμισε τη χαρακτηριστική απόκριση του AtVIPP1 στην καταπόνηση στους χλωροπλάστες. Λεπτομερής ανάλυση των ολιγομερών VIPP1, π.χ., εκείνων που εμφανίζουν ομοιογενείς δομές τύπου δακτυλίου όπως το V11E, μπορεί να βοηθήσει στην αποκρυπτογράφηση της λεπτής δομής του AtVIPP1.
Τα παρόντα δεδομένα καταδεικνύουν ότι τόσο το ATP όσο και το GTP μπορούν να μετατραπούν σε δινουκλεοτίδια πουρίνης στο AtVIPP1, το οποίο μπορεί να συσχετίζεται με το ολιγομερές του συγκρότημα όπως αποδεικνύεται από το SynVIPP1. Επιπλέον, η προσεκτική παρατήρηση αυτών των δραστηριοτήτων, όσον αφορά την εξάρτηση από το pH και τα δισθενή κατιόντα ως συμπαράγοντα, έδειξε ότι οι δραστηριότητες υδρόλυσης ATP και GTP είναι βιοχημικά διακριτές. Ενώ η δραστικότητα υδρόλυσης ΑΤΡ βελτιστοποιήθηκε για αλκαλικές συνθήκες παρουσία Ca2 , η υδρόλυση GTP βελτιστοποιήθηκε σε ουδέτερο pH μόνο παρουσία Mg2 . Δεδομένου του θεωρητικού τους Vmax, ο ρυθμός υδρόλυσης GTP είναι 6-7 φορές υψηλότερος από την υδρόλυση ATP. Ωστόσο, η συγγένεια για το ATP παρουσία Ca 2 σε pH 8,5 ήταν 4-5 φορές υψηλότερο από αυτό για το GTP παρουσία Mg 2 σε pH 7,5. Επομένως, η υδρόλυση ATP με Ca 2 μπορεί να προχωρήσει ακόμη και παρουσία χαμηλών συγκεντρώσεων του υποστρώματος. Συνολικά, τόσο το AtVIPP1 όσο και το SynVIPP1 μοιράζονται τη δραστηριότητα υδρόλυσης ATP/GTP, αλλά οι ιδιότητές τους φαίνονται διαφορετικές. Για παράδειγμα, το SynVIPP1 έχει τον ρυθμό υδρόλυσης ATP που είναι σχεδόν ίδιος με αυτόν για την υδρόλυση GTP (Siebenaller et al., 2021), υποδηλώνοντας ότι οι αντιδράσεις υδρόλυσης GTP ή ATP θα μπορούσαν να επικαλύπτονται μεταξύ τους στα κύτταρα Synechocystis, εκτός εάν οι συγκεντρώσεις των υποστρωμάτων τους είναι ουσιαστικά διαφορετικοί μεταξύ τους. Από την άλλη πλευρά, το Vmax της δραστηριότητας υδρόλυσης ATP του AtVIPP1 είναι περίπου το μισό από αυτό για το GTP παρουσία Mg 2 σε ουδέτερο pH. Σύμφωνα με την ανάλυση του KM, η συγγένεια για το ATP ήταν επίσης χαμηλότερη από εκείνη για το GTP σε pH 7,5. Επομένως, η αντίδραση υδρόλυσης GTP θα πρέπει να είναι κυρίαρχη σε συνθήκες ουδέτερου pH, με την προϋπόθεση ότι οι συγκεντρώσεις των υποστρωμάτων είναι ίδιες ή κοντά μεταξύ τους. Επιπλέον, η διαθεσιμότητα δισθενών κατιόντων μπορεί να επηρεάσει τις δραστηριότητές τους. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, το κυανοβακτηριακό VIPP1 δεν απαιτεί δισθενή κατιόντα για τη δράση υδρόλυσης GTP (Junglas et al., 2020). Αντίθετα, η δραστηριότητα υδρόλυσης GTP του AtVIPP1 εξαρτιόταν σε μεγάλο βαθμό από το Mg 2 και τόσο από Mg 2 όσο και από Ca2 ιόντα χρησιμοποιήθηκαν ως συμπαράγοντες για την υδρόλυση ΑΤΡ του AtVIPP1. Η δραστηριότητα υδρόλυσης νουκλεοτιδίων του AtVIPP1 μπορεί να επηρεαστεί από το περιβάλλον του περισσότερο από το SynVIPP1, υποδηλώνοντας τη σωστή χρήση αυτών των δύο ειδών αντιδράσεων. Είναι πιθανό ότι το AtVIPP1 έχει καθιερώσει περίπλοκη υδρόλυση νουκλεοτιδίων που σχετίζεται με την ανάπτυξη πολύπλοκων μεμβρανικών δομών μέσω της εξέλιξης, αλλά απαιτείται περαιτέρω μελέτη για τη δομική επικύρωση.
Παραμένει ένα ερώτημα εάν η δραστικότητα υδρόλυσης νουκλεοτιδίων απαιτείται για τον σχηματισμό ολιγομερούς VIPP1. Μετά την κυανοβακτηριακή δομική ανάλυση, η παρατήρηση ότι η διαταραχή του θύλακα δέσμευσης νουκλεοτιδίων συσχετίζεται καλά με την απώλεια ολιγομερών δακτυλίων έδειξε ότι ο σχηματισμός δακτυλίου απαιτείται για την υδρόλυση νουκλεοτιδίων (Gupta et al., 2021). Ωστόσο, πρόσφατη εργασία από την ομάδα του Schneider ανέφερε ότι ο σχηματισμός ολιγομερών θα μπορούσε να συμβεί ακόμη και απουσία ATP και GTP (Siebenaller et al., 2021). Δεδομένου του μεγέθους της ρητίνης αμυλόζης που χρησιμοποιείται στο Liu et al. (2021) και την κεντρική οπή του δακτυλίου VIPP1, είναι πιθανό ότι το καλαθόμορφο ολιγομερές του Nostoc VIPP1 σχηματίστηκε κατά τη διαδικασία καθαρισμού χωρίς την παροχή ATP/GTP, αλλά όχι σε κύτταρα E. coli επειδή το VIPP1 είχε επισημανθεί με πρωτεΐνη που δεσμεύει τη μαλτόζη στο Ν-άκρο. Επομένως, Τα δύο είδη δραστικότητας υδρόλυσης νουκλεοτιδίων δεν είναι πιθανώς απαραίτητα για το σχηματισμό ολιγομερών, αλλά μπορεί να συμβάλλουν, όπως η αύξηση της αποτελεσματικότητας της διαδικασίας. Αναλύσεις in vitro με χρήση λιποσωμάτων έδειξαν ότι το σχήμα των λιποσωμάτων μπορεί να τροποποιηθεί ή τα λιποσώματα να αυξηθούν σε μέγεθος σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα με την προσθήκη SynVIPP1 ακόμη και απουσία τριφωσφορικού νουκλεοτιδίου (Saur et al., 2017; Junglas et al., 2020 Liu et al., 2021). Έτσι, οι αντιδράσεις υδρόλυσης νουκλεοτιδίων δεν είναι βασικές για τις διαδικασίες σύντηξης μεμβράνης κατ’ αρχήν. Ωστόσο, το GTP αύξησε τον αρχικό ρυθμό αντίδρασης σύντηξης μεμβράνης περίπου δύο φορές σε σύγκριση με τα πειράματα ελέγχου, ενώ η προσθήκη GDP έδειξε το αντίθετο αποτέλεσμα (Junglas et al., 2020). Επομένως, η αντίδραση υδρόλυσης GTP μπορεί να αυξήσει την αποτελεσματικότητα της σύντηξης μεμβράνης και/ή περαιτέρω διεργασιών. Αν και αυτές οι δραστηριότητες υδρόλυσης νουκλεοτιδίων δεν φαίνεται να είναι απαραίτητες για τον σχηματισμό ολιγομερών in vitro, μπορεί να είναι κρίσιμης σημασίας για μια άγνωστη λειτουργία in vivo, ειδικά σε φυσιολογικά αντίξοες συνθήκες.
Συμπερασματικά, παρέχουμε πειστικές αποδείξεις ότι το AtVIPP1 έχει υδρολυτικές δραστηριότητες τόσο ATP όσο και GTP, οι οποίες διακρίνονται αμοιβαία σε βιοχημικό επίπεδο. Η κατοχή αυτών των δραστηριοτήτων, αν και δεν έχει πλήρως επιλυθεί ως προς τη δομή και τη φυσιολογική λειτουργία, υπογραμμίζει το VIPP1 ως ένα νέο μόριο αναδιαμόρφωσης στην υπεροικογένεια πρωτεϊνών ESCRT-III/PspA/VIPP1.
Δήλωση διαθεσιμότητας δεδομένων
Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα που υποστηρίζουν τα συμπεράσματα αυτού του άρθρου θα διατεθούν από τους συγγραφείς, χωρίς αδικαιολόγητες επιφυλάξεις.
Συνεισφορές Συγγραφέων
Ο WS συνέλαβε τα αρχικά ερευνητικά σχέδια. ΝΟ, MS, HK, LZ και K-IS διεξήγαγαν πειράματα. Το ΝΟ πραγματοποίησε τα περισσότερα πειράματα για τον καθαρισμό VIPP1 και τη δραστηριότητα ΝΤΡάσης, με υποστήριξη από MS στην ανάλυση HPLC, HK σε ανάλυση αρνητικής χρώσης και ΕΜ και LZ σε δοκιμασία δέσμευσης νουκλεοτιδίων. Η WS επέβλεπε όλα τα πειράματα. Τα δεδομένα ΝΟ, MS και HK ανέλυσαν. Το NO και ο WS έγραψαν το χειρόγραφο για λογαριασμό όλων των συγγραφέων. Όλοι οι συγγραφείς συνέβαλαν στο άρθρο και ενέκριναν την υποβληθείσα έκδοση.
Χρηματοδότηση
Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από το KAKENHI Grants (21H02508 έως WS) από την Japan Society for the Promotion of Science, το Yakumo Foundation for Environmental Science (to NO), το National Natural Science Foundation of China (31660062 to LZ) και το Oohara Foundation ( στο WS).
Σύγκρουση συμφερόντων
Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη απουσία εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.
Σημείωση εκδότη
Όλοι οι ισχυρισμοί που εκφράζονται σε αυτό το άρθρο είναι αποκλειστικά εκείνοι των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραιτήτως αυτούς των συνδεδεμένων οργανισμών τους ή του εκδότη, των εκδοτών και των κριτικών. Οποιοδήποτε προϊόν μπορεί να αξιολογηθεί σε αυτό το άρθρο ή ισχυρισμός που μπορεί να προβληθεί από τον κατασκευαστή του, δεν είναι εγγυημένο ή εγκεκριμένο από τον εκδότη.
Ευχαριστίες
Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τους Tsuneaki Takami και Rie Hijiya για την τεχνική τους υποστήριξη.
Συμπληρωματικό υλικό
Το συμπληρωματικό υλικό για αυτό το άρθρο βρίσκεται στο διαδίκτυο στη διεύθυνση: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2022.949578/full#supplementary-material
ΑΤΡάση, Ασβέστιο, χλωροπλάστης, υπεροικογένεια ESCRT-III, GTPάση, Φωτοσύνθεση, Θυλακοειδής μεμβράνη