Δύο κινάσες υποδοχέων με μοτίβο λυσίνης, Gh-LYK1 και Gh-LYK2, συνεισφέρουν στην αντίσταση κατά της μαρασμού του Verticillium στο Upland Cotton

• ¹ State Key Laboratory of Rice Biology, Institute of Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou, Κίνα
• ² Βασικό εργαστήριο της επαρχίας Zhejiang για τον δευτερογενή μεταβολισμό και τη ρύθμιση των φυτών, College of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou, Κίνα
• ³ Επαρχιακό Βασικό Εργαστήριο Αγροβιολογίας, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing, Κίνα
• ⁴ State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, China Academy of Agricultural Sciences, Πεκίνο, Κίνα

Οι κινάσες υποδοχέα με μοτίβο λυσίνης (LYKs) παίζουν ουσιαστικούς ρόλους στην αναγνώριση της χιτίνης και στην ενεργοποίηση των αμυντικών αποκρίσεων έναντι παθογόνων μυκήτων στα μοντέλα φυτών Arabidopsis και ρύζι. Ωστόσο, η λειτουργία των LYKs σε μη πρότυπες εγκαταστάσεις παραμένει άγνωστη. Στην παρούσα εργασία, διαπιστώσαμε ότι η μεταγραφή δύο γονιδίων που κωδικοποιούν LYK από βαμβάκι, των Gh-LYK1 και Gh-LYK2, προκλήθηκε μετά από μόλυνση από Verticillium dahliae. Η επαγόμενη από τον ιό γονιδιακή σίγηση (VIGS) των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 σε φυτά βαμβακιού θέτει σε κίνδυνο την αντοχή στο V. dahliae. Ως υποτιθέμενοι υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων (PRRs), τόσο ο Gh-LYK1 όσο και ο Gh-LYK2 είναι εντοπισμένοι στη μεμβράνη και και οι τρεις περιοχές LysM των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 απαιτούνται για την ικανότητά τους να δεσμεύουν χιτίνη. Ωστόσο, δεδομένου ότι η Gh-LYK2, αλλά όχι η Gh-LYK1, είναι μια ψευδο-κινάση και, από την άλλη πλευρά, ο εξωτομέας (ED) του Gh-LYK2 μπορεί να προκαλέσει έκρηξη αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) στο φυτό, το Gh-LYK2 και το Gh-LYK1 μπορεί να συμβάλλουν διαφορετικά στην άμυνα του βαμβακιού. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν ότι τόσο το Gh-LYK1 όσο και το Gh-LYK12 απαιτούνται για την άμυνα έναντι του V. dahliae στο βαμβάκι, πιθανώς μέσω διαφορετικών μηχανισμών.

Εισαγωγή

Τα φυτά πυροδοτούν ανοσοαποκρίσεις κατά την αναγνώριση συντηρημένων συστατικών που προέρχονται από μικρόβια, γνωστά ως μοριακά μοτίβα που σχετίζονται με τα μικρόβια (MAMPs) ή μοριακά μοτίβα που σχετίζονται με παθογόνα (PAMPs), μέσω υποδοχέων αναγνώρισης προτύπων (PRRs) (Nürnberger and Brunner, 2002 και Robatek; , 2007· Boller and Felix, 2009· Macho και Zipfel, 2014). Τα MAMP είναι αμετάβλητες δομές που προέρχονται από συστατικά μικροβιακών κυττάρων που δεν είναι συστατικά ξενιστές. Αρκετά MAMP, συμπεριλαμβανομένου του βακτηριακού λιποπολυσακχαρίτη (LPS), της πεπτιδογλυκάνης (PGN) και της μυκητιακής χιτίνης, έχει αποδειχθεί ότι διαθέτουν ανοσογονικές δραστηριότητες σε ζώα και φυτά (Aslam et al., 2009; Newman et al., 2013), υποδηλώνοντας εξελικτική ομοιότητα συστήματα αναγνώρισης προτύπων μεταξύ αυτών των δύο βασιλείων.

Το μοτίβο λυσίνης (LysM) αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά σε εκκριτικές βακτηριακές υδρολάσες και είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στη βιογένεση, τροποποίηση και αποικοδόμηση του βακτηριακού κυτταρικού τοιχώματος (Beliveau et al., 1991). Περιλαμβάνοντας 42-48 αμινοξέα, το LysM είναι μια πανταχού παρούσα περιοχή που βρίσκεται σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς εκτός από την Αρχαία (Bateman and Bycroft, 2000; Zhang et al., 2007, 2009). Οι υποδοχείς που περιέχουν LysM έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκονται στην αναγνώριση γλυκανών που περιέχουν Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη (Buist et al., 2008). Σε μοντέλα φυτών όπως το Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) και το Oryza sativa (ρύζι), οι κινάσες των υποδοχέων LysM (LYKs) είναι, μαζί με την πλούσια σε λευκίνη επαναλαμβανόμενη κινάση που μοιάζει με υποδοχέα, τα καλύτερα μελετημένα PRR και είναι ζωτικής σημασίας για την έμφυτη ανοσία έναντι μυκήτων και βακτήρια (Miya et al., 2007; Wan et al., 2008, 2012; Fradin et al., 2009; Shimizu et al., 2010; Willmann et al., 2011; Shinya et al., 2012; Cao et al., 2014; Hayafune et al., 2014; Kouzai et al., 2014; Paparella et al., 2014). Η εκτοτομή (ED) των φυτικών LYK συνήθως περιέχει ένα πεπτίδιο σήματος (SP) και LysMs, ενώ η ενδοκυτταρική τους περιοχή (ID) είναι γνωστό ότι περιέχει μια ενεργή ή ανενεργή περιοχή κινάσης (Gust et al., 2012). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα LYK είναι απαραίτητα για την αναγνώριση των φυτών της χιτίνης ή των παραγόντων Nod, οδηγώντας στην ενεργοποίηση της έμφυτης ανοσίας των φυτών ή ευεργετικών συμβιώσεων (Liang et al., 2013, 2014). Στο ρύζι, η πρωτεΐνη CEBiP που δεσμεύει τον διεγέρτη ολιγοσακχαρίτη χιτίνης αποδείχθηκε αρχικά ότι απαιτείται για την ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης PRR χιτίνης (Kaku et al., 2006; Kaku and Shibuya, 2016). Στη συνέχεια, το OsCERK1 αποδείχθηκε ότι αλληλεπιδρά με το CEBiP για τη ρύθμιση των αμυντικών αποκρίσεων που προκαλούνται από τη χιτίνη (Shinya et al., 2010). Στο Arabidopsis, τα LYKs, συμπεριλαμβανομένων των CERK1, LYK4 και LYK5, δρουν ως PRR χιτίνης για τη ρύθμιση της οδού σηματοδότησης της χιτίνης (Miya et al., 2007; Wan et al., 2012; Cao et al., 2014), ενώ εμπλέκεται το LYK3 στην αρνητική ρύθμιση της ανοσίας (Liang et al., 2013; Paparella et al., 2014). Δύο πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι απαιτείται διμερισμός του CERK1 ή του CEBiP για την ενεργοποίηση της ανοσολογικής σηματοδότησης (Liu et al., 2012; Hayafune et al., 2014). Συγκεκριμένα, το ED του CERK1, το οποίο αποβάλλεται από τον υποδοχέα, εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου (Petutschnig et al., 2014). Παρόλο που οι λειτουργίες των LYKs στα μοντέλα φυτών αποκαλύπτονται σταδιακά, οι ρόλοι των LYKs στην άμυνα του βαμβακιού έναντι των παθογόνων παραμένουν άγνωστοι. Cao et al., 2014), ενώ το LYK3 εμπλέκεται στην αρνητική ρύθμιση της ανοσίας (Liang et al., 2013; Paparella et al., 2014). Δύο πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι απαιτείται διμερισμός του CERK1 ή του CEBiP για την ενεργοποίηση της ανοσολογικής σηματοδότησης (Liu et al., 2012; Hayafune et al., 2014). Συγκεκριμένα, το ED του CERK1, το οποίο αποβάλλεται από τον υποδοχέα, εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου (Petutschnig et al., 2014). Παρόλο που οι λειτουργίες των LYKs στα μοντέλα φυτών αποκαλύπτονται σταδιακά, οι ρόλοι των LYKs στην άμυνα του βαμβακιού έναντι των παθογόνων παραμένουν άγνωστοι. Cao et al., 2014), ενώ το LYK3 εμπλέκεται στην αρνητική ρύθμιση της ανοσίας (Liang et al., 2013; Paparella et al., 2014). Δύο πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι απαιτείται διμερισμός του CERK1 ή του CEBiP για την ενεργοποίηση της ανοσολογικής σηματοδότησης (Liu et al., 2012; Hayafune et al., 2014). Συγκεκριμένα, το ED του CERK1, το οποίο αποβάλλεται από τον υποδοχέα, εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου (Petutschnig et al., 2014). Παρόλο που οι λειτουργίες των LYKs στα μοντέλα φυτών αποκαλύπτονται σταδιακά, οι ρόλοι των LYKs στην άμυνα του βαμβακιού έναντι των παθογόνων παραμένουν άγνωστοι. που αποβάλλεται από τον υποδοχέα, εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου (Petutschnig et al., 2014). Παρόλο που οι λειτουργίες των LYKs στα μοντέλα φυτών αποκαλύπτονται σταδιακά, οι ρόλοι των LYKs στην άμυνα του βαμβακιού έναντι των παθογόνων παραμένουν άγνωστοι. που αποβάλλεται από τον υποδοχέα, εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου (Petutschnig et al., 2014). Παρόλο που οι λειτουργίες των LYKs στα μοντέλα φυτών αποκαλύπτονται σταδιακά, οι ρόλοι των LYKs στην άμυνα του βαμβακιού έναντι των παθογόνων παραμένουν άγνωστοι.

Το βαμβάκι (Gossypium spp.) είναι μια σημαντική καλλιέργεια που χρησιμοποιείται σε φυτικές ίνες, λάδια και προϊόντα βιοκαυσίμων. Τέσσερα σημαντικά γένη βαμβακιού καλλιεργούνται σε όλο τον κόσμο, συμπεριλαμβανομένων δύο αλλοτετραπλοειδών (Gossypium hirsutum και Gossypium barbadense) και δύο διπλοειδών (Gossypium herbaceum και Gossypium arboreum). Τα αλλοτετραπλοειδή βαμβάκια, ιδιαίτερα το G. hirsutum, καλλιεργούνται παγκοσμίως λόγω της καλής ποιότητας ινών και της υψηλής απόδοσης. Η βερτισίλλια, που προκαλείται κυρίως από τον μύκητα Verticillium dahliae που γεννιέται στο έδαφος (Fradin και Thomma, 2006), είναι μια από τις πιο καταστροφικές ασθένειες των φυτών παγκοσμίως και αποτελεί σημαντική απειλή για την απόδοση του βαμβακιού και την ποιότητα των ινών. Το V. dahliae από μολυσμένο βαμβάκι μπορεί να κατηγοριοποιηθεί σε δύο υποομάδες: αποφυλλωτικές και μη αποφυλλωτικές απομονώσεις (Daayf et al., 1995). Τα αποφυλλωτικά απομονωμένα στελέχη προκαλούν σοβαρό μαρασμό των φύλλων, αποβολή, και κυτταρικό θάνατο στα μολυσμένα φυτά, ενώ τα μη αποφυλλωτικά απομονωμένα στελέχη προκαλούν συμπτώματα μαρασμού των φύλλων με μικρή μόνο φυλλόπτωση κατά την εξέλιξη της νόσου (Daayf et al., 1995; Zhang et al., 2012, 2013). Τα προϊόντα απομόνωσης V. dahliae BP2 και V991 είναι μη αποφυλλωτικά και αποφυλλωτικά απομονώσεις, αντίστοιχα, που βρίσκονται στην Κίνα (Zhang et al., 2012).

Η ανάπτυξή μας ενός φορέα αποσιώπησης γονιδίων που προκαλείται από ιό (VIGS) με βάση τον ιό τσαλάκωσης των φύλλων βαμβακιού (CLCrV) έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα αποτελεσματικό εργαλείο σιγής γονιδίων που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για αντίστροφη γενετική και λειτουργικές αναλύσεις υποψήφιων γονιδίων στο βαμβάκι (Zhang et al., 2012· Gu et al., 2014· Liu et al., 2014, 2015· Chen et al., 2015· Fu et al., 2015· Zhang H. et al., 2016· Zhang W. et al. ., 2016). Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε μεθόδους VIGS που βασίζονται σε CLCrV για να μελετήσουμε τη λειτουργία δύο μελών της οικογένειας βαμβακερών LYK, Gh-LYK1 και Gh-LYK2, στην άμυνα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι και τα δύο γονίδια εμπλέκονται στην αντίληψη σηματοδότησης χιτίνης και παίζουν σημαντικό ρόλο στην αντίσταση στο V. dahliae. Επιπλέον, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η Gh-LYK2 εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου.

Υλικά και μέθοδοι

Φυτικά Υλικά, Απομονώσεις V. dahliae και Συνθήκες Καλλιέργειας

Οι ποικιλίες βαμβακιού (G. hirsutum) 3503 και ΖΝ905 καλλιεργήθηκαν σε θερμοκρασίες που κυμαίνονται από 20 έως 25°C, σε φωτοπερίοδο 16 ωρών: 8 ωρών, φωτός: σκούρου φωτός σε σχετική υγρασία 80%. Το αποφύλλωμα απομόνωσης V991 και το μη αποφυλλωτικό προϊόν απομόνωσης ΒΡ2 του V. dahliae διατηρήθηκαν σε άγαρ δεξτρόζης πατάτας (PDA) στους 25°C για 7 ημέρες, ακολουθούμενο από εμβολιασμό στο μέσο Czapek σε 1 λίτρο απεσταγμένου νερού (Zhang et al., 2012). Τα εναιωρήματα κονιδίων του V. dahliae ρυθμίστηκαν σε 1 × 10 ⁶ κονίδια ml ^-1 με απεσταγμένο νερό και χρησιμοποιήθηκαν για τον εμβολιασμό των φυτών.

Γονιδιακή Κλωνοποίηση

ORF πλήρους μήκους των Gh-LYK1, Gh-LYK2 και Gh-LYK5 ενισχύθηκαν από το cDNA της ποικιλίας G. hirsutum 3503 με τρία ζεύγη εκκινητών: LYK1 full F και LYK1 full R. LYK2 full F και LYK2 full R; και LYK5 full F και LYK5 full R, αντίστοιχα (Πίνακας S1). Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν μέσω ηλεκτροφόρησης γέλης και κλωνοποιήθηκαν στο pZeroback/blunt πλασμίδιο (Tiangen) για να παράγουν pLYK1, pLYK2 και pLYK5.

VIGS Vector Construction, Agroinfiltration, and V. dahliae Inoculation

Για να δημιουργηθεί ο φορέας VIGS για σίγαση του Gh-LYK1, ένα θραύσμα 325 bp του Gh-LYK1 ενισχύθηκε από το pLYK1 μέσω PCR με το ζεύγος εκκινητών LYK1 F SpeI και LYK1 R PacI (Πίνακας S1). Το προκύπτον προϊόν PCR εισήχθη σε pCLCrVA για να παραχθεί pCLCrV-LYK1. Ένα άλλο θραύσμα 333 bp ενισχύθηκε από το pLYK2 με το ζεύγος εκκινητών LYK2 F SpeI και LYK2 R AvrII (Πίνακας S1) και το θραύσμα εισήχθη στις θέσεις SpeI-AvrII του pCLCrVA για να παραχθεί pCLCrV-LYK2.

Για να δημιουργηθεί ένας φορέας διπλής σίγησης για Gh-LYK1 και Gh-LYK2, δύο εκκινητές (LYK2 σίγαση F PacI και LYK2 σίγαση R AscI) (Πίνακας S1) χρησιμοποιήθηκαν για ενίσχυση PCR από το πρότυπο pCLCrV-LYK2. Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν, υπέστησαν πέψη με PacI και AscI και εισήχθησαν στο pCLCrV-LYK1 για να παραχθεί pCLCrV-LYK1 2. Όλα τα πλασμίδια αλληλουχήθηκαν. οι χρησιμοποιούμενοι εκκινητές παρατίθενται στον Πίνακα S1.

Οι μετασχηματισμένες καλλιέργειες Agrobacterium αναπτύχθηκαν σε OD600 κατά προσέγγιση 1,0 και επωάστηκαν σε ρυθμιστικό επαγωγής [10 mM MgCl2, 100 mM MES (pH 5,7), 100 μM ακετοσυριγγόνη] για 3 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Συνδυασμοί των επαγόμενων καλλιεργειών διηθήθηκαν στην αξονική πλευρά των φύλλων των τεσσάρων φύλλων φυτών Nicotiana benthamiana ή στην αξονική πλευρά των κοτυληδόνων δενδρυλλίων βαμβακιού ηλικίας 2 εβδομάδων.

Μετά από αγροδιήθηση, τα φυτά βαμβακιού διατηρήθηκαν σε επωαστήρα στους 25°C με σχετική υγρασία 80%. Στα 15 dpi, όλα τα φυτά που υποβλήθηκαν σε αγωγή με VIGS αξιολογήθηκαν για αντιγραφή CLCrV μέσω PCR με τους ειδικούς εκκινητές CLCrV-F και CLCrV-R. Στη συνέχεια, περισσότερα από 15 θετικά φυτά ανά στόχο εμβολιάστηκαν με V. dahliae μέσω διαβροχής του εδάφους με 30 ml εναιωρήματος κονιδίων (1 × 10 ⁶ κονίδια ml ^-1) σε κάθε κατσαρόλα (250 ml). Η βλάβη του φυλλώματος αξιολογήθηκε αξιολογώντας τα συμπτώματα στις κοτυληδόνες και τα φύλλα των εμβολιασμένων φυτών σύμφωνα με τους ακόλουθους βαθμούς ασθένειας: 0 = υγιές φυτό. 1 = κιτρίνισμα ή νέκρωση 1–2 κοτυληδόνων. 2 = κιτρίνισμα ή νέκρωση 1 αληθινού φύλλου. 3 = περισσότερα από δύο μαραμένα ή νεκρωτικά φύλλα. και 4 = όλα τα φύλλα μαραμένα ή νεκρά φυτά. Ο δείκτης ασθένειας υπολογίστηκε σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: δείκτης ασθένειας = [∑βαθμοί ασθένειας × αριθμός μολυσμένων)/(σύνολο φυτών × 4)] × 100 (Zhang et al., 2012). Τα πειράματα VIGS και οι δοκιμές μόλυνσης από V. dahliae επαναλήφθηκαν τρεις φορές με περισσότερα από 15 φυτά να αναλύονται ανά αντίγραφο.

Θεραπεία PAMP

Οι ρίζες των δενδρυλλίων βαμβακιού ηλικίας 2 εβδομάδων βυθίστηκαν σε διαλύματα PAMP που περιείχαν 0,1% Tween-20 και 10 μg ml ^-1 PGN (Sigma), 10 μg ml ^-1 χιτίνη (Sigma), 10 μg ml ^-1 LPS (Sigma). ), ή 1 μM flg22 (Phytotech, ΗΠΑ) και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε κενό ενώ ανακινούνταν στις 90 rpm για 30 λεπτά.

Ποσοτική RT-PCR

Οι εκκινητές για ποσοτική RT-PCR σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Primer5. Η ειδικότητα των εκκινητών αξιολογήθηκε υποβάλλοντας τις αλληλουχίες εκκινητών σε αναζητήσεις BLAST έναντι της βάσης δεδομένων NCBI. Η ενίσχυση PCR πραγματοποιήθηκε σε θερμικό κυκλοποιητή qTOWER 2.0/2.2 σε πραγματικό χρόνο (Analytikjena, Γερμανία) με τελικό όγκο 25 μl που περιείχε 2,5 μl cDNA, 0,5 μl από κάθε εκκινητή (10 μΜ), 9 μl στείρου νερού και 12,5 μl (2 ×) κιτ SYBR Premix ExTaqTM II (TaKaRa). Οι συνθήκες για την ενίσχυση ήταν οι εξής: 5 λεπτά μετουσίωση στους 95°C ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95°C για 10 δευτερόλεπτα, 60°C για 20 δευτερόλεπτα και 72°C για 10 δευτερόλεπτα. Τα επίπεδα έκφρασης των επιλεγμένων γονιδίων κανονικοποιήθηκαν σε αυτά του UBQ14 και η σχετική γονιδιακή έκφραση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το 2 ^-ΔΔCTμέθοδος. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα (SE) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων στα οποία συμπεριλήφθηκαν τρία ανεξάρτητα φυτά ανά πείραμα. Οι αλληλουχίες εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα S1.

Στο Planta V. dahliae Ποσοτικοποίηση βιομάζας

Η ποσοτικοποίηση της βιομάζας V. dahliae πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Fradin et al., 2011). Ουσιαστικά, τέσσερα εμβολιασμένα φυτά V. dahliae ανά γονότυπο συλλέχθηκαν και συνενώθηκαν. Τα δείγματα αλέστηκαν σε λεπτή σκόνη σε υγρό άζωτο και το DNA εκχυλίστηκε από 100 mg σκόνης. Η βιομάζα του V. dahliae προσδιορίστηκε με PCR σε πραγματικό χρόνο. Για την αξιολόγηση της βιομάζας V. dahliae, χρησιμοποιήθηκε ο ειδικός για τον μύκητα εκκινητής ITS1-F και ο ειδικός για το V. dahliae αντίστροφος εκκινητής ST-Ve1-R (Fradin et al., 2011). Χρησιμοποιήθηκαν το ζεύγος εκκινητών AtRuBisCo-F3 και AtRuBisCo-R3, που στοχεύουν τη μεγάλη υπομονάδα του γονιδίου Rubisco (Fradin et al., 2011) στο Arabidopsis και το ζεύγος εκκινητών UBQ14F και UBQ14R, που στοχεύουν το γονίδιο UBQ14 στο βαμβάκι (S11T). για βαθμονόμηση δείγματος, αντίστοιχα.

Ανάλυση Υποκυτταρικού Εντοπισμού

Για να αξιολογηθεί ο υποκυτταρικός εντοπισμός των Gh-LYKs, τα πλήρους μήκους cDNA του Gh-LYK1/2 δημιουργήθηκαν μέσω PCR. Το γονίδιο που κωδικοποιεί At-PIP2A (AT3G53420), το οποίο χρησιμοποιείται ως δείκτης μεμβράνης πλάσματος (ΡΜ) (Cutler et al., 2000), ενισχύθηκε από ένα cDNA Arabidopsis και κλωνοποιήθηκε στον φορέα pCHF3-dsRED. Τα πλασμίδια εισήχθησαν μεμονωμένα στο στέλεχος ΕΗΑ105 του Agrobacterium tumefaciens. Για να ενισχυθεί η έκτοπη έκφραση, τα αγροβακτήρια που φιλοξενούν το TBSV P19 συνδιηθήθηκαν σε φύλλα καπνού. Ο συνεντοπισμός των σημασμένων με GFP πρωτεϊνών σύντηξης παραγώγων Gh-LYK και των σημασμένων με dsRED πρωτεϊνών σύντηξης At-PIP2A αναλύθηκε με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο ZEISS (LSM 780, Γερμανία) στις 72 ώρες μετά τη διήθηση.

Έκφραση και Καθαρισμός Πρωτεϊνών

Για να ενισχυθεί η διαλυτότητα των πρωτεϊνών που εκφράζονται σε Escherichia coli (Ε. coli), ένα πλασμίδιο pGTf2 (TAKARA) που κωδικοποιεί συνοδούς εισήχθη στο Ε. coli στέλεχος DE3 για να παραχθεί το στέλεχος DE3-Tf2. Όλες οι δοκιμασίες προκαρυωτικής έκφρασης που περιγράφονται παρακάτω πραγματοποιήθηκαν σε αυτό το στέλεχος.

Οι EDs των Gh-LYK1 και Gh-LYK12 (μείον πεπτίδιο σήμα) κλωνοποιήθηκαν σε pET30a για να σχηματίσουν πρωτεΐνες σύντηξης 6 χ His tag. Οι πρωτεΐνες σύντηξης καθαρίστηκαν με ρητίνη Ni-NTA (Novagen) και χρησιμοποιήθηκαν στον προσδιορισμό δέσμευσης χιτίνης. Για να δοκιμαστούν οι δραστηριότητες κινάσης των Gh-LYK1 και Gh-LYK2, οι εσωτερικές περιοχές της Gh-LYK1 (υπολείμματα 253–620) και της Gh-LYK2 (υπολείμματα 286–672) από την ποικιλία 3503 κλωνοποιήθηκαν σε pMBP28 για να σχηματίσουν τη Ν-τερματική μαλτόζη πρωτεΐνες σύντηξης ετικέτας πρωτεΐνης δέσμευσης (MBP), που ονομάζονται Gh-LYK1-ID και Gh-LYK2-ID, αντίστοιχα. Οι πρωτεΐνες σύντηξης στη συνέχεια καθαρίστηκαν πάνω από ρητίνη αμυλόζης (New England Biolabs) και χρησιμοποιήθηκαν στους προσδιορισμούς κινάσης.

Δοκιμασίες Δέσμευσης Χιτίνης

Η in vitro δοκιμασία δέσμευσης χιτίνης πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Petutschnig et al., 2010) με μικρές τροποποιήσεις. Κάθε καθαρισμένη πρωτεΐνη επωάστηκε με τα σφαιρίδια χιτίνης (New England Biolabs) στους 4°C σε μια κουνιστή πλατφόρμα για 3 ώρες. Τα μίγματα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στα 13.000 g. Τα κλάσματα σφαιριδίων ξεπλύθηκαν πέντε φορές με ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης CBD (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA 0,1% Tween-20, ρΗ 8,0 25°C). Τόσο το σφαιρίδιο όσο και το υπερκείμενο κλάσματα που συλλέχθηκαν μετά το τελευταίο ξέβγαλμα βράστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης SDS για 10 λεπτά και φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στα 13.000 g. Είκοσι χιλιοστόλιτρα υπερκείμενων κλασμάτων των διαλυμάτων χρησιμοποιήθηκαν για την εκτέλεση ανάλυσης 12% SDS-PAGE και ανοσοστύπωσης με αντίσωμα αντι-Ηϊδ (Tiangen, Πεκίνο, Κίνα).

Επιπροσθέτως, οι EDs των Gh-LYK1, Gh-LYK2 και των παραγώγων εκφράστηκαν παροδικά σε φύλλα N. benthamiana. Στις 72 ώρες μετά την αγροδιήθηση, συλλέχθηκαν τα διηθημένα φύλλα. Προστέθηκε ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης [50 mM HEPES-KOH (pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 0,5% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 × PI κοκτέιλ (Roche)] στα 2 ml ανά g φυτικού υλικού. Το δείγμα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε με 5.000 χ g στους 4°C για 15 λεπτά και το υπερκείμενο μίγμα επωάστηκε με σφαιρίδια χιτίνης στους 4°C για 3 ώρες. Τα επωασμένα σφαιρίδια ξεπλύθηκαν πέντε φορές με το ρυθμιστικό ομογενοποίησης. Τα τελικά ξεπλυμένα σφαιρίδια στη συνέχεια βράστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης SDS για 10 λεπτά και φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στα 13.000 g. Τα υπερκείμενα κλάσματα των διαλυμάτων χρησιμοποιήθηκαν για τη διεξαγωγή αναλύσεων SDS-PAGE και ανοσοστύπωσης με ένα αντίσωμα κατά του Flag (Sigma).

Δοκιμασίες Κινάσης

Για τις δοκιμές κινάσης, η καθαρισμένη πρωτεΐνη Gh-LYK1-ID ή Gh-LYK2-ID επωάστηκε ξεχωριστά με γ- ^32Ρ ΑΤΡ στους 30°C για 30 λεπτά, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Liu et al., 2011). Το φωσφορυλιωμένο υπόστρωμα οπτικοποιήθηκε με συσκευή απεικόνισης Typhoon 9200 (GE Healthcare) μετά από διαχωρισμό μέσω SDS-PAGE.

DUAL Membrane Yeast Two-Hybrid System

Για την ανίχνευση αλληλεπιδράσεων μεταξύ Gh-LYK1 και Gh-LYK2 σε ζυμομύκητες, τα ORF πλήρους μήκους των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 ενισχύθηκαν από τα pLYK1 και pLYK2 και κλωνοποιήθηκαν σε pBT3-C και pPR3-C, αντίστοιχα. Στη συνέχεια διεξήχθησαν DUAL αναλύσεις ζύμης μεμβράνης δύο υβριδίων σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Dualsystems Biotech, Ελβετία).

Κτίριο Πρότυπο Ομολογίας

Πραγματοποιήθηκε μοντελοποίηση ομολογίας για τη δημιουργία της τρισδιάστατης δομής του Gh-LYK1. Η κρυσταλλική δομή του ΕΔ μιας κινάσης τύπου υποδοχέα από την Arabidopsis, η οποία μοιράζεται 51% ταυτότητα αλληλουχίας με την Gh-LYK1, σε σύμπλοκο με ένα πενταμερές χιτίνης (PDB ID: 4EBZ) χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο. Τα μοντέλα ομολογίας Gh-LYK1 δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας Modeller 9.16 (Martí-Renom et al., 2000; Webb and Sali, 2016).

Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) και ανίχνευση κυτταρικού θανάτου στο Planta

Η συσσώρευση H2O2 ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας 3,3′-Διαμινοβενζιδίνη όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με μικρές τροποποιήσεις (Qian et al., 2015). Εν συντομία, τα φύλλα αποκόπηκαν στη βάση του μίσχου και τροφοδοτήθηκαν με διάλυμα 1 mg/ml (pH 3–3,8) DAB (Sigma-Aldrich) για 8 ώρες στους 25°C. Στη συνέχεια, τα φύλλα βυθίστηκαν σε βραστό αιθανόλη 96% για 5–10 λεπτά, ψύχθηκαν και διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου σε αιθανόλη 70% και φωτογραφήθηκαν.

Η δοκιμασία χρώσης μπλε του τρυπανίου πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με μικρές τροποποιήσεις (Heese et al., 2007). Εν συντομία, τα φύλλα βυθίστηκαν σε διάλυμα χρώσης μπλε τρυπάνης (6 vol αιθανόλης, 1 vol απεσταγμένου νερού, 1 vol γαλακτικού οξέος, 1 vol γλυκερόλης, 1 vol φαινόλης και 0,067% w/v μπλε τρυπάνης) για 45 λεπτά χωρίς βράσιμο. Μετά τη χρώση, τα φύλλα που βυθίστηκαν σε αιθανόλη ανακινήθηκαν όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία δωματίου μέχρις ότου ο ιστός έγινε εντελώς άχρωμος.

Δοκιμασία Συμπλήρωσης Bimolecular Fluorescence (BiFC).

Για να ανιχνευθεί ο διμερισμός του Gh-LYK1/2 στα φύλλα καπνού, τα πλήρους μήκους ORFs των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 κλωνοποιήθηκαν σε p2YN και p2YC, αντίστοιχα. Τα προκύπτοντα πλασμίδια εισήχθησαν μεμονωμένα στο στέλεχος ΕΗΑ105 του Α. tumefaciens με ηλεκτροδιάτρηση χρησιμοποιώντας συσκευή παλμικού γονιδίου (Bio-Rad, Hercules, CA) όπως περιγράφεται (Huang et al., 2009). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε η δοκιμασία συμπλήρωσης διμοριακού φθορισμού (BiFC) όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Yang et al., 2007). Για να ενισχυθεί η έκτοπη έκφραση, το Agrobacterium που φιλοξενεί τον καταστολέα της σιωπής γονιδίου P19 συνδιηθήθηκε σε φύλλα καπνού. Ανιχνεύθηκε εκπομπή φθορισμού YFP και τα κύτταρα απεικονίστηκαν υπό ομοεστιακό μικροσκόπιο (LSM 780, Γερμανία) 48 ώρες μετά τη διήθηση.

Αποτελέσματα

Οι Gh-LYK1 και Gh-LYK2 ρυθμίζονται προς τα πάνω κατά τη διάρκεια της λοίμωξης V. dahliae και της θεραπείας με χιτίνη

Υπάρχουν πέντε μέλη της οικογένειας των γονιδίων LYK που κωδικοποιούνται στο γονιδίωμα Arabidopsis (At-LYK1–At-LYK5) (Zhang et al., 2007, 2009). Για να αναγνωρίσουμε τα ομόλογα των Arabidopsis LYKs σε βαμβάκι (G. hirsutum), χρησιμοποιήσαμε τα πλήρους μήκους ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ORFs) του At-LYK1 έως το At-LYK5 ως ερωτήματα στις αναζητήσεις BLAST έναντι της βάσης δεδομένων Gossypium unigene (https:// phytozome.jgi.doe.gov) και ανακτήθηκαν οι υποψήφιοι με τις υψηλότερες βαθμολογίες BLAST. Προσδιορίσαμε δύο ομόλογα LYK1 (D_cotton_018813, D_cotton_000932), ένα ομόλογο LYK2 (D_cotton_035752), ένα ομόλογο LYK3 (D_cotton_014206), δύο ομόλογα LYK4 (D_cotton_01_cotton_014206), δύο ομολόγους LYK4 (D_cotton_01_89600, D_cotton_017680) Παρακολουθήσαμε την έκφραση αυτών των επτά υποτιθέμενων γονιδίων Gh-LYK στις ρίζες του V. dahliae ανθεκτική ποικιλία 3503 κατά τη διάρκεια μολύνσεων με αποφυλλωτικά και μη αποφυλλωτικά στελέχη V. dahliae. Η έκφραση των D_cotton_018813, D_cotton_014206, D_cotton_017682, και D_cotton_017683 στις ρίζες ήταν πολύ χαμηλή για να ανιχνευθεί (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται), ενώ η έκφραση των D_cotton_000932, D_cotton_035752 και D_cotton_035752 και D_cotton_ Εικόνα S1). Έτσι, αυτά τα τρία υποτιθέμενα γονίδια (D_cotton_000932, D_cotton_035752 και D_cotton_019720) χαρακτηρίστηκαν ως Gh-LYK1, Gh-LYK2 και Gh-LYK5, αντίστοιχα, για περαιτέρω μελέτη. Καθώς τα φυτά βαμβακιού που είχαν σιγήσει με Gh-LYK5 παρουσίασαν παρόμοια βιομάζα V. dahliae σε σύγκριση με τα φυτά ελέγχου μετά την πρόκληση με V. dahliae (Εικόνα S2), εστιάσαμε στον λειτουργικό χαρακτηρισμό των Gh-LYK1 και Gh-LYK2. Η έκφραση των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 αυξήθηκε σημαντικά 2 ημέρες μετά τον εμβολιασμό με V. dahliae. 12 ημέρες μετά τον εμβολιασμό, τα σχετικά επίπεδα mRNA των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 αυξήθηκαν κατά τουλάχιστον 2 και 9 φορές, αντίστοιχα, ενώ δεν υπήρξαν σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα της μεταγραφής Gh-LYK1 ή Gh-LYK2 στο μη εμβολιασμένος έλεγχος (Εικόνες 1Α, Β). Για να ορίσουμε εάν η έκφραση των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 ανταποκρινόταν στα MAMP, αναλύσαμε τη μεταγραφή των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 σε ρίζες που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Flg22, LPS, PGN και χιτίνη. Όπως αναμενόταν, η έκφραση της Gh-LYK1 ή της Gh-LYK2 ρυθμίστηκε προς τα πάνω και με αγωγή με PGN και με χιτίνη (Εικόνα 1C και Εικόνα S3A). Είναι ενδιαφέρον ότι το LPS προκάλεσε επίσης την έκφραση της Gh-LYK2 (Εικόνα 1C). Αντίθετα, δεν είδαμε σημαντικές αλλαγές στη μεταγραφή των Gh-LYKs, WRKY53, και MPK3 σε ρίζες βαμβακιού μετά από θεραπεία 30 λεπτών με Flg22 (Εικόνα S3A) ή ακόμη και θεραπεία 24 ωρών (Εικόνα S3B). Οι αλλαγές έκφρασης των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 υποδηλώνουν ότι και οι δύο αυτές LYK μπορεί να εμπλέκονται στην ανοσία που προκαλείται από χιτίνη κατά τη διάρκεια της άμυνας έναντι του V. dahliae στο βαμβάκι.

Εικόνα 1 . Η έκφραση των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 επάγεται από πρόκληση με V. dahliae. (A,B) Η σχετική έκφραση των Gh-LYK1 (A) και Gh-LYK2 (B) στις ρίζες προσδιορίστηκε μέσω ποσοτικής PCR αντίστροφης μεταγραφής (qRT-PCR) στις 0, 1, 2, 4, 8, 12 ημέρες μετά το V. εμβολιασμός dahliae. Οι τιμές με το ίδιο πεζό γράμμα πάνω από τη γραμμή σφάλματος δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές σύμφωνα με τις δοκιμές πολλαπλών εύρους του Duncan (P lt;0,05). (Γ) Η σχετική έκφραση των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 σε ρίζες προσδιορίστηκε μέσω qRT-PCR σε βαμβάκι που έχει υποστεί επεξεργασία με διάφορα PAMP. Οι τιμές με το ίδιο πεζό γράμμα πάνω από τη γραμμή σφάλματος δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές σύμφωνα με τις δοκιμές πολλαπλών εύρους του Duncan (P lt;0,05).

Στη συνέχεια, κλωνοποιήσαμε τα πλήρους μήκους cDNA των Gh-LYK1 και GhLYK2 από την ποικιλία G. hirsutum 3503. Τα ORF των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 είναι 1.860 και 2.016 bp, αντίστοιχα (Αριθμοί πρόσβασης GenBank 382 KU3398). Και οι δύο αυτές πρωτεΐνες μοιράζονται παρόμοια δομή περιοχής με SP, εξωκυτταρικές περιοχές LysM, διαμεμβρανική περιοχή (TM) και ενδοκυτταρική περιοχή κινάσης Ser/Thr. Η φυλογενετική ανάλυση και η ευθυγράμμιση αλληλουχίας αμινοξέων (aa) αποκάλυψαν ότι η Gh-LYK1 μοιράζεται 61,4% ταυτότητα με την At-LYK1, ενώ η Gh-LYK2 μοιράζεται 41% ταυτότητα με την At-LYK2 (Εικόνα S4).

Η αποσιώπηση των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 θέτει σε κίνδυνο την αντίσταση στο V. dahliae στο βαμβάκι

Για να προσδιορίσουμε τους ρόλους του Gh-LYK1 και του Gh-LYK2 στην άμυνα, χρησιμοποιήσαμε το σύστημα VIGS που βασίζεται σε CLCrV για να αποσιωπήσουμε τη μεταγραφή του Gh-LYK1 ή του Gh-LYK2 στο βαμβάκι και δοκιμάσαμε τις αμυντικές αποκρίσεις των φυτών που είχαν σιγήσει στο V. dahliae μόλυνση. Δημιουργήσαμε τους φορείς pCLCrV-LYK1, pCLCrV-LYK2 και pCLCrV-LYK1 2, οι οποίοι μπορούν να αποσιωπήσουν τα Gh-LYK1, Gh-LYK2 ή και τα δύο, στο σύστημα VIGS, αντίστοιχα. Αγροβακτήρια που περιέχουν CLCrV, CLCrV-LYK1, CLCrV-LYK2 ή CLCrV-LYK1 2 διεισδύθηκαν στις κοτυληδόνες της ποικιλίας βαμβακιού 3503. Στις 15 ημέρες μετά τη διήθηση (dpi), τα σιγασμένα και μη σιγασμένα φυτά προκλήθηκαν με V. απομονώνει V991 ή BP2. Στις 30 ημέρες μετά τον ενοφθαλμισμό του V. dahliae, βαθμολογήσαμε τον δείκτη ασθένειας στα φυτά που είχαν αποσιωπηθεί με VIGS χρησιμοποιώντας ως μάρτυρες φυτά που είχαν διεισδυθεί με ψευδή και κενό φορέα. Γενικά, τα CLCrV-LYK1 2 σιγασμένα φυτά βαμβακιού ήταν πιο ευαίσθητα στη μόλυνση από τα υπόλοιπα (Εικόνες 2Α, Β). Σημειωτέον, το αποφυλλωτικό στέλεχος V991 είναι πιο μολυσματικό από το BP2 στις περισσότερες ποικιλίες βαμβακιού, αλλά όχι στην ποικιλία 3503. Μετά την πρόκληση με V991, ο μέσος δείκτης ασθένειας των CLCrV-LYK1-, CLCrV-LYK2- και CLCrV-LYK1 2-διηθήθηκε Τα φυτά ήταν 27, 31 και 46, αντίστοιχα, ενώ ο δείκτης των φυτών που είχαν διεισδυθεί με ψευδή και CLCrV ήταν 14 και 15, αντίστοιχα. Για τον ενοφθαλμισμό του απομονωμένου στελέχους BP2 που δεν αποφύλλωσε, ο μέσος δείκτης ασθένειας των φυτών που είχαν διεισδυθεί με CLCrV-LYK1-, CLCrv-LYK2- και CLCrV-LYK1 2 ήταν 31, 34 και 42, αντίστοιχα, ενώ ο δείκτης και στα δύο τα φυτά που είχαν διεισδυθεί με ψευδή και CLCrV ήταν 17 (Εικόνα 2C). Για την αξιολόγηση του πολλαπλασιασμού του παθογόνου σε φυτά βαμβακιού, η βιομάζα του V. dahliae μετρήθηκε με qPCR, και τα αποτελέσματα συσχετίστηκαν με τον δείκτη ασθένειας (Εικόνα 2Δ). Η σίγαση των συγκεκριμένων γονιδίων επιβεβαιώθηκε μέσω ανάλυσης qRT-PCR χρησιμοποιώντας RNA που απομονώθηκε από τις ρίζες (Εικόνα 2Ε). Επιπρόσθετα, παρακολουθήσαμε την έκφραση δύο γονιδίων που σχετίζονται με την άμυνα, του WRKY53 και του MPK3 (Murray et al., 2007; Meng et al., 2013), σε Gh-LYK1/2/1 2-σιαγμένο ή ψευδές βαμβάκι που έχει υποστεί επεξεργασία με MAMP φυτά. Η επαγώγιμη μεταγραφή τόσο του WRKY53 όσο και του MPK3 από χιτίνη ή PGN μειώθηκε σημαντικά στα σιγασμένα φυτά βαμβακιού σε σύγκριση με τους ελέγχους (Εικόνες 2F, G). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα Gh-LYK1 και Gh-LYK2 είναι σημαντικά για τη βασική αντίσταση στο βαμβάκι και ότι δρουν προσθετικά. παρακολουθήσαμε την έκφραση δύο σχετιζόμενων με την άμυνα γονιδίων, του WRKY53 και του MPK3 (Murray et al., 2007; Meng et al., 2013), σε φυτά βαμβακιού που είχαν υποστεί επεξεργασία με MAMP Gh-LYK1/2/1 2 ή ψευδεπίγραφα. Η επαγώγιμη μεταγραφή τόσο του WRKY53 όσο και του MPK3 από χιτίνη ή PGN μειώθηκε σημαντικά στα σιγασμένα φυτά βαμβακιού σε σύγκριση με τους ελέγχους (Εικόνες 2F, G). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα Gh-LYK1 και Gh-LYK2 είναι σημαντικά για τη βασική αντίσταση στο βαμβάκι και ότι δρουν προσθετικά. παρακολουθήσαμε την έκφραση δύο σχετιζόμενων με την άμυνα γονιδίων, του WRKY53 και του MPK3 (Murray et al., 2007; Meng et al., 2013), σε φυτά βαμβακιού που είχαν υποστεί επεξεργασία με MAMP Gh-LYK1/2/1 2 ή ψευδεπίγραφα. Η επαγώγιμη μεταγραφή τόσο του WRKY53 όσο και του MPK3 από χιτίνη ή PGN μειώθηκε σημαντικά στα σιγασμένα φυτά βαμβακιού σε σύγκριση με τους ελέγχους (Εικόνες 2F, G). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα Gh-LYK1 και Gh-LYK2 είναι σημαντικά για τη βασική αντίσταση στο βαμβάκι και ότι δρουν προσθετικά.

Εικόνα 2 . Η σίγαση των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 ενισχύει την ευαισθησία της ποικιλίας 3.503 στο V. dahliae. (A,B) Τυπικά συμπτώματα ολόκληρων φυτών που έχουν αποσιωπηθεί με Gh-LYK1 ή σιγασμένα με Gh-LYK2 (Α) και φύλλα (Β) στα οποία οι Gh-LYK1 και Gh-LYK2 αποσιωπήθηκαν ταυτόχρονα, μολυσμένα με δύο απομονώσεις V. dahliae 30 ημέρες μετά τον εμβολιασμό του V. dahliae. Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν φυτά που είχαν διεισδυθεί με ψευδή και άδειο φορέα. (ΝΤΟ)Δείκτης ασθενειών των φυτών που έχουν αποσιωπηθεί και των μη σιγασμένων φυτών που προκλήθηκαν με V. dahliae 30 ημέρες μετά τον εμβολιασμό με V. dahliae. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν SE των βιολογικών αντιγράφων. Οι τιμές με το ίδιο γράμμα δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές σύμφωνα με τις δοκιμές πολλαπλών εύρους του Duncan (P lt;0,05). (Δ) Η βιομάζα V. dahliae στα σιγασμένα και μη σιγασμένα φυτά που προκλήθηκαν με V. dahliae υπολογίστηκε σε 30 ημέρες μετά τον εμβολιασμό του V. dahliae. Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν SE των βιολογικών αντιγράφων. Οι τιμές με το ίδιο πεζό γράμμα πάνω από τη γραμμή σφάλματος δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές σύμφωνα με τις δοκιμές πολλαπλών εύρους του Duncan (P lt;0,05). (ΜΙ)Η σχετική έκφραση των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 στις ρίζες των σιγασμένων και μη σιγασμένων φυτών μετρήθηκε μέσω qRT-PCR. Οι τιμές με το ίδιο γράμμα δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές σύμφωνα με τις δοκιμές πολλαπλών εύρους του Duncan (P lt;0,05). (F,G) Η σχετική έκφραση των WRKY53 (F) και MPK3 (G) στα σιγασμένα και μη σιγασμένα φυτά μετρήθηκε μέσω qRT-PCR. Οι ρίζες από κενά σπορόφυτα που είχαν διεισδυθεί με φορέα ή σιγασμένα με VIGS επωάστηκαν με PAMPs ή στείρο νερό (mock) για 30 λεπτά και η επαγωγή των WRKY53 και MPK3 προσδιορίστηκε με qPCR. Οι τιμές με το ίδιο γράμμα δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές σύμφωνα με τις δοκιμές πολλαπλών εύρους του Duncan (P lt;0,05).

Υποκυτταρικός εντοπισμός Gh-LYK1 και Gh-LYK2

Για να διερευνήσουμε τον υποκυτταρικό εντοπισμό της Gh-LYK1/2, δημιουργήσαμε κατασκευές για να εκφράσουμε τις πλήρους μήκους αλληλουχίες της Gh-LYK1 ή της Gh-LYK2 συντηγμένες με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) στο C-άκρο τους και οδηγούνται από το CaMV 35S προαγωγέας, που ορίζεται ως Gh-LYK1-GFP και Gh-LYK2-GFP, και στη συνέχεια εκφράζεται παροδικά σε φύλλα N. benthamiana. Κάτω από το ομοεστιακό μικροσκόπιο, το πράσινο σήμα φθορισμού της Gh-LYK1-GFP ή της Gh-LYK2-GFP εντοπίστηκε στο PM (Εικόνα 3Α). Για να επιβεβαιωθεί αυτός ο εντοπισμός, ένα κατασκεύασμα σύντηξης AtPIP2A-dsRed, το οποίο έχει χρησιμοποιηθεί ως δείκτης PM (Pumplin and Harrison, 2009; Pumplin et al., 2012; Sun et al., 2013), συνεκφράστηκε με το Gh-LYK -GFP. Το Gh-LYK1/2-GFP συνεντοπίστηκε με το AtPIPA2-dsRed (Εικόνα 3Α), ενώ το GFP μόνο όχι (Εικόνα 3Β). Για να επιβεβαιώσετε περαιτέρω τον εντοπισμό PM τους, παρατηρήσαμε Gh-LYK1-GFP και Gh-LYK2-GFP σε πλασμολυμένα φύλλα N. benthamiana. Μετά από πλασμόλυση με 30% γλυκερίνη, οι Gh-LYK1-GFP και Gh-LYK2-GFP εμφανίστηκαν στο PM και στους Hechtian κλώνους (Εικόνα S5).

Εικόνα 3 . Ο υποκυτταρικός εντοπισμός των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 (A) Εικόνες συνεστιακής μικροσκοπίας κυττάρων φύλλων καπνού που διεισδύθηκαν με Agrobacterium που φιλοξενεί τις κατασκευές σύντηξης Gh-LYK1-GFP και Gh-LYK2-GFP. Ως δείκτης μεμβράνης χρησιμοποιήθηκαν φθορίζοντα σήματα από πρωτεΐνες σύντηξης AtPIP2A-dsRed. (Β) Φθορίζουσες εικόνες του GFP μόνο και των πρωτεϊνών σύντηξης AtPIP2A-dsRed κάτω από ομοεστιακό μικροσκόπιο. Τα λευκά βέλη δείχνουν τους πυρήνες.

Και τα τρία LysMs των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 απαιτούνται για την ικανότητά τους δέσμευσης χιτίνης

Επειδή το ED του Gh-LYK1 έχει 51% ομοιότητα αλληλουχίας με αυτό της κινάσης του υποδοχέα χιτίνης του Arabidopsis (AtCERK1-ED), πραγματοποιήσαμε μοντελοποίηση ομολογίας του Gh-LYK1-ED με βάση μια κρυσταλλική δομή του AtCERK1-ED σε σύμπλοκο με χιτίνη υπολείμματα (PDB ID: 3KTI). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, και οι τρεις περιοχές LysM του Gh-LYK1 συσσωρεύονται σφιχτά μεταξύ τους, με αποτέλεσμα μια σφαιρική δομή παρόμοια με αυτή του AtCERK1-ED. Προηγούμενες δημοσιεύσεις έχουν δείξει ότι και τα τρία LysMs απαιτούνται για την ικανότητα δέσμευσης χιτίνης των LYKs (Petutschnig et al., 2010; Cao et al., 2014). Ως εκ τούτου, η διαγραφή οποιουδήποτε τομέα LysM μπορεί να διαταράξει τη δομική ακεραιότητα, με αποτέλεσμα την απώλεια της ικανότητας δέσμευσης χιτίνης. Στη συνέχεια, προσδιορίσαμε τις δραστηριότητες δέσμευσης χιτίνης των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 χρησιμοποιώντας in vitro δοκιμές pull-down χιτίνης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι δύο καθαρισμένες ανασυνδυασμένες ΕΔ μπορούν να συνδεθούν απευθείας σε σφαιρίδια χιτίνης (Εικόνα 4Β). Για να επιβεβαιώσουμε περαιτέρω αυτό το αποτέλεσμα, εκφράσαμε παροδικά τα μεταλλάγματα πλήρους μήκους και LysM μονής διαγραφής Gh-LYKs-ED συγχωνευμένα σε μια C-τερματική διπλή ετικέτα Flag-HA σε φύλλα N. benthamiana και ελέγξαμε τη δραστηριότητα δέσμευσης χιτίνης όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Petutschnig et al., 2010). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των in vitro αναλύσεων, το πλήρους μήκους Gh-LYK1-ED και Gh-LYK2-ED θα μπορούσαν να δεσμεύσουν σφαιρίδια χιτίνης, ενώ η διαγραφή οποιουδήποτε από τους τομείς LysM κατάργησε την ικανότητά τους να δεσμεύουν χιτίνη (Εικόνες 4C,D) . φύλλα benthamiana και έλεγξε τη δραστηριότητα δέσμευσης χιτίνης όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Petutschnig et al., 2010). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των in vitro αναλύσεων, το πλήρους μήκους Gh-LYK1-ED και Gh-LYK2-ED θα μπορούσαν να δεσμεύσουν σφαιρίδια χιτίνης, ενώ η διαγραφή οποιουδήποτε από τους τομείς LysM κατάργησε την ικανότητά τους να δεσμεύουν χιτίνη (Εικόνες 4C,D) . φύλλα benthamiana και έλεγξε τη δραστηριότητα δέσμευσης χιτίνης όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Petutschnig et al., 2010). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των in vitro αναλύσεων, το πλήρους μήκους Gh-LYK1-ED και Gh-LYK2-ED θα μπορούσαν να δεσμεύσουν σφαιρίδια χιτίνης, ενώ η διαγραφή οποιουδήποτε από τους τομείς LysM κατάργησε την ικανότητά τους να δεσμεύουν χιτίνη (Εικόνες 4C,D) .

Εικόνα 4 . Μοντελοποιημένη δομή του Gh-LYK1 με δοκιμασία χιτίνης και δέσμευσης χιτίνης. (Α) Υπολογιστική μοντελοποίηση σφιχτής συσκευασίας των τριών τομέων LysM σε Gh-LYK1 με χιτίνη. Η χιτίνη εμφανίζεται σε πράσινα ραβδιά. (Β) Δοκιμασία σύνδεσης σφαιριδίων χιτίνης καθαρισμένης Gh-LYK1-ED και Gh-LYK2-ED. I: είσοδος, F: ροή μέσω, B: χάντρες. (Γ) Δοκιμασία δέσμευσης σφαιριδίων χιτίνης των μεταλλαγμάτων διαγραφής Gh-LYK1-ED και μονής περιοχής LysM που εκφράζονται σε φύλλα N. benthamiana. I: είσοδος, F: ροή μέσω, B: χάντρες. (D) Δοκιμασία δέσμευσης σφαιριδίων χιτίνης των μεταλλαγμάτων διαγραφής Gh-LYK2-ED και μονής περιοχής LysM που εκφράζονται σε φύλλα N. benthamiana. I: είσοδος, F: ροή μέσω, B: χάντρες. Το μαύρο πεντάγραμμα δείχνει το μονομερές.

Το Gh-LYK2 σχηματίζει διμερή ανεξάρτητα από χιτίνη σε Vivo

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ο ομοδιμερισμός του AtCERK1 και του Os-CEBiP είναι σημαντικός για την αντίληψη της χιτίνης (Liu et al., 2012; Hayafune et al., 2014). Απροσδόκητα, βρήκαμε ότι ένα μέρος της Gh-LYK2-ED σχημάτισε διμερή ή ολιγομερή στο N. benthamiana χωρίς επαγωγή από χιτίνη (Εικόνα 4D). Για να προσδιοριστεί εάν οι δισουλφιδικοί δεσμοί συμβάλλουν στον σχηματισμό του διμερούς, τα εκχυλίσματα ολικών πρωτεϊνών υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με επιπλέον 100 mM διθειοθρεϊτόλης (DTT) και στη συνέχεια αναλύθηκαν μέσω ανοσοστύπωσης. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα διμερή δεν διασπάστηκαν από το DTT (Εικόνα 5Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτό το διμερές δεν εξαρτάται από δεσμούς δισουλφιδικού δεσμού.

Εικόνα 5 . Το Gh-LYK2 σχηματίζει διμερές στα φύλλα N. benthamiana. (Α) Τα διμερή της Gh-LYK2-ED δεν διασπάστηκαν από το DTT. (Β) Τα διμερή της Gh-LYK2 δεν διασπάστηκαν από το DTT. Τα μαύρα βέλη υποδεικνύουν διμερές πλήρους μήκους. μαύρα πεντάλφα δείχνουν το μονομερές.

Στη συνέχεια δοκιμάσαμε εάν το πλήρους μήκους Gh-LYK2 θα μπορούσε επίσης να σχηματίσει διμερή απουσία χιτίνης. Η πλήρους μήκους αλληλουχία της Gh-LYK2 εκφράστηκε παροδικά σε Ν. benthamiana συντηγμένη με μια C-τερματική διπλή ετικέτα Flag-HA. Λήφθηκαν παρόμοια αποτελέσματα με εκείνα με Gh-LYK2-ED (Εικόνα 5Β). Για να ελέγξουμε τον διμερισμό του Gh-LYK2 in vivo, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία BiFC. Το σήμα της κίτρινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (YFP), που απουσίαζε στους ελέγχους, έδειξε σχηματισμό ομοδιμερούς Gh-LYK2 (Εικόνα S6A). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ο ομοδιμερισμός της Gh-LYK2 είναι ανεξάρτητος από χιτίνη και δεν περιλαμβάνει δισουλφιδικούς δεσμούς.

Gh-LYK2, αλλά όχι Gh-LYK1, Περιέχει έναν τομέα ψευδο-κινάσης

Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι το Lotus LjNFR5, το Medicago NFP και το Arabidopsis LYK4/5 περιέχουν όλα μια νεκρή περιοχή κινάσης (Madsen et al., 2003; Radutoiu et al., 2003; Arrighi et al., 2006; Wan et al., 201 ). Συγκρίναμε την αλληλουχία των περιοχών κινασών των Gh-LYKs με αυτή των τυπικών κινασών και βρήκαμε ότι πολλά υπολείμματα-κλειδιά είχαν αλλοιωθεί ή απουσίαζαν, ειδικά στους υποτομείς I, III και VII (Εικόνα S7) στο Gh-LYK2. Αυτές οι διαφορές υποδηλώνουν ότι η Gh-LYK2 είναι μια άτυπη κινάση. Αντίθετα, ο τομέας κινάσης Gh-LYK1 είναι πολύ παρόμοιος με αυτόν του At-LYK1 στην ευθυγράμμιση του υποτομέα του καθώς και στα βασικά καταλυτικά κατάλοιπα αμινοξέων (Εικόνα S7). Για να ελέγξουμε εάν οι Gh-LYK1-ID και Gh-LYK2-ID είναι ενεργές κινάσες, εκφράσαμε και καθαρίσαμε τις Gh-LYK1-ID και Gh-LYK2-ID από Ε. coli και πραγματοποιήσαμε in vitro προσδιορισμούς κινάσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, σε αντίθεση με το Gh-LYK1-ID, Το Gh-LYK2-ID δεν ήταν ικανό να καταλύει την αυτοφωσφορυλίωση (Εικόνα 6). Στη συνέχεια δοκιμάσαμε εάν το Gh-LYK2 μπορεί να αλληλεπιδράσει με το Gh-LYK1: καμία αλληλεπίδραση δεν μπορούσε να ανιχνευθεί είτε σε προσδιορισμούς BiFC είτε σε δύο υβριδικούς προσδιορισμούς ζυμομύκητα διπλής μεμβράνης (Εικόνες S6A,B, S8).

Εικόνα 6 . In vitro δραστηριότητες κινάσης των Gh-LYK1-ID και Gh-LYK2-ID. Η αυτο-φωσφορυλίωση μετρήθηκε με ενσωμάτωση γ- ^[32P] -ATP. Το επάνω πλαίσιο δείχνει αυτοραδιογράφο και το κάτω πλαίσιο δείχνει γέλη βαμμένο με CBB. CBB, coomassie brilliant blue.

Η υπερέκφραση του Gh-LYK2-ED προκαλεί έκρηξη αντιδραστικών ειδών οξυγόνου στο N. benthamiana

Μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι το ED και το TM του AtCERK1 σε ένα μετάλλαγμα A. thaliana (cerk1-4) θα μπορούσαν να απορυθμίσουν τον κυτταρικό θάνατο ανεξάρτητα από τη σηματοδότηση της χιτίνης (Petutschnig et al., 2014). Και το αντιδραστικό είδος οξυγόνου (ROS) είναι ένα σήμα στον θάνατο των φυτικών κυττάρων (Van Breusegem and Dat, 2006). Στη συνέχεια ρωτήσαμε εάν τα βαμβακερά LYK θα μπορούσαν να προκαλέσουν έκρηξη ROS. Όταν τα Gh-LYKs και οι κολοβωμένες μεταλλάξεις τους εκφράστηκαν παροδικά στο N. benthamiana, δεν μπορέσαμε να ανιχνεύσουμε τη συσσώρευση ROS όπως προσδιορίστηκε με χρώση DAB σε Gh-LYK2- (Εικόνα S9A), Gh-LYK2-ID- (Εικόνα 7Α), Gh-LYK1-ED- (Εικόνα S9B) και φύλλα με διήθηση κενού φορέα (EV), ενώ αυτή η συσσώρευση ήταν ανιχνεύσιμη σε φύλλα με διείσδυση Gh-LYK2-ED (Εικόνα 7Α). Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, και τα τρία LysMs είναι σημαντικά για την ικανότητα δέσμευσης χιτίνης Gh-LYK2. Για να καταλάβουμε εάν η διαδικασία έκρηξης ROS που προκαλείται από το Gh-LYK2-ED εξαρτάται από τη δράση δέσμευσής του στη χιτίνη, τρεις μεταλλάκτες του Gh-LYK2 που έχουν απαλειφθεί από έναν μοναδικό τομέα εκφράστηκαν παροδικά σε φύλλα καπνού. Τα αποτελέσματα χρώσης DAB δείχνουν ότι όλα τα μεταλλάγματα θα μπορούσαν να προκαλέσουν συσσώρευση ROS (Εικόνα 7Β), ενώ τα επιμολυσμένα φύλλα χωρίς επεξεργασία με DAB δεν έδειξαν σημαντική χρώση (Εικόνα S9C). Δοκιμάσαμε επίσης εάν η συσσώρευση ROS συσχετίστηκε με προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (PCD). Στις διεισδυμένες περιοχές, τα συμπτώματα εμποτισμού νερού εμφανίστηκαν 3 ημέρες μετά τη διήθηση όταν εκφράστηκαν μεταλλάξεις διαγραφής Gh-LYK2-ED ή LysM (Εικόνα 7C). Επιπλέον, ανομοιόμορφες μπλε κηλίδες στις διεισδυμένες περιοχές θα μπορούσαν να οραματιστούν κατά τη χρώση με μπλε τρυπανίου (Εικόνα 7D).

Εικόνα 7 . Η παροδική έκφραση της Gh-LYK2-ED μπορεί να προκαλέσει τη συσσώρευση ROS και τον κυτταρικό θάνατο του N. benthamiana. (Α) χρώση DAB της έκφρασης φύλλων N. benthamiana με Gh-LYK2-ED-GFP, Gh-LYK2-ID-GFP και EV. EV, κενό διάνυσμα. (Β) χρώση DAB της έκφρασης φύλλων N. benthamiana με Gh-LYK2-ED, μεμονωμένα μεταλλάγματα διαγραφής περιοχής LysM των Gh-LYK2-ED και EV. EV: κενό διάνυσμα. (Γ) Φαινότυπος της έκφρασης φύλλων N. benthamiana με Gh-LYK2-ED, μεμονωμένα μεταλλάγματα διαγραφής περιοχής LysM των Gh-LYK2-ED και EV. (Δ) Χρώση μπλε τρυπανίου του ίδιου φύλλου που παρουσιάζεται στο (Γ) .

Συζήτηση

Τα τελευταία χρόνια, η λειτουργία των υποδοχέων LysM στην έμφυτη ανοσία των φυτών έχει διερευνηθεί σε μοντέλα φυτών όπως το Arabidopsis και το ρύζι (Buist et al., 2008; Gust et al., 2012; Tanaka et al., 2013; Shinya et al. , 2015). Στο Arabidopsis, οι πρωτεΐνες που περιέχουν LysM, συμπεριλαμβανομένων των CERK1, LYK4 και LYK5, δρουν ως βασικά PRR χιτίνης που ρυθμίζουν το μονοπάτι σηματοδότησης της χιτίνης (Miya et al., 2007; Wan et al., 2012; Cao et al., 2014). Το AtLYK3 αναφέρεται ότι είναι υπεύθυνο για την αρνητική ρύθμιση της ανοσίας (Liang et al., 2013; Paparella et al., 2014). Ωστόσο, η λειτουργία του At-LYK2 στην άμυνα παραμένει ασαφής, καθώς ένα μεμονωμένο μετάλλαγμα atlyk2 ή ένα τριπλό μετάλλαγμα atlyk2/atlyk3/atlyk5 δεν εμφανίζει σημαντικές αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων δεικτών που σχετίζονται με την άμυνα σε απόκριση στη θεραπεία με χιτίνη (Wan et al. , 2008, 2012). Σε αυτη τη ΜΕΛΕΤΗ, Βρήκαμε ότι τόσο το Gh-LYK1 όσο και το Gh-LYK2 είναι σημαντικά για την αντοχή στο μαρασμό Verticillium στο βαμβάκι, επειδή η σίγαση αυτών των δύο γονιδίων έθετε σε κίνδυνο την αντοχή τόσο σε αποφύλλωση όσο και σε μη αποφύλλωση απομονώσεις V. dahliae. Επίσης, καταρρίψαμε ταυτόχρονα την έκφραση των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 με έναν φορέα CLCrV VIGS. Τα φυτά που είχαν υποστεί διπλή σίγαση ανέπτυξαν πολύ πιο σοβαρά συμπτώματα μαρασμού σε σύγκριση με τα φυτά με απλή σίγαση ή τα φυτά ελέγχου, υποδηλώνοντας ότι δύο μέλη της οικογένειας LYK, τα Gh-LYK1 και Gh-LYK2, δρουν αθροιστικά για να προάγουν την αντίσταση του μαρασμού Verticillium στο βαμβάκι. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι πρωτεΐνες LysM παίζουν ρόλο στην ανίχνευση της χιτίνης μυκητιακής προέλευσης ή του PGN βακτηριακής προέλευσης για τη μεσολάβηση της βασικής ανοσίας των φυτών (Willmann et al., 2011; Ao et al., 2014; Kouzai et al., 2014; Mesnage et al. ., 2014). Με βάση τις παρατηρήσεις μας, η έκφραση των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 αυξήθηκε κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας είτε με χιτίνη είτε με PGN, και δύο φυτικά κατάντη αμυντικά γονίδια, συγκεκριμένα τα WRKY53 και MPK3, ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε φυτά αποκοπής Gh-LYK1 ή Gh-LYK2 μετά την επεξεργασία PAMP. Είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι, όπως το CERK1, το Gh-LYK1 και το Gh-LYK2 θα μπορούσαν να παίξουν ρόλο τόσο στην αντίσταση στη μυκητιασική όσο και στη βακτηριακή μόλυνση.

Αν και ο μοριακός μηχανισμός αναγνώρισης χιτίνης από τους υποδοχείς LysM στο ρύζι και στο Arabidopsis έχει αποκαλυφθεί σταδιακά τα τελευταία χρόνια (ανασκόπηση στο Böhm et al., 2014; Zipfel, 2014; Shinya et al., 2015), η λειτουργία των πρωτεϊνών LYK σε μη-πρότυπο φυτών παραμένει σκοτεινό. Οι δοκιμές δέσμευσης χιτίνης μας έδειξαν ότι το ED των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 θα μπορούσε να δεσμεύσει απευθείας τη χιτίνη και ότι και τα τρία LysM απαιτούνται για τη δράση δέσμευσης χιτίνης τους. Η έλλειψη δραστικότητας κινάσης του Gh-LYK2 υποδηλώνει ότι μπορεί να αλληλεπιδράσει άμεσα με κάποιους άλλους παράγοντες, αντί για το Gh-LYK1, για να σχηματίσει ένα σύμπλεγμα υποδοχέα που εμπλέκεται στην αντίληψη της χιτίνης.

Ο ομοδιμερισμός πρωτεϊνών που περιέχουν LysM έχει περιγραφεί σε φυτικά PRRs όπως τα AtCERK1, At-LYK5 και Os-CEBiP, καθώς και στο μυκητιακό τελεστή Ecp6 (Liu et al., 2012· Sánchez-Vallet et al., 2013 Cao et al., 2014. Hayafune et al., 2014). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι ο σχηματισμός ομο-συμπλοκών σε πρωτεΐνες που περιέχουν LysM είναι σημαντικός για τη σηματοδότηση που προκαλείται από τη χιτίνη. Με βάση τις παρατηρήσεις μας, τόσο το ED της Gh-LYK2 όσο και η πρωτεΐνη πλήρους μήκους μπορούν να σχηματίσουν ομοδιμερή απουσία της χιτίνης (Εικόνες 5Α, Β και Εικόνα S6A). Και ο σχηματισμός ομοδιμερούς δεν εξαρτάται από δισουλφιδικούς δεσμούς, επειδή η επιπλέον επεξεργασία με DTT δεν θα εξαλείφει τις ζώνες ομοδιμερούς, όπως φαίνεται στον προσδιορισμό ανοσοστύπωσης (Εικόνες 5Α, Β). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ομοδιμερής μορφή της Gh-LYK2 θα μπορούσε να υπάρχει στο κύτταρο απουσία χιτίνης.

Πρόσφατη εργασία στο Arabidopsis απέδειξε ότι το ED και το TM του cerk1-4 ήταν επαρκή για την απορρύθμιση του κυτταρικού θανάτου (Petutschnig et al., 2014). Βρήκαμε ότι η έκτοπη έκφραση του ED του Gh-LYK2, αλλά όχι του Gh-LYK2-ID ή του Gh-LYK1-ED (Εικόνα S9B), μπορεί να προκαλέσει έκρηξη ROS και PCD (Εικόνα 7Α). Πιο ενδιαφέρον, η έκτοπη έκφραση των μεταλλαγμάτων διαγραφής LysM ήταν επαρκής για να προκαλέσει συσσώρευση ROS στο Ν. benthamiana (Εικόνα 7Β). Αυτό υποδηλώνει ότι η ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου που σχετίζεται με το LysM μπορεί να είναι ανεξάρτητη από τη χιτίνη, επειδή οποιαδήποτε μεμονωμένη μετάλλαξη διαγραφής LysM οδήγησε σε απώλεια της ικανότητας δέσμευσης χιτίνης του Gh-LYK2 (Εικόνα 4D). Κατά τη διάρκεια της κούρσας εξοπλισμών μεταξύ φυτών και παθογόνων, μυκητιακά και βακτηριακά παθογόνα έχουν εξελιχθεί ορισμένα μόρια τελεστών για να αλληλεπιδρούν με τους υποδοχείς του ξενιστή και να ανατρέπουν την ανοσία του ξενιστή (Rosebrock et al., 2007; Shan et al., 2008; Xiang et al., 2008; Dou and Zhou, 2012; Macho και Zipfel, 2015). Το καλύτερα χαρακτηρισμένο LYK στο Arabidopsis, το CERK1, έχει αναφερθεί ότι στοχεύεται από το AvrPtoB για υποβάθμιση (Gimenez-Ibanez et al., 2009). Στη μελέτη μας, το ED ή το μερικό ED (μεταλλάγματα διαγραφής LysM), αντί για τη μορφή πλήρους μήκους, του Gh-LYK2 θα μπορούσε να προκαλέσει έκρηξη ROS σε φυτά χωρίς πρόκληση παθογόνου (Εικόνες 7Α, Β) και την έκφραση του Gh- Η LYK2 ρυθμίστηκε προς τα πάνω κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από V. dahliae (Εικόνα 1Β). Ένα πιθανό σενάριο είναι ότι, κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από παθογόνο, η Gh-LYK2, ως σημαντικός υποδοχέας, στοχεύεται από κάποιο συγκεκριμένο τελεστή προς αποικοδόμηση. Ταυτόχρονα, η ακεραιότητα του Gh-LYK2 θα μπορούσε να παρακολουθηθεί στο εργοστάσιο, έτσι ώστε τα προϊόντα διάσπασης, π.χ., το ED, να μπορούν να λειτουργήσουν ως σήματα για την ενεργοποίηση του κατάντη PCD και τον περιορισμό της εξάπλωσης του παθογόνου. Προκειμένου να υποθέσουμε ποιο μέρος της Gh-LYK2-ED θα μπορούσε να προκαλέσει PCD, αναζητήσαμε τη βάση δεδομένων SMART (Letunic et al., 2015) και βρήκαμε έναν συγκεκριμένο τομέα, που ανήκει στην υπεροικογένεια πρωτεϊνών διασταυρούμενης σύνδεσης ακτίνης, που βρίσκεται μεταξύ του SP και LysM1. Ο λειτουργικός σχολιασμός υποδεικνύει ότι τα μέλη αυτής της υπεροικογένειας εμπλέκονται στην εξαρτώμενη από το ARP2/3 μονοπάτι πολυμερισμού ακτίνης, η οποία είναι σημαντική για το σχηματισμό αυτοφαγοσωμάτων (Goley and Welch, 2006; Höhfeld, 2016). Σε αυτό το μονοπάτι, τα διμερή της φιλαμίνης και η επακόλουθη ουμπικουϊτινίωση μεσολαβούν στην απομόνωση της μεμβράνης και την κινητικότητα των αυτοφαγοσωμάτων. Αυτή μπορεί να είναι μια πιθανή εξήγηση για το γιατί η Gh-LYK2-ED και τα παράγωγα δείχνουν διμερείς και λωρίδες κηλίδωσης σε στύπωμα western κατά την παροδική έκφραση στο φυτό (Εικόνα 4D).

Συμπερασματικά, δείχνουμε ότι δύο κινάσες που μοιάζουν με υποδοχείς LysM (Gh-LYK1 και Gh-LYK2) συμβάλλουν στην αντίσταση κατά του μαρασμού Verticillium στο βαμβάκι. Επιπλέον, το Gh-LYK2 μπορεί να διαδραματίσει ρόλο στη ρύθμιση της PCD, η οποία πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω.

Συνεισφορές Συγγραφέων

ZG, TL, BZ και XZ: σχεδίασε και σχεδίασε την έρευνα. ZG και TL: πραγματοποίησαν τα πειράματα. ZG, TL, BD, FL, QW, SQ, FY, TC, YY, JW, GW, BZ και XZ: ανέλυσαν τα δεδομένα. ZG, TL, BD, BZ και XZ: έγραψε το χειρόγραφο.

Χρηματοδότηση

Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το National Science and Technology Major Project for Transgenic Breeding (2014ZX08009-003-001 and 2014ZX0800501B), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (31371930, 31672096, 3160009-003-001B), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (31371930, 31672096, 3160009-003-001B) ), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Jiangsu (BK20140743) και το Science Foundation του Zhejiang Sci-Tech University (14042089-Y). Οι χρηματοδότες δεν είχαν κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, στη συλλογή και ανάλυση δεδομένων, στην απόφαση δημοσίευσης ή στην προετοιμασία του χειρογράφου.

Δήλωση Σύγκρουσης Συμφερόντων

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη απουσία εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.

Συμπληρωματικό υλικό

Το συμπληρωματικό υλικό για αυτό το άρθρο βρίσκεται στο διαδίκτυο στη διεύθυνση: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2017.02133/full#suplementary-material

Εικόνα S1 . Μεταγραφική ανάλυση του Gh-LYK5 σε φυτό βαμβακιού μετά από μόλυνση με V. dahliae. Η σχετική έκφραση της Gh-LYK5 στις ρίζες προσδιορίστηκε μέσω ποσοτικής PCR αντίστροφης μεταγραφής (qRT-PCR) στις 0, 1, 2, 4, 8, 12 ημέρες μετά τον εμβολιασμό του V. dahliae. Οι τιμές με το ίδιο πεζό γράμμα πάνω από τη γραμμή σφάλματος δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές σύμφωνα με τις δοκιμές πολλαπλών εύρους του Duncan (P lt;0,05).

Εικόνα S2 . Σχετική μυκητιασική βιομάζα σε φυτά βαμβακιού σιγασμένα με Gh-LYK5 μετά από πρόκληση V. dahliae. Η βιομάζα V. dahliae στα σιγασμένα και μη σιγασμένα φυτά που προκλήθηκαν με V. dahliae υπολογίστηκε σε 30 ημέρες μετά τον εμβολιασμό του V. dahliae. Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν SE των βιολογικών αντιγράφων. Οι τιμές με το ίδιο πεζό γράμμα πάνω από τη γραμμή σφάλματος δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές σύμφωνα με τις δοκιμές πολλαπλών εύρους του Duncan (P lt;0,05).

Εικόνα S3 . Μεταγραφική ανάλυση των Gh-LYKs, WRKY53 και MPK3 σε ρίζα βαμβακιού cv 3,503 μετά από θεραπεία PAMP. (Α) Οι σχετικές εκφράσεις των Gh-LYKs, WRKY53 και MPK3 μετά από επεξεργασία 30 λεπτών με flg22 ή χιτίνη. (Β) Οι σχετικές εκφράσεις των Gh-LYKs, WRKY53 και MPK3 μετά από 24 ώρες κατεργασμένης με flg22 ρίζα βαμβακιού.

Εικόνα 4 . Φυλογενετική ανάλυση των Gh-LYKs με ομολογίες της A. thaliana.

Εικόνα S5 . Ο υποκυτταρικός εντοπισμός των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 μετά από θεραπεία με πλασμόλυση. Εικόνες ομοεστιακής μικροσκοπίας κυττάρων φύλλων καπνού που διεισδύθηκαν με Agrobacterium που φιλοξενούν τα κατασκευάσματα σύντηξης Gh-LYK1-GFP (A) και Gh-LYK2-GFP (B) πριν από (πίνακας ελέγχου) ή μετά τη θεραπεία με πλασμόλυση.

Εικόνα S6 . Αναλύσεις BiFC των Gh-LYK1 και Gh-LYK2 σε φύλλα N. benthamiana. (Α) Ο φθορισμός YFP (κίτρινο) παρατηρήθηκε ως συνέπεια της αυτο-αλληλεπίδρασης του Gh-LYK2 με επισήμανση 2YN και 2YC, αλλά όχι στην αυτο-αλληλεπίδραση του Gh-LYK1 με επισήμανση 2YN και 2YC ή στην αλληλεπίδραση μεταξύ Gh-LYK1 και Gh -LYK2 με ετικέτα 2YN και 2YC. (Β) Η ανοσοστύπωση των συντηγμένων πρωτεϊνών Gh-LYK1 ανιχνεύθηκε με αντίσωμα αντι-ΗΑ επίτοπου σε προσδιορισμούς BiFC.

Εικόνα S7 . Ευθυγράμμιση της περιοχής κινάσης Gh-LYK1 και Gh-LYK2. Η στοίχιση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ClustalW με προεπιλεγμένες παραμέτρους. Τα κόκκινα βέλη έδειχναν ότι τα υπολείμματα αμινοξέων χάθηκαν ή άλλαξαν στις περιοχές υποκινάσης.

Εικόνα S8 . Η υβριδική ανάλυση ζυμομύκητα διαχωρισμού ουβικιτίνης Gh-LYK1 και Gh-LYK 2.

Εικόνα S9 . Η παροδική έκφραση του Gh-LYK2 (A) ή του Gh-LYK1-ED (B) δεν μπόρεσε να προκαλέσει τη συσσώρευση ROS στο φύλλο N. benthamiana και το διηθημένο φύλλο EV/GH-LYK2-ED και τα παράγωγα δεν παρουσίασαν σημαντικές διαφορές χωρίς χρώση DAB (Γ) .

Πίνακας S1 . Εκκινητές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη.

Βαμβάκι, Verticillium dahliae, Αντίσταση, Λυσίνη-μοτίβο reptor kinases, VIGS