Η τοπική σύνθεση αυξίνης που προκαλείται από το YUCCA4 που προκαλείται κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από νηματώδη ρίζας ρυθμίζει θετικά την ανάπτυξη της χοληδόχου και την ανάπτυξη νηματωδών
- 1 Σχολή Προηγμένων Επιστημών και Τεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Kumamoto, Kumamoto, Ιαπωνία
- 2 Διεθνής Οργανισμός Έρευνας για την Προηγμένη Επιστήμη και Τεχνολογία (IROAST), Πανεπιστήμιο Kumamoto, Kumamoto, Ιαπωνία
- 3 Ερευνητική Μονάδα λήθαργου και προσαρμογής, Κέντρο RIKEN για την επιστήμη των αειφόρων πόρων, Yokohama, Kanagawa, Ιαπωνία
- 4 Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Área de Fisiología Vegetal, Universidad de Castilla-La Mancha, Τολέδο, Ισπανία
- 5 International Research Center for Agricultural amp; Environmental Biology, Kumamoto University, Kumamoto, Japan
Τα παράσιτα και τα παθογόνα είναι γνωστό ότι χειραγωγούν τις ενδογενείς οδούς σηματοδότησης του ξενιστή για να διευκολύνουν τη διαδικασία μόλυνσης. Συγκεκριμένα, είναι γνωστό ότι οι φυτοπαρασιτικοί νηματώδεις κόμποι ρίζας (RKN) προκαλούν απόκριση αυξίνης στις θέσεις μόλυνσης, για να βοηθήσουν την ανάπτυξη των ριζικών χοληδόχων ως θέσεων τροφοδοσίας για τα παράσιτα. Εδώ περιγράφουμε τον ρόλο της τοπικής σύνθεσης αυξίνης που προκαλείται κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από RKN. Η εξωγενής εφαρμογή αναστολέων σύνθεσης αυξίνης μείωσε τους ρυθμούς σχηματισμού χοληδόχου RKN, το μέγεθος της χοληδόχου και την απόκριση αυξίνης στις χολή, ενώ τα ανάλογα αυξίνης παρήγαγαν τα αντίθετα αποτελέσματα, ενισχύοντας εκ νέου την ιδέα ότι η αυξίνη ρυθμίζει θετικά τον σχηματισμό χοληδόχου RKN. Μεταξύ των ενζύμων βιοσύνθεσης αυξίνης, το YUCCA4 (YUC4) βρέθηκε να ρυθμίζεται δραματικά προς τα πάνω κατά τη μόλυνση από RKN, υποδηλώνοντας ότι μπορεί να συμβάλλει σημαντικά στη συσσώρευση αυξίνης κατά τον σχηματισμό της χοληδόχου κύστης. Ωστόσο, το yuc4-1 έδειξε μόνο πολύ παροδική μείωση στα επίπεδα αυξίνης της χοληδόχου και δεν έδειξε σημαντικές αλλαγές στα ποσοστά μόλυνσης από RKN, υποδηλώνοντας ότι η απώλεια του YUC4 πιθανότατα αντισταθμίζεται από άλλες πηγές αυξίνης. Παρόλα αυτά, τα φυτά yuc4-1 παρήγαγαν σημαντικά μικρότερες χοληδόχους με λιγότερες ώριμες θηλυκές και μάζες αυγών, επιβεβαιώνοντας ότι η αυξίνη που συντίθεται από το YUC4 απαιτείται για τον σωστό σχηματισμό της χοληδόχου και την ανάπτυξη του RKN μέσα. Είναι ενδιαφέρον ότι ο προαγωγέας YUC4 ενεργοποιήθηκε επίσης κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από νηματώδη κύστη. Αυτές οι αποδείξεις υποδηλώνουν ότι η βιοσύνθεση αυξίνης από πολλαπλές πηγές, μία από τις οποίες είναι το YUC4, προκαλείται κατά την εισβολή φυτικών ενδοπαρασιτικών νηματωδών και πιθανότατα συμβάλλει στις μολύνσεις τους.
Εισαγωγή
Τα νηματώδη με ρίζες (Meloidogyne incognita, RKN) είναι φυτικά παράσιτα που προκαλούν σημαντικές βλάβες στα φυτά των καλλιεργειών σε πολλές περιοχές του κόσμου. Το RKN μολύνει ένα ευρύ φάσμα φυτικών ειδών, αν και είναι ιδιαίτερα εμφανή σε καλλιέργειες σολανωδών όπως η ντομάτα και η μελιτζάνα. Ο χρόνος παραγωγής RKN διαρκεί 3~8 εβδομάδες ανάλογα με το περιβάλλον. Τα νεανικά φυτρώνουν μία φορά μέσα στα αυγά και εκκολάπτονται ως μολυσματικά νεαρά νεαρά άτομα δεύτερου σταδίου (J2), τα οποία στη συνέχεια αναζητούν τις ρίζες των κατάλληλων φυτών ξενιστών για να μολύνουν. Μόλις βρεθεί ένας κατάλληλος ξενιστής, το J2 εισέρχεται στις ρίζες και μεταναστεύει προς το αγγειακό σύστημα, όπου προκαλούν το σχηματισμό εξειδικευμένων οργάνων τροφοδοσίας γνωστών ως ριζικοί κόμποι ή χολή (Wyss et al., 1992; Caillaud et al., 2008). Το RKN J2 είναι γνωστό ότι εγχέει διάφορες τελεστικές πρωτεΐνες σε αγγειακά κύτταρα, που επάγει τη διαφοροποίησή τους σε γιγαντιαία κύτταρα (GC) για να χρησιμεύσει ως πηγή διατροφής του ενδοφυτικού RKN. Τυπικά μια χολή περιέχει 5~7 GC, τα οποία αποτελούν την πλειοψηφία της μάζας και του όγκου της χοληδόχου (Bird, 1992; Jones and Payne, 1978). Καθώς τα ενδοφυτικά RKN τρέφονται με το GC, συνεχίζουν να τήκονται και να ωριμάζουν. Τελικά το ενήλικο θηλυκό RKN γεννά αυγά στην επιφάνεια της ρίζας για να συνεχίσει τον κύκλο ζωής.
Παρόμοια με πολλά άλλα παράσιτα, το RKN χρησιμοποιεί τις ενδογενείς ορμονικές οδούς σηματοδότησης του ξενιστή για να τροποποιήσει τις θέσεις μόλυνσης προς όφελός τους. Μια σημαντική φυτορμόνη που ρυθμίζει τον σχηματισμό της χοληδόχου RKN είναι η αυξίνη, η οποία είναι περισσότερο γνωστή για το ρόλο της στην εμβρυογένεση, την οργανογένεση και τον τροπισμό (Zhao, 2010). Η σύνδεση μεταξύ των λοιμώξεων από αυξίνη και RKN έχει στην πραγματικότητα τεκμηριωθεί εκτενώς στο παρελθόν (Favery et al., 2016· Gheysen and Mitchum, 2019). Οι εφαρμογές εξωγενούς αυξίνης έχουν βρεθεί ότι ενισχύουν τις μολύνσεις από Meloidogyne javanica στο ροδάκινο (Prunus persica) και την ντομάτα (Solanum lycopersicum) (Kochba and Samish, 1971· Glazer et al., 1986). Οι μεταλλάξεις ή η προς τα κάτω ρύθμιση των γονιδίων που εμπλέκονται στη σύνθεση, τη μεταφορά και την αντίληψη της αυξίνης σχετίζονται με μειωμένη ευαισθησία σε RKN σε διάφορα είδη φυτών, Η ένδειξη της αυξίνης είναι απαραίτητη κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από RKN (Richardson and Price, 1984; Kyndt et al., 2016; Wang et al., 2018). Συγκεκριμένα, η αυξίνη έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει θετικά την ανάπτυξη GC, την παραμόρφωση του κυτταρικού τοιχώματος γύρω από το GC και την ενεργοποίηση του κυτταρικού κύκλου μέσα στις χολή (de Almeida Engler et al., 1999). Από την άλλη πλευρά, αρκετοί παράγοντες απόκρισης αυξίνης και μεταφορείς βρέθηκαν να ρυθμίζονται έντονα κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από RKN, επιβεβαιώνοντας ότι το RKN διεγείρει ενεργά τη σηματοδότηση αυξίνης στο σημείο της μόλυνσης (Cabrera et al., 2014; Kyndt et al., 2016; Olmo et al., 2020).
Οι αυξίνες περιλαμβάνουν μια ομάδα μικρών μορίων με έναν αρωματικό δακτύλιο και μια λειτουργική ομάδα καρβοξυλικού οξέος μικρότερη από 0,55 Α μεταξύ τους (Sauer et al., 2013). Αρκετές φυσικές αυξίνες έχουν ανιχνευθεί σε φυτά, αν και μακράν η πιο σημαντική βιολογικά και καλύτερα χαρακτηρισμένη είναι η ινδολο-3-οξικό οξύ (IAA). Επιπλέον, αρκετές συνθετικές αυξίνες έχουν κατασκευαστεί ως ζιζανιοκτόνα ή διεγερτικά ανάπτυξης φυτών, όπως το 1-ναφθαλινοξικό οξύ (NAA) και το 2,4-διχλωροφαινοξυοξικό οξύ (2,4-D). Το ΙΑΑ συντίθεται από το αμινοξύ τρυπτοφάνη (Trp) μέσω ινδολο-3-πυρουβικού οξέος (IPA). Το Trp μετατρέπεται σε IPA μέσω της απομάκρυνσης της αμινομάδας που καταλύεται από την ΑΜΙΝΟΤΡΑΝΣΦΕΡΑΣΗ ΤΡΥΠΤΟΦΑΝΗΣ ΤΗΣ ΑΡΑΒΙΔΟΨΗΣ (TAA) (Stepanova et al., 2008). Το IPA στη συνέχεια μετατρέπεται σε ΙΑΑ μέσω αποκαρβοξυλίωσης που καταλύεται από την οικογένεια μονοοξυγενασών που περιέχουν φλαβίνες YUCCA (YUC) ως το περιοριστικό βήμα της οδού σύνθεσης αυξίνης (Mashiguchi et al., 2011· Won et al., 2011). Πέντε ομόλογα TAA και 11 YUC υπάρχουν στο γονιδίωμα Arabidopsis (Matthes et al., 2018). Τα γονίδια ΤΑΑ εκφράζονται αρκετά παντού, ενώ τα γονίδια YUC εμφανίζουν πιο διαφορετικά μοτίβα έκφρασης για τη σύνθεση αυξινών σε διαφορετικά όργανα (Cheng et al., 2006). Τα γονίδια YUC είναι επομένως οι καθοριστικοί παράγοντες που υπαγορεύουν την τοπική σύνθεση αυξίνης. Συνήθως οι αυξίνες συντίθενται στο βλαστό και στη συνέχεια μεταφέρονται προς τα κάτω στις ρίζες και αυτή η βαθμίδα αυξίνης παίζει σημαντικό ρόλο στην κορυφαία-βασική πολικότητα στα φυτά (Benková et al., 2003). Ωστόσο, η σύνθεση αυξίνης συμβαίνει πράγματι επίσης στις ρίζες,
Εδώ δείχνουμε ότι η εξωγενής εφαρμογή συνθετικών αυξινών και αναστολέων σύνθεσης αυξίνης επηρεάζει τη συχνότητα μόλυνσης από RKN και το μέγεθος της χοληδόχου που προκύπτει. Το YUC4, το οποίο συνήθως σχετίζεται με την ανάπτυξη των λουλουδιών, βρέθηκε ότι προκαλείται κατά την ανάπτυξη του RKN. Αν και η μετάλλαξη yuc4-1 δεν επηρέασε βαθιά τα ποσοστά μόλυνσης από RKN, ο αριθμός των αναδυόμενων ενήλικων θηλυκών και μαζών ωαρίων, το μέγεθος της χοληδόχου και το επίπεδο χοληδόχου IAA μειώθηκαν στο μετάλλαγμα yuc4-1. Είναι ενδιαφέρον ότι η έκφραση του YUC4 προκλήθηκε επίσης μετά τη μόλυνση Heterodera schachtii, αλλά η απώλεια της λειτουργίας των φυτών yuc4-1 δεν έδειξε σημαντική μεταβολή της εγκατάστασης νηματωδών κύστης ή στον αριθμό θηλυκών ή αρσενικών το YUC4 φαίνεται να προκαλείται ειδικά στις ρίζες μετά τη μόλυνση από RKN σε διευκολύνουν την ανάπτυξη της χοληδόχου κύστης, παρόλο που το YUC4 πιθανότατα δεν είναι η μόνη πηγή αυξίνης κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από RKN.
Υλικά και μέθοδοι
Φυτικά υλικά και συνθήκες ανάπτυξης
Για τη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) του οικότυπου Columbia-0 (Col-0). Τα διαγονιδιακά φυτά yuc4-1 (SM_3_16128), yuc1 (SALK_106293) και pYUC::GUS περιγράφηκαν στο Cheng et al., 2006 και Xu et al., 2017. Οι σπόροι υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 70% (v/v) αιθανόλη, ακολουθούμενη από αποστείρωση επιφάνειας [6% (w/v) αντιφορμίνη, 0,04% (v/v) Triton X-100] για 10 λεπτά και 3 πλύσεις με ddH2O. Οι σπόροι εαρινοποιήθηκαν για 2 ημέρες και βλάστησαν σε μέσα Murashige και Skoog (MS) [1/4x άλας MS (Sigma), 0,5% (β/ο) σακχαρόζη, 0,6% (β/ό) κόμμι gellan, ρΗ 6,4] σε 23 °C υπό σταθερό φως (70 µmol/sm 2 ).
Ανάλογα αυξίνης και αναστολείς σύνθεσης αυξίνης διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), στη συνέχεια προστέθηκαν στα μέσα στις ακόλουθες τελικές συγκεντρώσεις: 2,4-D, ΙΑΑ και ΝΑΑ: 0,1 μΜ, L-κυνουρενίνη: 10 μΜ, γιουκασίνη: 50 μΜ. Τα σπορόφυτα μεταφέρθηκαν σε μέσα με ορμόνες ή αναστολείς σύνθεσης αυξίνης 1 ημέρα μετά τον εμβολιασμό με RKN για 24 ώρες, πριν επιστρέψουν σε μη επεξεργασμένα μέσα MS.
Δοκιμασία μόλυνσης από νηματώδη
Η συντήρηση, η συγκομιδή και η αποστείρωση των νηματωδών ριζοκόμπων (Meloidogyne incognita) που συλλέχθηκαν από την πόλη Koshi, νομός Kumamoto, Ιαπωνία, ουσιαστικά πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στο Nishiyama et al., 2015. Σπορόφυτα Arabidopsis πέντε ημερών εμβολιάστηκαν με RKN στα 80 J2 ανά σπορόφυτο, στη συνέχεια επωάστηκε στους 25°C υπό τον κύκλο φωτός σύντομης ημέρας [8 ώρες φως (70 μmol/sm 2 ), 16 ώρες σκοτάδι]. Μετρήθηκαν τα χολή και μετρήθηκαν οι διάμετροι 14 ημέρες μετά τον εμβολιασμό (DPI) και οι μάζες αυγών μετρήθηκαν σε 42 DPI. Η διάμετρος ορίζεται ως η μεγαλύτερη απόσταση κατά μήκος μιας χοληδόχου κάθετης προς τον άξονα της ρίζας.
Τα νηματώδη κύστη (Heterodera schachtii, Αυστρία) παρασχέθηκαν ευγενικά από τον J. Hofmann (Πανεπιστήμιο BOKU, Αυστρία) και πολλαπλασιάστηκαν σε ρίζες μουστάρδας (Sinapsis alba cv Albatros) που αναπτύχθηκαν στο μέσο Gamborg (Gamborg et al., 1968) με 3% σακχαρόζη και 0,8 % Daishin agar (pH 6,4) στους 23°C στο σκοτάδι όπως περιγράφεται από τους Bohlmann και Wieczorek (2015). Η εκκόλαψη των αυγών διεγέρθηκε σε 3 mM ZnCl2 (Bohlmann and Wieczorek, 2015). Οι λοιμώξεις CN του Arabidopsis πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στους Olmo et al. (2017). Σπορόφυτα ηλικίας 7 ημερών εμβολιάστηκαν με 20-30 J2 ανά φυτό, τα τμήματα ρίζας που περιείχαν συγκυτία ανατέμθηκαν με το χέρι για προσδιορισμούς GUS στα στάδια μόλυνσης που υποδεικνύονται στο υπόμνημα των εικόνων. Οι αριθμοί των θηλυκών και των αρσενικών στα φυτά yuc4-1 μετρήθηκαν σε 14 DPI κάτω από ένα στερεομικροσκόπιο.
Ιστολογική χρώση και μικροσκοπία
Για τη χρώση με οξική φουξίνη RKN, τα σπορόφυτα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με ddH2O, στη συνέχεια καθαρίστηκαν με 1% (ν/ν) αντιφορμίνη για 5 λεπτά. Τα σπορόφυτα στη συνέχεια πλύθηκαν με ddH2O δύο φορές και χρωματίστηκαν με 30πλάσια αραιωμένη όξινη φουξίνη [0,35% (β/ο) όξινη φουξίνη σε 75% (ο/ο) οξικό οξύ] στους 100°C για 10 λεπτά. Τα ψυχθέντα δείγματα πλύθηκαν δύο φορές με ddH2O, μετά αποχρωματίστηκαν με οξινισμένη γλυκερόλη (1,2 mM HCl σε γλυκερίνη).
Η χρώση Promoter-GUS πραγματοποιήθηκε ουσιαστικά όπως περιγράφεται στο Cabrera et al., 2014. Τα δείγματα ιστών σταθεροποιήθηκαν σε 90% (v/v) ακετόνη για τουλάχιστον μία ημέρα. Τα δείγματα πλύθηκαν με ddH2O και στη συνέχεια επωάστηκαν σε διάλυμα χρώσης GUS {100 mM NaPO4, 10 mM αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA) ρΗ 8,0, K3[Fe(CN)6] και mM K4[Fe(CN)] (0,5 mM για CN φυτά, 3 mM για όλα τα άλλα δείγματα), 0,01% (w/v) Triton X-100, 0,5 mg/ml 5-βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολυλ-β-γλυκουρονιδάση} σε 37°C για 4 ώρες ( μη μολυσμένα και δείγματα 1~7 DPI) ή κατά τη διάρκεια της νύχτας (14~42 δείγματα DPI). Οι αντιδράσεις σταμάτησαν με επώαση των δειγμάτων 90% (ο/ο) αιθανόλη και 10% (ο/ο) οξικό οξύ. Τα δείγματα καθαρίστηκαν και τοποθετήθηκαν χρησιμοποιώντας 80% χλωροένυδρο (β/ο) σε 33% (ο/ο) γλυκερόλη.
Για τομές βαμμένες με μπλε τολουϊδίνη, οι ιστοί διηθήθηκαν υπό κενό με σταθεροποιητικό [2% (v/v) γλουταραλδεΰδη, 0,02 Μ κακοδυλικό οξύ] για 30 λεπτά, και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 4°C όλη τη νύχτα. Τα δείγματα πλύθηκαν για 10 λεπτά 5 φορές με 20 mM κακοδυλικό οξύ, μετά αφυδατώθηκαν μέσω βαθμίδωσης αιθανόλης (50%, 75%, 90%, 95% κάθε 10 λεπτά, μετά 100% για 20 λεπτά). Στη συνέχεια τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε μίγμα αιθανόλης:Technovit 7100 (Kulzer) 1:1 και ανακινήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες, στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε διάλυμα προενσωμάτωσης [1% (w/v) αντιδραστήριο θείωσης I σε Technovit 7100] και ανακινείται όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα βυθίστηκαν σε διάλυμα ενσωμάτωσης [6,6% (ο/ο) αντιδραστήριο θείωσης II σε διάλυμα προ-ενσωμάτωσης] και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 40°C όλη τη νύχτα. Τα μπλοκ δειγμάτων τεμαχίστηκαν σε πάχος 3~5 μm χρησιμοποιώντας μικροτόμο Leica RM2255, στη συνέχεια τοποθετήθηκε χρησιμοποιώντας ddH2O και επωάστηκε στους 60°C όλη τη νύχτα. Τα δείγματα χρωματίστηκαν σε 0,025% (β/ο) μπλε τολουιδίνης (Waldeck) και 0,04% ουδέτερο κόκκινο για αρκετά λεπτά, και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν με EUKITT (Ο. Kindler).
Τα συγκυτιακά μολυσμένα με CN απεικονίστηκαν με μικροσκόπιο Nikon SMZ1000, Olympus SZX16, ή Nikon eclipse 90i μικροσκόπιο. Όλες οι άλλες μικροσκοπικές εργασίες πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας στερεομικροσκόπιο Axio Imager M1 (Zeiss) τοποθετημένο με ψηφιακή κάμερα DP71 (Olympus).
Ποσοτικοποίηση ορμονών
Η εκχύλιση, ο καθαρισμός και ο ποσοτικός προσδιορισμός των φυτικών ορμονών πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στο Kanno et al. (2016).
Ανάλυση μεταγραφής
Το RNA εξήχθη από φυτικό ιστό χρησιμοποιώντας το RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen), και στη συνέχεια συντέθηκε cDNA χρησιμοποιώντας το PrimeScript RT Master Mix (Takara) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. 100 ng cDNA ανά δείγμα χρησιμοποιήθηκαν για ποσοτικοποίηση μεταγραφής χρησιμοποιώντας το σύστημα FastStart Essential DNA Green Master και το σύστημα Light Cycler 480 (Roche) χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα PCR των 95°C 5 λεπτά, μετά 95°C 10 δευτερόλεπτα, 60°C 10 δευτερόλεπτα , 72°C για 10 δευτερόλεπτα. Ως εσωτερικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε η 3-ΦΩΣΦΟΡΙΚΗ ΔΕΥΔΡΟΓΕΝΑΣΗ ΓΛΥΚΕΡΟΛΑΔΕΥΔΗΣ (GADPH). Primers used for PCR include ARF5 (forward: ATCTCAACGGATCCAAATCG, reverse: GGGTCTCAGCTCTCAGTTGG), YUC4 (forward: ACGCATCTGGTCTATGGAATG, reverse: CGGACTTGTACGCACTGG), TAA1 (forward: CCCCACTACACTCCCATCACTC, reverse: TCACCAATGCCCACCCAATAC), GADPH (forward: TTAGTCGCAACCTGAAGCCATC, reverse: TTCCACTGCTACTTGACCTTCG). Τα επίπεδα έκφρασης των συχνά χρησιμοποιούμενων γονιδίων κανονικοποιητών, όπως τα γονίδια της ακτίνης ή των ριβοσωμικών γονιδίων, μεταβάλλονται σε αναπτυσσόμενες χολή και GC στο Arabidopsis (Barcala et al, 2010), ενώ οι εκκινητές GAPDH έχουν χρησιμοποιηθεί για αναλύσεις qPCR για την παραγωγή δεδομένων σύμφωνα με το reporter-GUS και τη μικροσυστοιχία αποτελέσματα (Barcala et al., 2010; Yamaguchi et al., 2017; Díaz-Manzano et al., 2019). Επομένως, το GAPDH που χρησιμοποιείται ως κανονικοποιητής παράγει ισχυρά δεδομένα μεταγραφής για την ανάπτυξη χοληδόχων στο Arabidopsis.
Αποτελέσματα
Η τοπική σύνθεση αυξίνης ρυθμίζει την ανάπτυξη της χοληδόχου κύστης
Προκειμένου να προσδιοριστεί ο ρόλος της σύνθεσης αυξίνης κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από RKN, η ανάπτυξη της χοληδόχου Arabidopsis παρακολουθήθηκε παρουσία εξωγενούς αυξίνης ή αναστολέων σύνθεσης αυξίνης. Η L-κυνουρενίνη, ο αναστολέας του ενζύμου TAA1 που μετατρέπει την Trp σε IPA (He et al., 2011) και η yucasin, ο αναστολέας του ενζύμου YUC που μετατρέπει το IPA σε IAA (Tsugafune et al., 2017), χρησιμοποιήθηκαν μαζί με ινδολο-3-οξικό οξύ (ΙΑΑ) και συνθετικές αυξίνες 2, 4-διχλωροφαινοξυοξικό οξύ (2,4-D) και ναφθαλινοοξικό οξύ (ΝΑΑ) (Van Overbeek, 1959). Για να εξασφαλιστεί ότι αυτά τα αντιδραστήρια ασκούν τις προβλεπόμενες επιδράσεις τους, χρησιμοποιήθηκαν διαγονιδιακά φυτά Arabidopsis με τα κατασκευάσματα αναφοράς pDR5::GUS και pARF5::GUS για την παρακολούθηση της συσσώρευσης αυξίνης και των μοτίβων απόκρισης σε χολή RKN στις 7 ημέρες μετά τον εμβολιασμό (DPI). Παρουσία αναστολέων σύνθεσης αυξίνης, το pDR5:: Τα σήματα GUS καταργήθηκαν πλήρως στις χολή, και τα σήματα pARF5::GUS μειώθηκαν για να βρεθούν μόνο στα αγγεία, παρόλο που τα μέγιστα της αυξίνης στις άκρες της ρίζας παραμένουν αμετάβλητα (Εικόνα 1). Από την άλλη πλευρά, και τα δύο σήματα pDR5::GUS και pARF5::GUS βρέθηκαν να είναι εμφανή στις πλευρικές ρίζες όταν εφαρμόστηκαν ΙΑΑ και συνθετικές αυξίνες (Εικόνα 1). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι οι δραστηριότητες δυναμικής σύνθεσης αυξίνης εμφανίζονται σε χολή κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από RKN.
Σχήμα 1 Οι εντοπισμένες αποκρίσεις αυξίνης σε χολή μεταβάλλονται ως απόκριση σε θεραπείες εξωγενούς αυξίνης. Διαγονιδιακά σπορόφυτα Arabidopsis με κατασκευές αναφοράς pDR5:: GUS (A) ή pARF5::GUS (B) που υποβλήθηκαν σε ψεύτικη επεξεργασία (DMSO), υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αναστολέα σύνθεσης αυξίνης (10 μΜ L-κυνουρενίνη, 50 μΜ γιουκασίνη) ή συνθετική αυξίνη ανάλογα (0,1 μΜ 2,4-D, ΙΑΑ ή ΝΑΑ), εμβολιασμένα με RKN για 7 ημέρες ή μη μολυσμένα, και στη συνέχεια χρωματισμένα για GUS. Μπάρα = 100 μm. Τουλάχιστον τρεις ανεξάρτητες διαγονιδιακές γραμμές για κάθε κατασκεύασμα εξετάστηκαν με παρόμοια αποτελέσματα.
Γνωρίζοντας ότι η αυξίνη παίζει πιθανό ρόλο κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από RKN, η επίδραση της σύνθεσης αυξίνης στην ανάπτυξη των χοληφόρων αξιολογήθηκε στη συνέχεια. Οι θεραπείες L-κυνουρενίνης και γιουκασίνης προκαλούν σημαντικές μειώσεις στις διαμέτρους της χοληδόχου κύστης, ενώ η θεραπεία 2,4-D αύξησε σημαντικά τις διαμέτρους της χοληδόχου κύστης στα 14 DPI (Εικόνα 2Α). Απροσδόκητα, το IAA δεν επηρέασε σημαντικά το μέγεθος της χοληδόχου, ενώ το NAA μείωσε ουσιαστικά τη διάμετρο της χοληδόχου κύστης (Εικόνα 2Β). Διαφορετικές συνθετικές αυξίνες με διαφορετικές δομές προβλέπεται να παρουσιάζουν διακυμάνσεις στις φυσιολογικές τους επιδράσεις, και κάτι τέτοιο έχει πράγματι παρατηρηθεί σε όργανα πάνω από το έδαφος (Abebie et al., 2008). Είναι κατανοητό ότι παρόμοιες παραλλαγές μπορεί να συμβούν και στην ανάπτυξη της χοληδόχου κύστης. Επιπλέον, οι αριθμοί της χοληδόχου κύστης σε φυτά που υποβλήθηκαν σε αγωγή με αναστολείς σύνθεσης αυξίνης και συνθετικές αυξίνες αναλύθηκαν σε 14 DPI. 2, Η 4-D θεραπεία βρέθηκε να αυξάνει σημαντικά τους αριθμούς της χοληδόχου κύστης (Εικόνα 2C), ενώ η L-κυνουρενίνη, η γιουκασίνη, το IAA και το NAA δεν επηρέασαν σημαντικά τους αριθμούς της χοληδόχου κύστης (Εικόνα 2C, D). Δεδομένου ότι και οι δύο αναστολείς σύνθεσης αυξίνης δοκίμασαν μειωμένο μέγεθος χοληδόχου, η τοπική σύνθεση αυξίνης μπορεί να διαδραματίσει θετικό ρόλο κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από RKN. Από την άλλη πλευρά, καθώς κανένας από τους αναστολείς σύνθεσης αυξίνης που δοκιμάστηκαν δεν επηρέασε τους αριθμούς της χοληδόχου κύστης, η τοπικά συντιθέμενη αυξίνη δεν φαίνεται να επηρεάζει την εισβολή του RKN στις ρίζες.
Εικόνα 2 Απαιτείται σύνθεση αυξίνης για τη διατήρηση του σωστού μεγέθους της χοληδόχου. Διάμετροι χοληδόχου (Α, Β) και μέσος αριθμός χολών ανά φυτό (C, D) δενδρυλλίων Arabidopsis σε 7 DPI που έχουν υποστεί επεξεργασία με αναστολείς σύνθεσης αυξίνης (L-κυνυουρενίνη, γιουκασίνη) ή συνθετικά ανάλογα αυξίνης (2,4-D, IAA, NAA ). Εμφανίζονται τετράγωνα n ≥ 77 ± SD (A, B) και τετράγωνα κουτιών n ≥ 14 (C, D) . Κάθε σημείο δεδομένων στο (C, D) αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή από 6 φυτά. * υποδηλώνει σημαντική διαφορά από δείγματα που υποβλήθηκαν σε ψευδή επεξεργασία, *Plt;0,05, **Plt;0,01, γενικευμένη δοκιμή αθροίσματος κατάταξης Wilcoxon διορθωμένη για πολλαπλές συγκρίσεις. Πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον τρία βιολογικά αντίγραφα με παρόμοια αποτελέσματα.
Το συνθετικό γονίδιο αυξίνης YUC4 εκφράζεται σε χολή
Για την περαιτέρω οριοθέτηση του ρόλου της αυξίνης κατά τον σχηματισμό της χοληδόχου κύστης, εξετάστηκαν τα πρότυπα έκφρασης των γονιδίων σύνθεσης αυξίνης σε αναπτυσσόμενες χολή. Χρησιμοποιώντας τα δεδομένα μεταγραφής από τους Yamaguchi et al., 2017, τα πρότυπα έκφρασης των συνθετικών γονιδίων αυξίνης TAA1 και των γονιδίων YUC διερευνήθηκαν κατά τις πρώτες 7 ημέρες της μόλυνσης από RKN κατά τη διάρκεια της εισβολής RKN και της έναρξης γιγαντιαίων κυττάρων. Τα επίπεδα έκφρασης του ΤΑΑ1 και των περισσότερων από τα γονίδια YUC παραμένουν σχετικά σταθερά τις πρώτες 7 ημέρες της μόλυνσης, εκτός από το YUC4 που προκλήθηκε κατά τη μόλυνση (Συμπληρωματικό Σχήμα 1). Για να προσδιοριστεί πληρέστερα ο ρόλος του YUC4 σε όλη τη μόλυνση με RKN, τα επίπεδα έκφρασης του YUC4 και του ΤΑΑ1 εξετάστηκαν με qRT-PCR καθ’ όλη τη διάρκεια της μόλυνσης από RKN για έως και 42 DPI. Επιπλέον, AUXIN RESPONSE FACTOR 5 (ARF5), Αναλύθηκε επίσης ένα συστατικό σηματοδότησης απόκρισης αυξίνης που είναι γνωστό ότι προκαλείται και ρυθμίζει θετικά τη μόλυνση Meloidogyne javanica (Olmo et al., 2020). Τα επίπεδα μεταγραφής ARF5 βρέθηκαν να αυξάνονται αρκετά νωρίς σε περίπου 14 DPI και παρέμειναν σταθερά στη συνέχεια, σύμφωνα με το πρότυπο έκφρασής του κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από M. javanica (Εικόνα 3Α, Olmo et al., 2020). Από την άλλη πλευρά, το επίπεδο μεταγραφής YUC4 αυξήθηκε μέτρια κατά την πρώιμη ανάπτυξη της χοληδόχου κύστης και στη συνέχεια αυξήθηκε σημαντικά μετά από 14 DPI (Εικόνα 3Β). Αντίθετα, το επίπεδο μεταγραφής ΤΑΑ1 μειώθηκε γρήγορα μετά τη μόλυνση με RKN και παρέμεινε σχετικά χαμηλό μετά από 10 DPI (Εικόνα 3C). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω το πρότυπο έκφρασης του YUC4, δημιουργήθηκε διαγονιδιακό φυτό με το κατασκεύασμα αναφοράς pYUC4::GUS. Απουσία μόλυνσης από RKN, ο υποκινητής YUC4 είναι ενεργός στο άκρο της ρίζας, πλευρικές ρίζες και τα άπω άκρα των φύλλων (Εικόνα 4Α). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα του μεταγραφώματος και του qRT-PCR, η δραστηριότητα του προαγωγέα YUC4 σταδιακά αυξήθηκε κατά τη διάρκεια του σχηματισμού της χοληδόχου κύστης (Εικόνα 4Β). Τα σήματα pYUC4::GUS έγιναν δύσκολο να παρατηρηθούν πέραν των 28 DPI, αν και αυτό μπορεί να οφείλεται στο ότι τα σήματα GUS ήταν παρόντα μόνο στα κέντρα των χολών και δεν είναι ορατά εξωτερικά (Εικόνα 4Β). Αυτές οι αποδείξεις επιβεβαιώνουν ότι το YUC4 επάγεται σαφώς από τη μόλυνση RKN, αν και τα μεταγραφήματα YUC4 φαίνεται να συσσωρεύονται σχετικά αργά σε σύγκριση με τα άτομα που ανταποκρίνονται γρήγορα, όπως το ARF5. αν και αυτό μπορεί να οφείλεται στο ότι τα σήματα GUS ήταν παρόντα μόνο στα κέντρα των χολών και δεν είναι ορατά εξωτερικά (Εικόνα 4Β). Αυτές οι αποδείξεις επιβεβαιώνουν ότι το YUC4 επάγεται σαφώς από τη μόλυνση RKN, αν και τα μεταγραφήματα YUC4 φαίνεται να συσσωρεύονται σχετικά αργά σε σύγκριση με τα άτομα που ανταποκρίνονται γρήγορα, όπως το ARF5. αν και αυτό μπορεί να οφείλεται στο ότι τα σήματα GUS ήταν παρόντα μόνο στα κέντρα των χολών και δεν είναι ορατά εξωτερικά (Εικόνα 4Β). Αυτές οι αποδείξεις επιβεβαιώνουν ότι το YUC4 επάγεται σαφώς από τη μόλυνση RKN, αν και τα μεταγραφήματα YUC4 φαίνεται να συσσωρεύονται σχετικά αργά σε σύγκριση με τα άτομα που ανταποκρίνονται γρήγορα, όπως το ARF5.
Εικόνα 3 Η έκφραση των γονιδίων του μεταβολισμού της αυξίνης ρυθμίζεται κατά την ανάπτυξη της χοληδόχου κύστης. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των ARF5 (A) , YUC4 (B) και TAA1 (C) ποσοτικοποιήθηκαν με qRT-PCR κατά την ανάπτυξη της χοληδόχου κύστης. Οι τιμές κανονικοποιήθηκαν στο παλαιότερο διαθέσιμο χρονικό σημείο. Παρουσιάζονται μέσοι όροι n = 9 ± SE. Πραγματοποιήθηκαν τρία βιολογικά αντίγραφα με παρόμοια αποτελέσματα.
Σχήμα 4 Η δραστηριότητα του προαγωγέα YUC4 επάγεται κατά τον σχηματισμό της χοληδόχου κύστης. Χρωματισμένοι με GUS ιστοί διαγονιδιακού Arabidopsis με το κατασκεύασμα αναφοράς pYUC4::GUS. (Α) Άκρη ρίζας, πλάγιες ρίζες και φύλλα από μη μολυσμένα φυτά, (Β) χολή 1-42 DPI. Μπάρα = 100 μm. Τουλάχιστον τρεις ανεξάρτητες διαγονιδιακές σειρές εξετάστηκαν με παρόμοια αποτελέσματα.
Λαμβάνοντας υπόψη ότι το YUC4 συνθέτει αυξίνη ενώ το ARF5 ανταποκρίνεται στην αυξίνη και ότι το ARF5 ρυθμίζεται σημαντικά προς τα πάνω κατά τις μολύνσεις από παρασιτικά νηματώδη (Olmo et al., 2020), διερευνήθηκε η πιθανότητα ότι το YUC4 ρυθμίζει την έκφραση ARF5 κατά τη μόλυνση με RKN. Τα επίπεδα μεταγραφής ARF5 ποσοτικοποιήθηκαν πριν και μετά τη μόλυνση με RKN στο Col-0 και στο μετάλλαγμα απώλειας λειτουργίας yuc4-1 (Cheng et al., 2006; Xu et al., 2017). Ωστόσο, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα μεταγραφής ARF5 μεταξύ των φυτών Col-0 και yuc4-1 (Συμπληρωματικό Σχήμα 2). Μαζί με το εύρημα ότι το ARF5 ρυθμίζεται προς τα πάνω πριν από το YUC4 μετά τη μόλυνση με RKN (Εικόνα 3), αυτό σημαίνει ότι το YUC4 είναι απίθανο να μεσολαβήσει στην ανοδική ρύθμιση του ARF5 κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από RKN.
Το YUC4 ρυθμίζει θετικά την ωρίμανση και τη γονιμότητα του RKN
Για περαιτέρω αξιολόγηση της λειτουργίας του YUC4 κατά τη διάρκεια του σχηματισμού της χοληδόχου, πραγματοποιήθηκαν δοκιμές μόλυνσης RKN χρησιμοποιώντας yuc4-1. Για σύγκριση, το ομόλογο YUC4 YUCCA1 (YUC1), το οποίο είναι γνωστό ότι δεν ρυθμίζεται έντονα κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από RKN, αναλύθηκε επίσης (Cheng et al., 2006). Δεν ανιχνεύθηκαν σημαντικές διαφορές στον αριθμό των χολών, των ώριμων θηλυκών και των μαζών αυγών από το yuc1 σε σύγκριση με το Col-0 (Εικόνες 5A-C). Είναι ενδιαφέρον ότι ο αριθμός των αναδυόμενων ώριμων θηλυκών και οι μάζες αυγών μειώθηκαν σημαντικά στο yuc4-1 (Εικόνες 5Β, Γ), παρόλο που οι αριθμοί της χοληδόχου παραμένουν αμετάβλητοι (Εικόνα 5Α). Αυτό υποδηλώνει ότι το YUC4 πιθανότατα ρυθμίζει την ανάπτυξη RKN τελικού σταδίου μέσα στις χοληδόχους, αλλά όχι τον αρχικό σχηματισμό της χοληδόχου κατά τη διάρκεια της πρώιμης μόλυνσης, σε αντίθεση με το ARF5 που είναι γνωστό ότι ρυθμίζει έντονα τη συχνότητα σχηματισμού της χοληδόχου κύστης (Olmo et al., 2020). Επί πλέον, αν και δεν μπορούσε να ανιχνευθεί σημαντική διαφορά στις διαμέτρους χοληδόχου στο yuc4-1 στα 7 DPI (Εικόνα 5D), οι διάμετροι χοληδόχου yuc4-1 μειώθηκαν σημαντικά σε σύγκριση με εκείνη του Col-0 στα 42 DPI (Εικόνα 5Ε). Ο χρονισμός της ανοδικής ρύθμισης ARF5 και YUC4 που προκαλείται από τη μόλυνση από RKN φαίνεται να αντικατοπτρίζει τις αντίστοιχες λειτουργίες τους, όπου το ARF5 δρα νωρίς για να ρυθμίσει την έναρξη της χοληδόχου ενώ το YUC4 δρα αργά για να προάγει την ανάπτυξη της χοληδόχου κύστης και την ωρίμανση του RKN. Το γεγονός ότι το YUC4 δεν ρυθμίζει μεταγραφικά το ARF5 υποδηλώνει ότι αυτά τα δύο γονίδια πιθανόν να λειτουργούν ανεξάρτητα το ένα από το άλλο κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από RKN. Ο χρονισμός της ανοδικής ρύθμισης ARF5 και YUC4 που προκαλείται από τη μόλυνση από RKN φαίνεται να αντικατοπτρίζει τις αντίστοιχες λειτουργίες τους, όπου το ARF5 δρα νωρίς για να ρυθμίσει την έναρξη της χοληδόχου ενώ το YUC4 δρα αργά για να προάγει την ανάπτυξη της χοληδόχου κύστης και την ωρίμανση του RKN. Το γεγονός ότι το YUC4 δεν ρυθμίζει μεταγραφικά το ARF5 υποδηλώνει ότι αυτά τα δύο γονίδια πιθανόν να λειτουργούν ανεξάρτητα το ένα από το άλλο κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από RKN. Ο χρονισμός της ανοδικής ρύθμισης ARF5 και YUC4 που προκαλείται από τη μόλυνση από RKN φαίνεται να αντικατοπτρίζει τις αντίστοιχες λειτουργίες τους, όπου το ARF5 δρα νωρίς για να ρυθμίσει την έναρξη της χοληδόχου ενώ το YUC4 δρα αργά για να προάγει την ανάπτυξη της χοληδόχου κύστης και την ωρίμανση του RKN. Το γεγονός ότι το YUC4 δεν ρυθμίζει μεταγραφικά το ARF5 υποδηλώνει ότι αυτά τα δύο γονίδια πιθανόν να λειτουργούν ανεξάρτητα το ένα από το άλλο κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από RKN.
Εικόνα 5 Το YUC4 ρυθμίζει θετικά την ανάπτυξη και τη γονιμότητα του RKN. Μέσος αριθμός χοληφόρων ανά φυτό σε 14 DPI (A) , εμφανίστηκαν ενήλικα θηλυκά RKN ανά χολή (B) και μάζες αυγών ανά χολή (C) στα φυτά Col-0, yuc1 και yuc4-1. (D, E) Διάμετροι 7 DPI (D) και 42 DPI galls (E) σε φυτά Col-0 και yuc4-1. Κάθε σημείο δεδομένων στο (Α) αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή από 6 φυτά. Εμφανίζονται τετραγωνίδια n ≥ 204. Πραγματοποιήθηκαν τρία βιολογικά αντίγραφα με παρόμοια αποτελέσματα. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν τη σημασία από Col-0, *Plt;0,05, **Plt;0,01, γενικευμένη δοκιμή αθροίσματος κατάταξης Wilcoxon διορθωμένη για πολλαπλές συγκρίσεις.
Απαιτείται τοπική σύνθεση αυξίνης για την ωρίμανση του RKN
Μια άλλη ορμόνη που είναι γνωστό ότι λειτουργεί σε συνεννόηση με την αυξίνη για τη ρύθμιση της κυτταρικής διαίρεσης και διαφοροποίησης είναι η κυτοκινίνη (Schaller et al., 2014; Di Mambro et al., 2017). Παρά το γεγονός ότι είναι κυρίως γνωστή ως φυτική ορμόνη, η κυτοκινίνη έχει αποδειχθεί ότι εκκρίνεται από κυστικούς νηματώδεις για να μεσολαβήσει σε μολύνσεις (Siddique et al., 2015). Ομοίως, η κυτοκινίνη είναι επίσης γνωστό ότι εκκρίνεται από το RKN, αν και ο ρόλος της στη μόλυνση δεν έχει ακόμη επικυρωθεί (De Meutter et al., 2003). Άλλες φυτικές ορμόνες όπως το σαλικυκλικό οξύ, το γιασμαμονικό οξύ και το αιθυλένιο είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στη σηματοδότηση απόκρισης φυτικών παθογόνων, υποδηλώνοντας ότι πιθανότατα εμπλέκονται και στις αποκρίσεις έναντι των φυτικών παρασιτικών νηματωδών (Kammerhofer et al., 2015; Molinari, 2016).
Για να προσδιοριστεί εάν οι φαινότυποι μόλυνσης από yuc4-1 RKN σχετίζονται με μειωμένη σύνθεση αυξίνης και εάν άλλες φυτοορμόνες εμπλέκονται επίσης με τα ελαττώματα ανάπτυξης της χοληδόχου yuc4-1, τα επίπεδα φυτοορμόνης ποσοτικοποιήθηκαν στις χολή Col-0 και yuc4-1 στους 14, 28 και 42 DPI όπου το YUC4 εκφράζεται έντονα (Εικόνα 3Β). Αυξίνη/ινδολο-3-οξικό οξύ (Aux/IAA), ασπισικό οξύ (ABA), ιασμονικό οξύ (JA), JA ισολευκίνη (JA-lle), κυτοκινίνη/τρανς-ζεατίνη (CK/tZ) και σαλικυκλικό οξύ (SA) μετρήθηκαν τα επίπεδα. Το yuc4-1 gall παρουσίασε μια μέτρια αλλά σημαντική μείωση στο Aux/IAA στα 14 DPI σε σύγκριση με το Col-0 (Εικόνα 6Α). Ωστόσο, δεν ανιχνεύθηκαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα των ABA, JA, JA-Ile και CK/tZ μεταξύ Col-0 και yuc4-1 gall σε 14 έως 42 DPI (Εικόνες 6B–F). Επίσης, Δεν ανιχνεύθηκαν σημαντικές διαφορές σε αυτά τα επίπεδα ορμονών μεταξύ Col-0 και yuc4-1 από 1~14 DPI, όπου το YUC4 δεν εκφράζεται τόσο έντονα (Συμπληρωματικό Σχήμα 3). Επομένως, το YUC4 δεν φαίνεται να επηρεάζει έντονα τα επίπεδα φυτοορμόνης κατά τον σχηματισμό της χοληδόχου κύστης, εκτός από την αυξίνη σε περίπου 14 DPI. Ωστόσο, το γεγονός ότι οι χολήδες yuc4-1 εμφανίζουν μειωμένο επίπεδο αυξίνης σε χολή σε 14 DPI υποδηλώνει ότι τα ελαττώματα ωρίμανσης RKN που παρατηρούνται στο yuc4-1 μπορεί πράγματι να προκαλούνται από μειωμένη τοπική βιοσύνθεση αυξίνης.
Εικόνα 6 Το YUC4 επηρεάζει τα επίπεδα ορμονών στη χολή. Επίπεδα ορμονών (Α) αυξίνης/ινδολο-3-οξικού οξέος (Aux/IAA), (Β) αψισικού οξέος (ABA), (C) ιασμονικού οξέος (JA), (D) JA ισολευκίνης (JA-Ile), ( Ε) κυτοκινίνη/τρανς-ζεατίνη (CK/tZ) και (F) σαλικυλικό οξύ (SA) σε χολή Col-0 και yuc4-1 14, 28 και 42 DPI. Εμφανίζονται μέσοι όροι από n ≥ 3 ± SD, οι κύκλοι υποδηλώνουν μεμονωμένα σημεία δεδομένων, * υποδηλώνει σημαντική διαφορά από το Col-0, Plt;0,05, Student’s T-test. Πραγματοποιήθηκαν τρία βιολογικά αντίγραφα με παρόμοια αποτελέσματα. Τα δεδομένα από 0~14 DPI φαίνονται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 3.
Το YUC4 επάγεται από τη μόλυνση από κύστη νηματώδη Heterodera schachtii
Λαμβάνοντας υπόψη τη σημασία του YUC4 στις λοιμώξεις από RKN, ελέγξαμε επίσης τον υποτιθέμενο ρόλο του μετά τη μόλυνση μιας άλλης κύριας ομάδας φυτικών ενδοπαρασιτικών νηματωδών, των νηματωδών κύστεων (CN, Heterodera schachtii). Στα μολυσμένα με CN φυτά pYUC4::GUS διαγονιδιακά Arabidopsis, η δραστηριότητα του προαγωγέα YUC4 ανιχνεύτηκε ξεκάθαρα και εντοπίστηκε εντός των συγκυτίων με υψηλό ποσοστό GUS-θετικών συγκυτίων στο 7DPI (Εικόνες 7A–D). Οι δραστηριότητες του προαγωγέα YUC4 παρέμειναν με ανιχνεύσιμο σήμα στα συγκυτία στα 14 και 23 DPI, αν και το ποσοστό των θετικών στο GUS συγκυτίων μειώθηκε σημαντικά με την πάροδο του χρόνου (Εικόνες 7B–D, plt;0,05). Αυτό επιβεβαιώνει ότι η λοίμωξη από CN προκαλεί επίσης έκφραση YUC4 σε συγκυτία παρόμοια με τις χοληφόρες στη μόλυνση RKN, αν και η δραστηριότητα του προαγωγέα YUC4 φαίνεται να μειώνεται κατά τη διάρκεια της λοίμωξης από CN,
Σχήμα 7 Ο προαγωγέας YUC4 είναι ενεργός σε Arabidopsis syncytia που προκαλείται από Heterodera schachtii. (A–C) Ρίζες διαγονιδιακών φυτών pYUC4::GUS Arabidopsis μολυσμένα από H. schachtii στα 7 DPI (το δεξιό πλαίσιο δείχνει μεγεθυμένη εικόνα της συγκυτίας) (A) , 14 DPI (B) και 23 DPI (C) που δείχνουν έντονο GUS χρώση. Ράβδοι = 100 μm. (Δ) Ποσοστά GUS θετικών συγκυτίων από φυτά pYUC4::GUS στα 7, 14 και 23 DPI. Πραγματοποιήθηκαν τρία ανεξάρτητα πειράματα με τουλάχιστον 13 ανεξάρτητα φυτά που δοκιμάστηκαν ανά σημείο μόλυνσης. Η ανάλυση Chi-square [χ² (2, 46) = 22,53] έδειξε ότι η κατανομή των μπλε και λευκών χολών είναι σημαντικά διαφορετική μεταξύ των τριών σταδίων μόλυνσης, Plt;0,05.
Για να προσδιοριστεί εάν η λειτουργία YUC4 ήταν επίσης κρίσιμη κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από CN παρόμοια με RKN, προσδιορίστηκαν οι αριθμοί αρσενικών και θηλυκών ανά φυτό σε φυτά yuc4-1 σε σύγκριση με αυτόν του ελέγχου Col-0. Και οι δύο, ο αριθμός αρσενικών ή θηλυκών ανά φυτό ή ο συνολικός αριθμός αρσενικών συν θηλυκών δεν παρουσίασαν σημαντικές διαφορές μεταξύ Col-0 και yuc4-1 (Συμπληρωματικό Σχήμα 4). Έτσι, η λειτουργία YUC4 δεν ρυθμίζει έντονα την εγκατάσταση CN, τον προσδιορισμό του φύλου ή το σχηματισμό συγκυτίων στα φυτά ξενιστές. Ωστόσο, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε τη μερική συνεισφορά του YUC4 μαζί με άλλα μέλη της οικογένειας του YUCCA
Συζήτηση
Αν και η αυξίνη είναι μια φυτοορμόνη περισσότερο γνωστή για τους ρόλους της στην οργανογένεση και τον τροπισμό, η αυξίνη παίζει έναν εκπληκτικά κρίσιμο ρόλο κατά την αλληλεπίδραση φυτού-μικροβίου, την παθογένεση και τον παρασιτισμό. Για παράδειγμα, η αυξίνη έχει υπονοηθεί ότι συσσωρεύεται στις θέσεις μόλυνσης του πρωτίστου Plasmodiophora brassicae, του ημιπαρασιτικού φυτού Phtheirospermum japonicum και του βακτηρίου Xanthomonas oryzae pv oryzae (Ding et al., 2008; Wakatake et al., W20, 200). 2022). Επιπλέον, το GmYUC2 βρέθηκε επίσης ότι ρυθμίζει τον σχηματισμό οζιδίων ρίζας ριζοβακτηρίων στη σόγια (Wang et al., 2019). Η σημασία της αυξίνης μπορεί επίσης να φανεί στους φυτοπαρασιτικούς νηματώδεις, καθώς οι κυστικοί νηματώδεις βασίζονται ομοίως στη ροή της αυξίνης για τον σωστό σχηματισμό συγκυτίων (Grunewald et al., 2009). Η CN έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί απόκριση αυξίνης στα συγκυτία, πιθανώς μέσω του τελεστή 10A07 για την προώθηση του πυρηνικού εντοπισμού του κύριου ρυθμιστή της αυξίνης IAA16 (Karczmarek et al., 2004; Hewezi et al., 2015). Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι τόσο η μόλυνση από RKNs όσο και CNs επάγει το YUC4 στο Arabidopsis, υποδηλώνοντας ότι μπορεί να είναι μια κοινή απόκριση του φυτού ξενιστή στους φυτοπαρασιτικούς νηματώδεις (Εικόνα 3, Σχήμα 7). Ωστόσο, κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από CNs, το YUC4 μπορεί να λειτουργήσει με λειτουργικά περιττά γονίδια (πιθανώς άλλα γονίδια YUC) καθώς η μόλυνση από H.schachtii, ο προσδιορισμός του φύλου ή ο σχηματισμός συγκυτίων δεν άλλαξαν στο yuc4-1 σε σύγκριση με το Col-0 (Εικόνα 7). Αντίθετα, η ανάπτυξη των χολών ήταν μερικώς μειωμένη στα φυτά yuc4-1 (Εικόνα 5). Παρά το γεγονός ότι έχουν επιφανειακά παρόμοιους κύκλους ζωής, η βιολογία των κυττάρων που τροφοδοτούν τα RKN και τα CNs φαίνεται πολύ διακριτή σε κυτταρικό και μοριακό επίπεδο (Sijmons et al, 1991· Williamson and Gleason, 2003). Ενώ το RKN προκαλεί σχηματισμό γιγαντιαίων κυττάρων από επαναλαμβανόμενη μίτωση με μερική κυτταροκίνηση επιλεγμένων κυττάρων και ωοτοκία σε μάζες αυγών, το CN επάγει το σχηματισμό συγκυτίων συντήκοντας πολλαπλά κύτταρα-ξενιστές μαζί και προστατεύουν τα αυγά μέσα σε κύστεις ανθεκτικές στο τραύμα. Από αυτή την άποψη, κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από CNs απαιτείται εκροή αυξίνης με τη μεσολάβηση PIN-FORMED1 (PIN1) για την παροχή αυξινών στο αρχικό συγκυτιακό κύτταρο, όπου καθορίζεται ένα μέγιστο αυξίνης. Ωστόσο, μετά την έναρξη, τα PIN3 και PIN4 ανακατανέμουν τη συσσωρευμένη αυξίνη πλευρικά, γεγονός που συμβάλλει στην ακτινική επέκταση των σημείων τροφοδοσίας νηματωδών (Grunewald et al., 2009). Αντίθετα, οι εισαγωγείς αυξινών όπως το AUXIN RESISTANT1 (AUX1) και το LIKE AUX1 3 (LAX3) χρειάζονται όχι μόνο για την ανάπτυξη γιγαντιαίων κυττάρων αλλά και για την επέκταση (Kyndt et al., 2016). Αυτές οι διαφορές μπορεί επίσης να εξηγήσουν τις διαφορετικές αποκρίσεις των φυτών yuc4-1 και pYUC4::GUS μετά από μόλυνση με CN και RKN. Περαιτέρω ανάλυση μπορεί να αποκαλύψει λεπτομέρειες σχετικά με τον βιολογικό ρόλο της τοπικής σύνθεσης αυξίνης με τη μεσολάβηση YUC4 κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από CNs.
Οι δραστηριότητες αναφοράς που ανταποκρίνονται στην αυξίνη θα μπορούσαν να ανιχνευθούν τόσο σε πρώιμες τοποθεσίες μόλυνσης από RKN όσο και σε σημεία μόλυνσης CN (Ganguly and Dasgupta, 1987; Hutangura et al., 1999; Karczmarek et al., 2004; Oosterbeek et al., 2021). Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ποσοτικοποιήσει άμεσα τα επίπεδα ορμονών στις αναπτυσσόμενες χολή (Εικόνα 6). Παραδόξως, το επίπεδο αυξίνης μειώθηκε μόνο μέτρια και παροδικά στο yuc4-1 (Εικόνα 6Α). Είναι πιθανό η συσσώρευση αυξίνης να περιορίζεται μόνο στα γιγαντιαία κύτταρα και/ή στα γειτονικά κύτταρα, έτσι ώστε η τοπική συσσώρευση αυξίνης να μπορεί να ανιχνευθεί χρησιμοποιώντας γονίδια αναφοράς, αλλά να καλυφθούν όταν εξετάστηκαν ολόκληρες χολή. Τα σήματα pDR5:GFP έχουν τεκμηριωθεί ότι ανιχνεύονται σε πρώιμες αναπτυσσόμενες χολή, αλλά μόνο στα γειτονικά κύτταρα και όχι στα γιγαντιαία κύτταρα, σύμφωνα με την ιδέα ότι η συνολική αύξηση της αυξίνης μπορεί να μην είναι εμφανής (Absmanner et al., 2013). Αντίθετα, η δραστηριότητα pDR5:GUS ανιχνεύθηκε σε γιγαντιαία κύτταρα στο 4DPI (Cabrera et al., 2014). Τα προϊόντα GUS είναι γνωστό ότι είναι πολύ σταθερά, επομένως, είναι επίσης πιθανό η συσσωρευμένη αυξίνη στις χοληδόχους να μεταβολίζεται ταχέως και έτσι να μην ανιχνεύεται.
Παρόλο που η επίδραση της αυξίνης στη μόλυνση από RKN έχει χαρακτηριστεί στο παρελθόν, οι ειδικές επιδράσεις των αναστολέων σύνθεσης αυξίνης και των αναλόγων αυξίνης εμφανίστηκαν κάπως μεταβλητές στις αναλύσεις μας (Εικόνα 1, Εικόνα 2). Οι αναστολείς σύνθεσης αυξίνης L-κυνουρενίνη και γιουκασίνη στοχεύουν διαφορετικά ένζυμα, επομένως τα αποτελέσματά τους δεν μπορούν να αναμένεται να είναι πανομοιότυπα. Η ταυτόχρονη θεραπεία με L-κυνουρενίνη και γιουκασίνη έχει πράγματι αθροιστικά αποτελέσματα στην αναστολή της ανάπτυξης των φυταρίων, επιβεβαιώνοντας ότι χρησιμοποιούν ανεξάρτητους μηχανισμούς για την αναστολή της σύνθεσης αυξίνης (Nishimura et al., 2014). Ωστόσο, καθώς η αυξίνη είναι μια βασική ορμόνη με πολλαπλές οδούς σύνθεσης, είναι φυσιολογικά αδύνατο να καταργηθεί πλήρως η σύνθεση αυξίνης. Ακόμη και με την παρουσία αναστολέων σύνθεσης, οι υπολειμματικές αυξίνες του υποβάθρου πρέπει πάντα να λαμβάνονται υπόψη. Ομοίως, τα ανάλογα αυξίνης ΙΑΑ, Το NAA και το 2,4-D δείχνουν επίσης ποικίλες επιδράσεις στην κατανομή αυξίνης και στη μόλυνση από RKN (Εικόνες 1, 2). Παρόμοιες παραλλαγές έχουν παρατηρηθεί στο κλείσιμο και τη μείωση της αποκοπής ανθέων ρυζιού (Abebie et al., 2008; Huang et al., 2018). Το IAA, το NAA και το 2,4-D είναι γνωστό ότι δεσμεύουν τον υποδοχέα TIR1 με διακριτούς μηχανισμούς λόγω των διαφορετικών πλευρικών αλυσίδων τους (Tan et al., 2007). Αυτό περιπλέκεται περαιτέρω από το γεγονός ότι υπάρχουν πολλά μέλη της οικογένειας TIR1/AFB, το καθένα προφανώς έχει ελαφρώς διαφορετικούς μηχανισμούς δέσμευσης για να προσθέσει περαιτέρω παραλλαγές μεταξύ των αναλόγων αυξίνης (Parry et al., 2009). Τέλος, μπορεί να υπάρχει ανεξάρτητη από το TIR1 μονοπάτι σηματοδότησης αυξίνης μέσω πρωτεϊνών που δεσμεύουν αυξίνη (ABP), η οποία εισάγει παραλλαγές μεταξύ των αποκρίσεων των αναλόγων αυξίνης (Tromas et al., 2010).
Τα 11 γονίδια YUC στο γονιδίωμα του Arabidopsis έχουν διαφορετικά πρότυπα έκφρασης και δομές για τη σύνθεση αυξίνης σε διαφορετικά όργανα (Kriechbaumer et al., 2017). Η έκφραση των γονιδίων YUC καταστέλλεται επίσης από την αυξίνη σε έναν βρόχο αρνητικής ανάδρασης, περιπλέκοντας περαιτέρω τη μεταγραφική ρύθμισή τους (Suzuki et al., 2015). Γενικά, η αυξίνη συντίθεται κυρίως στο βλαστό, στη συνέχεια μετακινείται προς τη ρίζα μέσω μεταφορέων αυξίνης (Ljung et al., 2001). Από την άλλη πλευρά, η αυξίνη που συντίθεται στο βλαστό έχει αποδειχθεί ανεπαρκής για τη διάσωση της ανεπάρκειας αυξίνης στις ρίζες, υποδηλώνοντας ότι η τοπική σύνθεση αυξίνης είναι επίσης σημαντική για τη διατήρηση της ανάπτυξης των ριζών (Yamada et al., 2009; Chen et al., 2014). . Στις ρίζες, ο βαρυτροπισμός και η διαφοροποίηση του μεταξυλίου έχει αποδειχθεί ότι διαμεσολαβούνται από τα YUC3, 5, 7, 8 και 9 (Chen et al., 2014· Ursache et al., 2014). Αυτά τα γονίδια YUC μπορεί να αντιπροσωπεύουν το υπόλοιπο της τοπικής σύνθεσης αυξίνης στις ρίζες εκτός από το YUC4, γεγονός που μπορεί να εξηγήσει γιατί παρατηρήθηκαν πολύ μικρές διαφορές στα επίπεδα IAA των yuc4-1 gall (Εικόνα 6Α). Αντίθετα, το YUC4 είναι πιο γνωστό ότι ρυθμίζει την ανάπτυξη των λουλουδιών μαζί με το YUC1 και η σχέση τους με τις ρίζες μπορεί να μην είναι άμεσα εμφανής (Cheng et al., 2006). Τα YUC4 και YUC1 έχουν αναφερθεί ότι ρυθμίζουν την de novo οργανογένεση που προκαλείται από τραυματισμό (Chen et al., 2016), γεγονός που μπορεί να εξηγήσει εν μέρει γιατί το YUC4 ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από RKN. Το YUC4 είναι επίσης ασυνήθιστο ότι έχει 2 ισομορφές πρωτεΐνης: YUC4.1 και YUC4.2. Μόνο το YUC4.2 διαθέτει μια διαμεμβρανική περιοχή για να την αγκυροβολήσει στην κυτταροπλασματική επιφάνεια του ER και το YUC4.2 εμπλέκεται αποκλειστικά στην ανάπτυξη των λουλουδιών (Kriechbaumer et al., 2012).
Εδώ δείξαμε ότι το YUC4 εμπλέκεται στην τοπική σύνθεση αυξίνης, στο σχηματισμό της χοληδόχου κύστης και στην ωρίμανση του RKN (Εικόνα 5, Εικόνα 6Α). Αρκετά άλλα γονιδιακά προϊόντα, ιδιαίτερα εκείνα που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζουν την ανάπτυξη της χοληδόχου κύστης και την ενδοφυτική ανάπτυξη RKN. Η υπερβολική έκφραση πολλών μελών του ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου των μελών της οικογένειας των πρωτεϊνών που σχετίζονται με Kip (KRP) οδηγεί σε μικρότερα γιγαντιαία κύτταρα με λιγότερους πυρήνες, κατά συνέπεια μικρότερες χολή, και μειωμένο αριθμό χολών και μαζών ωαρίων (Vieira et al, 2013; Vieira and de Almeida Engler, 2015· Coelho et al., 2017). Η ανάπτυξη του RKN σε αυτά τα μεταλλάγματα καθυστέρησε επίσης εμφανώς, πιθανώς λόγω της έλλειψης τροφής από υπανάπτυκτα γιγαντιαία κύτταρα. Ομοίως, η σίγαση του ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου Arabidopsis που εξαρτάται από την κυκλίνη κινάση CDKA;1 οδηγεί επίσης σε μειωμένο αριθμό χολών, μάζες ωαρίων, και καθυστερημένη ανάπτυξη RKN (Van de Cappelle et al., 2008). Τα ελαττώματα ανάπτυξης RKN στο yuc4-1 φαίνονται ανεπαίσθητα σε σύγκριση με αυτά τα μεταλλάγματα του ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου. Χωρίς την πλήρη κατάργηση της τοπικής σύνθεσης αυξίνης και της ροής αυξίνης στις ρίζες, η υπολειμματική αυξίνη μπορεί να είναι αρκετή για να οδηγήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων για να διατηρήσει την ανάπτυξη της χοληδόχου κύστης, η οποία με τη σειρά της υποστηρίζει την ανάπτυξη RKN.
Πολλά σχετικά με τους ρόλους των φυτοορμονών κατά τις λοιμώξεις από παθογόνους παράγοντες πρέπει να διερευνηθούν. Εκτός από τον αναμενόμενο ρόλο τους στη ρύθμιση της ανάπτυξης των φυτών κατά τη διάρκεια της παθογένεσης, άλλοι ανορθόδοξοι μηχανισμοί μπορεί επίσης να λειτουργούν. Τόσο η αυξίνη όσο και η κυτοκινίνη έχει αποδειχθεί ότι πιθανώς επηρεάζουν άμεσα το RKN. Η κυτοκινίνη έχει αποδειχθεί ότι διεγείρει την ώθηση του στυλεού RKN J2, προάγοντας έτσι συμπεριφορές αναζήτησης τροφής (Kirwa et al., 2018). Ενώ το ΝΑΑ έχει αποδειχθεί ότι μεταβάλλει τη λιποφιλικότητα της επιφάνειας του RKN J2, υποδηλώνοντας ότι πρωτεΐνες που δεσμεύουν αυξίνη μπορεί να υπάρχουν στα πετσάκια RKN (Akhkha et al., 2002). Τόσο η αυξίνη όσο και η κυτοκινίνη έχουν τεκμηριωθεί ότι εκκρίνονται από τους ίδιους τους παρασιτικούς νηματώδεις, πιθανώς ως βοηθητικό στη διαδικασία μόλυνσης (De Meutter et al., 2003).
Δήλωση διαθεσιμότητας δεδομένων
Οι πρωτότυπες συνεισφορές που παρουσιάζονται στη μελέτη περιλαμβάνονται στο άρθρο/Συμπληρωματικό Υλικό. Περαιτέρω ερωτήσεις μπορούν να απευθύνονται στον αντίστοιχο συγγραφέα.
Συνεισφορές συγγραφέα
Οι RS, CE και SS συνέλαβαν και σχεδίασαν τα πειράματα. Οι RS, YK, PA-U πραγματοποίησαν τα πειράματα. Τα κράτη μέλη και η CE παρείχαν πόρους. Οι RS και AT έγραψαν το χειρόγραφο. Οι AT και SS αναθεώρησαν το χειρόγραφο. Η SS εξασφάλισε χρηματοδότηση. Όλοι οι συγγραφείς συνέβαλαν στο άρθρο και ενέκριναν την υποβληθείσα έκδοση.
Χρηματοδότηση
Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από τον KAKENHI (21K19273, 20KK0135, 20H00422, 18H05487, και JPJSBP120223206) από την Ιαπωνική Εταιρεία για την Προώθηση της Επιστήμης στο SS, καθώς και από την Ισπανική Κυβέρνηση (PID201301/3001/1001001/3001/10001/3001/2001/2001/2001/2001. RED2018-102407-T) και την κυβέρνηση Castilla-La Mancha (SBPLY/17/180501/000287 και SBPLY/21/180501/000033) στο CE. Η PA-U ήταν αποδέκτης επιχορήγησης FPI από το Υπουργείο Επιστημών και Καινοτομίας.
Ευχαριστίες
Ευχαριστούμε τον Y. Zhao (Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια του Σαν Ντιέγκο) για την παροχή του pYUC4::GUS διαγονιδιακό Arabidopsis, τον M. Watahiki (Πανεπιστήμιο Χοκάιντο) για την παροχή των μεταλλαγμένων σπόρων yuc4-1 και yuc1.
Σύγκρουση συμφερόντων
Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη απουσία εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.
Σημείωση εκδότη
Όλοι οι ισχυρισμοί που εκφράζονται σε αυτό το άρθρο είναι αποκλειστικά εκείνοι των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραιτήτως αυτούς των συνδεδεμένων οργανισμών τους ή του εκδότη, των εκδοτών και των κριτικών. Οποιοδήποτε προϊόν μπορεί να αξιολογηθεί σε αυτό το άρθρο ή ισχυρισμός που μπορεί να προβληθεί από τον κατασκευαστή του, δεν είναι εγγυημένο ή εγκεκριμένο από τον εκδότη.
Συμπληρωματικό υλικό
Το συμπληρωματικό υλικό για αυτό το άρθρο βρίσκεται στο διαδίκτυο στη διεύθυνση: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2022.1019427/full#suplementary-material
Γονίδια YUC, σύνθεση αυξίνης, Meloidogyne incoginta, Heterodera schachtii, Φυτοορμώματα, Φυτικά παρασιτικά νηματώδη