Κατασκευή ενός γενετικού χάρτη υψηλής ανάλυσης και αναγνώριση δεικτών πολυμορφισμού μονού νουκλεοτιδίου που σχετίζονται με το ύψος του μίσχου λουλουδιών στο κρεμμύδι

• Key Laboratory for Biology of Greenhouse Vegetables of Shandong Province/National Center for Vegetable Improvement (Shandong Branch), Vegetable Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan, Κίνα

Εισαγωγή: Το κρεμμύδι (Allium cepa L., 2n=16) είναι μια σημαντική οικονομικά και διατροφικά καλλιέργεια λαχανικών παγκοσμίως. Η κατασκευή ενός γενετικού χάρτη υψηλής ανάλυσης και η εξόρυξη γονιδίων με βάση τους χάρτες στο κρεμμύδι έχουν μείνει πίσω από άλλες καλλιέργειες λαχανικών όπως η ντομάτα και η πιπεριά.

Μέθοδοι: Σε αυτή τη μελέτη, κατασκευάσαμε έναν γενετικό χάρτη υψηλής ανάλυσης του κρεμμυδιού χρησιμοποιώντας 321 άτομα F2 από διασταύρωση δύο διπλών απλοειδών γραμμών DH-1×DH-17 και χρησιμοποιώντας τεχνολογία ενισχυμένου τμήματος ειδικού μήκους (SLAF)-seq. Ο γενετικός χάρτης που περιέχει 10.584 πολυμορφικά SLAF με 21.250 δείκτες πολυμορφισμού απλού νουκλεοτιδίου (SNP) και 8 ομάδες σύνδεσης αναπτύχθηκε για το κρεμμύδι, το οποίο εκτείνεται σε 928,32 cm, με μέση απόσταση 0,09 cm μεταξύ παρακείμενων δεικτών.

Αποτελέσματα: Χρησιμοποιώντας αυτόν τον χάρτη, πραγματοποιήσαμε QTL χαρτογράφηση του τόπου Ms που σχετίζεται με το χαρακτηριστικό αρσενικής γόνιμης γονιμότητας και αναπαράγαμε προηγούμενα αποτελέσματα χαρτογράφησης, τα οποία απέδειξαν ότι αυτός ο χάρτης ήταν καλής ποιότητας. Στη συνέχεια, ανιχνεύθηκαν τέσσερα QTL (βρίσκονται στα LG2, LG5 και LG8) για το ύψος του στελέχους λουλουδιών, εξηγώντας το 26,60% της φαινοτυπικής διακύμανσης. Μεταξύ αυτών, προτείναμε ότι 20 δείκτες SLAF (σε τρία QTL) του χαρακτηριστικού ύψους του μίσχου λουλουδιών ήταν αποτελεσματικοί ευνοϊκοί δείκτες αλληλικής παραλλαγής που σχετίζονται με την ετέρωση.

Συζήτηση: Συνολικά, ο γενετικός χάρτης δομήθηκε χρησιμοποιώντας SLAF-seq με βάση τις γραμμές DH και είναι ο χάρτης σύνδεσης κρεμμυδιού υψηλότερης ποιότητας και ανάλυσης μέχρι σήμερα. Θέτει τα θεμέλια για τη λεπτή χαρτογράφηση και την ταυτοποίηση υποψηφίων γονιδίων του ύψους του στελέχους λουλουδιών και παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με τους αναπτυξιακούς γενετικούς μηχανισμούς στην αναπαραγωγή κρεμμυδιών.

Εισαγωγή

Το κρεμμύδι (Allium cepa L.) είναι διπλοειδές είδος (2n=16) που ανήκει στο γένος Allium, οικογένεια Amaryllidaceae, και είναι μια σημαντική οικονομικά και διατροφικά καλλιέργεια λαχανικών παγκοσμίως (Khosa et al., 2016). Το κρεμμύδι είναι ευρέως διαδεδομένο, καλλιεργείται σε όλο τον Βορρά και τον Νότο, και είναι ένα από τα κύρια εγχώρια λαχανικά, αλλά και μία από τις κύριες εξαγωγικές καλλιέργειες λαχανικών στην Κίνα. Σύμφωνα με τα στατιστικά στοιχεία του Οργανισμού Τροφίμων και Γεωργίας (FAO, 2020), η Κίνα έχει τη μεγαλύτερη περιοχή παραγωγής και απόδοσης κρεμμυδιού στον κόσμο, αντιπροσωπεύοντας περίπου το 30% της συνολικής έκτασης και απόδοσης παγκοσμίως. Το κρεμμύδι είναι ένα διετές φυτό και η μείωση του μακρού κύκλου αναπαραγωγής είναι επιθυμητή για αποτελεσματική αναπαραγωγή κρεμμυδιών. Ως εκ τούτου, πολλές μελέτες επικεντρώνονται στους μοριακούς δείκτες αναγνώρισης της γονιμότητας που σχετίζονται με την πραγματική αναπαραγωγή (King et al., 1998; Park et al., 2013).

Η ομάδα μας ανέπτυξε στο παρελθόν μοριακούς δείκτες που συνδιαχωρίζονται με το γονίδιο ανδρικής στειρότητας και το γονίδιο αποκατάστασης, όπως ο δείκτης cDNA WHR240 (Huo et al., 2012), οι δείκτες SCAR DNF-566 και DNS-357 (Yang et al., 2013 ), και πολλαπλός δείκτης PCR AcSKP1 (Huo et al., 2015). Αυτοί οι δείκτες έχουν επαληθευτεί σε πληθυσμούς ανοιχτής επικονίασης (OP) με διαφορετικό γενετικό υπόβαθρο και μπορούν να χρησιμοποιηθούν άμεσα για τον προσδιορισμό του γονότυπου του πυρηνικού τόπου στειρότητας αρσενικών στο κρεμμύδι. Ωστόσο, η έρευνα για τη χαρτογράφηση γενετικής σύνδεσης και τους δείκτες στο κρεμμύδι απαιτεί πολύ χρόνο, λόγω του τεράστιου μεγέθους του γονιδιώματος (περίπου 15 Gb), του μεγάλου αριθμού επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών και του υψηλού ετερόζυγου γενετικού υποβάθρου (Labani and Elkington, 1987· King et al., 1998· Jakse et al., 2005· Finkers et al., 2021).

Μέχρι σήμερα, η πρόοδος στους γονιδιωματικούς και γενετικούς χάρτες του κρεμμυδιού έχει αναφερθεί ως εξής (King et al., 1998; Martin et al., 2005; Duangjit et al., 2013; Jo et al., 2017; Choi et al., 2020 Cho et al., 2021. Finkers et al., 2021). Ο πρώτος γενετικός χάρτης κρεμμυδιού κατασκευάστηκε από τους King et al. (1998). Στη συνέχεια, οι Martin et al. (2005) ανέπτυξε 100 νέους μοριακούς δείκτες με βάση τη βιβλιοθήκη ετικετών αλληλουχίας που εκφράζεται με ρύζι με υψηλή ομοιότητα και τους ενσωμάτωσε στον γενετικό χάρτη κρεμμυδιού που αναφέρθηκε παραπάνω χρησιμοποιώντας τη γραμμή αντικατάστασης χρωματιδών του κρεμμυδιού, κατασκευάζοντας έναν γενετικό χάρτη 14 ομάδων σύνδεσης με συνολικό μήκος 1.907 cm. Οι Duangjit et al. (2013) κατασκεύασε έναν γενετικό χάρτη που καλύπτει 936 δείκτες μονονουκλεοτιδίου πολυμορφισμού (SNP) και 10 ομάδες σύνδεσης με ανάλυση βιβλιοθήκης στην πλατφόρμα Roche 454 των φύλλων, των βολβών, των ριζών και των μπουμπουκιών ανθέων από δύο αμιγείς γραμμές. Jo et al. (2017) ανέπτυξε 202 δείκτες SNP χρησιμοποιώντας έναν πληθυσμό F2 με γονότυπο με αλληλούχιση (GBS) για την κατασκευή ενός γενετικού χάρτη με γενετική απόσταση 1.383 cm και μέση απόσταση δείκτη 8,08 cm. Οι Choi et al. (2020) πραγματοποίησε αναλύσεις GBS και τήξης υψηλής ανάλυσης (HRM) σε φυτά κρεμμυδιού F2 και κατασκεύασε έναν χάρτη γενετικής σύνδεσης κρεμμυδιού με 319 SNPs και 34 δείκτες HRM, που αποτελείται από 8 ομάδες σύνδεσης και καλύπτει 881,4 cm με μέσο διάστημα δείκτη 2,5 cm . Μέσω της ανάλυσης ποσοτικών θέσεων χαρακτηριστικών (QTL), ένα κύριο QTL, το qAS7.1, για τη σύνθεση ανθοκυανίνης κρεμμυδιού και δύο σημαντικά QTL, το qAC4. 1 και qAC4.2, για την περιεκτικότητα σε ανθοκυανίνη ταυτοποιήθηκαν. Στη συνέχεια, οι Cho et al. (2021) ανέπτυξαν 652 μοριακούς δείκτες χρησιμοποιώντας τον παραπάνω ίδιο πληθυσμό F2 για την κατασκευή γενετικών χαρτών με αυξημένη ανάλυση. Fujito et al. (2021) κατασκεύασε έναν χάρτη σύνδεσης υψηλής πυκνότητας στο Allium cepa χρησιμοποιώντας 1.435 δείκτες unigene που ελήφθησαν από τις πληροφορίες μεταγραφής 96 φυτών F2 (από μια διασταύρωση μεταξύ των γραμμών A. cepa DH). Η πρώτη de novo αλληλουχία γονιδιώματος (14,9 Gb με Ν50 464 Kb) κρεμμυδιού συναρμολογήθηκε με βάση την αλληλουχία σύντομης ανάγνωσης Illumina από τους Finkers et al. (2021) και καλύπτονται περίπου. Το 91% του αναμενόμενου μεγέθους γονιδιώματος με το 72,4% του γονιδιώματος να αναγνωρίζεται ως επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες και το 20% των υποτιθέμενων (ρετρό) τρανσποζονίων. Από αυτά, τα 2,4 Gb παραγγέλθηκαν σε οκτώ ομάδες σύνδεσης, κάτι που ήταν πολύτιμος πόρος για έρευνα και αναπαραγωγή. Ωστόσο,

Η πρόοδος στον προσδιορισμό γονότυπου με αλληλουχία έχει προσφέρει μια εξαιρετική ευκαιρία για αύξηση της ανάλυσης της χαρτογράφησης QTL αυξάνοντας τον αριθμό των δεικτών τα τελευταία χρόνια (Varshney et al., 2009). Η αλληλούχιση με ενισχυμένο θραύσμα ειδικού μήκους (SLAF) (SLAF-seq), μια στρατηγική υψηλής ευκρίνειας μεγάλης κλίμακας de novo SNP ανακάλυψης και γονότυπου, περιγράφηκε για πρώτη φορά από τους Sun et al. (2013). Το SLAF-seq έχει αποδειχθεί ότι είναι μια αποτελεσματική μέθοδος για την κατασκευή γενετικού χάρτη και έχει ευρείες εφαρμογές στο αγγούρι (Wei et al., 2014; Zhu et al., 2016), στο βαμβάκι (Zhang et al., 2016; Ali et al., 2016). , 2018), φιστίκι (Hu et al., 2018), μπιζέλι (Zheng et al., 2018), σόγια (Zhang et al., 2020; Mendoza et al., 2021) και μελιτζάνα (Wei et al., 2020 ). Σε σύγκριση με το GBS, το SLAF-seq έχει τα ακόλουθα πλεονεκτήματα: I. Η βιβλιοθήκη SLAF παρασκευάστηκε με το διπλό ενζυμικό πρωτόκολλο και το σύστημα διπλού γραμμικού κώδικα, ενώ το GBS με το απλό ένζυμο. Τα θραύσματα DNA που κόπηκαν με πέψη διπλού ενζύμου ήταν πιο ομοιόμορφα κατανεμημένα στο γονιδίωμα και οι εύκαμπτοι συνδυασμοί ενζύμων διευκόλυναν τον έλεγχο του αριθμού των δεικτών. II. η πυκνότητα δείκτη του SLAF ήταν 50-80/Mb, ενώ του GBS ήταν 5-40/Mb (Elshire et al., 2011; Sun et al., 2013). Επομένως, η τεχνολογία SLAF-seq θα μπορούσε να παρέχει μια στρατηγική υψηλής ανάλυσης για την ανακάλυψη SNP, η οποία είναι πιο κατάλληλη για ευρεία χρήση σε μεγάλης κλίμακας μελέτη γονότυπου. Λαμβάνοντας υπόψη τον αριθμό των δεικτών, την ποιότητα των δεικτών, τον αριθμό των δειγμάτων (321 δείγματα) και τη χρηματοδότηση της έρευνας (το τεράστιο και πολύπλοκο γονιδίωμα του κρεμμυδιού), το SLAF-seq είναι η βέλτιστη επιλογή για ανάπτυξη μοριακών δεικτών μεγάλης κλίμακας και σύνδεση υψηλής ανάλυσης κατασκευή χάρτη,

Σε αυτή τη μελέτη, κατασκευάσαμε έναν πληθυσμό F2 από μια διασταύρωση δύο διπλών απλοειδών γραμμών, DH-1 και DH-17. Χρησιμοποιώντας τον πληθυσμό F2 που περιέχει 321 άτομα και την τεχνολογία SLAF-seq, κατασκευάσαμε έναν γενετικό χάρτη υψηλής ανάλυσης σε κρεμμύδι με 21.250 δείκτες SNP. Για να επαληθεύσουμε την ποιότητα του χάρτη, πραγματοποιήσαμε χαρτογράφηση QTL ενός αρσενικού γόνιμου χαρακτηριστικού. Στη συνέχεια, εντοπίσαμε τα QTL που σχετίζονται με το χαρακτηριστικό του ύψους του στελέχους λουλουδιών (FSH) και διερευνήσαμε τα αποτελέσματά τους στο QTL για να αποκαλύψουμε τον γενετικό μηχανισμό της FSH του κρεμμυδιού, εξηγώντας αρχικά τον μηχανισμό ετερωσής του.

Υλικά και μέθοδοι

Φυτικά υλικά και φαινοτυπική αξιολόγηση

Δύο διπλές απλοειδείς γραμμές κρεμμυδιού (DH) χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ως γονείς. Το DH-1, του οποίου ο τόπος στειρότητας αρσενικού ήταν S (msms) και του οποίου ο φαινότυπος ήταν στείρος, προκλήθηκε από το ιαπωνικό υβρίδιο ATON (Takii Seed, Εικόνα 1Α) μέσω in vitro γυναικογένεσης (Liu et al., 2012). Μέσω της ανάλυσης κυτταρομετρίας ροής του ιστού των φύλλων, εντοπίσαμε προκαταρκτικά τις γραμμές DH DH-1 και DH-17. Για να διασφαλίσουμε ότι οι γραμμές DH διπλασιάστηκαν φυσικά και δεν υπήρχαν άλλες πηγές, όπως σωματικά κύτταρα, πραγματοποιήσαμε επίσης ανίχνευση PCR με συνδιαχωρισμένους δείκτες Ms/ms DNF-566 (F: 5´-TACAGATTTGTTTATCTTCTTCTTCTTCTCT-3´; R: 5´- TTCATTTGTTAGGATGTACTCTTACC-3´) και DNS-357 (F: 5´-TCAGTATCAATAGAAGGAATCAC-3´; R: 5´-GTATACCATTGGTACTTGATGCA-3´, Yang et al., 2013). Το DH-17, το οποίο ήταν για S (MsMs) με γόνιμο φαινότυπο, προήλθε από το ιαπωνικό υβρίδιο EARTH (Takii Seed, Εικόνα 1Α). Το υβρίδιο F1 προήλθε από διασταύρωση μεταξύ DH-1 (θηλυκός γονέας) και DH-17 (αρσενικός γονέας) που καλλιεργήθηκαν σε θερμοκήπια στις αρχές Σεπτεμβρίου του 2015. Στη συνέχεια, συνολικά 321 άτομα F2 προήλθαν από μια αυτοδιασταύρωση του F1 επιλέχθηκαν τυχαία για την κατασκευή του γενετικού χάρτη. Οι γονείς και 321 άτομα F2 καλλιεργήθηκαν σε θερμοκήπια στις αρχές Σεπτεμβρίου του 2017 στην Ακαδημία Γεωργικών Επιστημών Shandong, Jinan, Κίνα. Ο γονότυπος αναγνωρίστηκε για κάθε άτομο με δείκτες DNF-566 και DNS-357 (Yang et al., 2013) και τα άτομα αναγνωρίστηκαν ως αρσενικά στείρα ή γόνιμα μέσω επιθεώρησης της γύρης στο στάδιο των ώριμων ανθήρων τον Ιούνιο του 2019. Τα φαινοτυπικά δεδομένα για την FSH συλλέχθηκε τον Ιούνιο του 2019. Η FSH ορίζεται ως το ύψος από την επιφάνεια του εδάφους μέχρι την κορυφή του στελέχους, εξαιρουμένης της ταξιανθίας.

Σχήμα 1 Φαινότυποι των γονικών αμιγών γραμμών και των ατόμων F1, F2. (Α) Πατρική γραμμή DH-17 και μητρική γραμμή DH-1. (Β) Φαινότυποι φυτών τόσο των γονέων όσο και των ατόμων F1. (Γ) Αξιολόγηση φαινοτύπων του ύψους του μίσχου λουλουδιών για τα άτομα F2. (D) Γονότυποι και των δύο γονέων και των μερικών ατόμων F1 από τους δείκτες PCR DNF-566 και DNS-357. (Ε) Ύψος μίσχου λουλουδιών για τα αρχικά υβρίδια, γραμμές DH και F1.

Εξαγωγή DNA

Νεαρά φύλλα από τα 321 άτομα F2 και δύο γονείς συλλέχθηκαν και στη συνέχεια αποθηκεύτηκαν σε καταψύκτη -80°C. Το συνολικό γονιδιωματικό DNA εκχυλίστηκε από κάθε δείγμα σύμφωνα με τη μέθοδο βρωμιούχου κετυλοτριμεθυλ αμμωνίου (CTAB) (Murray and Thompson, 1980). Η συγκέντρωση και η ποιότητα του ολικού DNA αξιολογήθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε γέλες αγαρόζης 1% και φασματοφωτόμετρο ND-1000 (NanoDrop, Wilmington, DE, USA).

Κατασκευή και αλληλουχία βιβλιοθήκης SLAF

Το SLAF-seq με ορισμένες βελτιώσεις εφαρμόστηκε σε άτομα γονότυπου κρεμμυδιού 321 F2 και δύο γονείς το 2018 (Sun et al., 2013). Ελλείψει γονιδιώματος αναφοράς, το δεντρόβιο (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_001605985.2), ένα στενά συγγενικό είδος, επιλέχθηκε τελικά ως το γονιδίωμα αναφοράς για την ηλεκτρονική πρόβλεψη ενζυματικής πέψης σύμφωνα με το μέγεθος του γονιδιώματος του κρεμμυδιού και το περιεχόμενο GC. Οι HaeIII και EcoRV-HF (New England Biolabs, NEB, USA) επιλέχθηκαν ως ενδονουκλεάσες για την πέψη του γονιδιωματικού DNA. Μια απλή προεξοχή νουκλεοτιδίου (Α) προστέθηκε στα θραύσματα που υπέστησαν πέψη χρησιμοποιώντας θραύσμα Klenow (3’→5′, εξω-) και dATP στους 37°C. Στη συνέχεια, προσαρμογείς αλληλουχίας με επισήμανση διπλής όψης συνδέθηκαν στα θραύσματα με ουρά Α χρησιμοποιώντας λιγάση DNA Τ4. Οι αντιδράσεις PCR διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας αραιωμένο DNA περιοριστικής απολίνωσης, dNTPs, ^Q5®υψηλής πιστότητας DNA πολυμεράση και γενικοί εκκινητές PCR (F: 5′-AATGATACGGCGACCACCGA-3′, R: 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACG-3′; PAGE-καθαρισμένος, Life Technologies). Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας σφαιρίδια Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, High Wycombe, UK) και τα συγκεντρωμένα δείγματα διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 2%. Τα χωνεμένα θραύσματα που κυμαίνονταν από 414-444 ζεύγη βάσεων (με δείκτες και προσαρμογείς) σε μέγεθος αποκόπηκαν και καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ εκχύλισης γέλης QIAquick (Qiagen) και στη συνέχεια, ο προσδιορισμός αλληλουχίας άκρου ζεύγους (100 bp) των καθαρισμένων με γέλη προϊόντων εκτελείται σε σύστημα Illumina HiSeq 2500 (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.

Ανάλυση και γονότυπος δεδομένων SLAF-seq

Τα δεδομένα SLAF-seq αξιολογήθηκαν από το λογισμικό που αναπτύχθηκε από τους Sun et al. (2013) και η ταυτοποίηση και ο προσδιορισμός του γονότυπου του δείκτη SLAF πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με διαδικασίες που περιγράφονται από τους Sun et al. (2013). Πρώτον, μετά το φιλτράρισμα των αναγνώσεων χαμηλής ποιότητας (βαθμολογία ποιότητας lt; 20e), οι ακατέργαστες αναγνώσεις ταξινομήθηκαν σε κάθε απόγονο σύμφωνα με αλληλουχίες διπλού γραμμικού κώδικα. Στη συνέχεια, περικόπτοντας τους γραμμωτούς κώδικες και τις τερματικές θέσεις 5 bp από κάθε ανάγνωση υψηλής ποιότητας, οι καθαρές αναγνώσεις συγκεντρώθηκαν κατά ομοιότητα άνω του 90%. Οι αλληλουχίες που συγκεντρώθηκαν μαζί ορίστηκαν ως ένας τόπος SLAF (Zhang et al., 2015). Δεύτερον, ανιχνεύθηκαν τόποι μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού (SNP) για κάθε θέση SLAF μεταξύ των γονέων. Τα SLAF με περισσότερα από 5 SNP φιλτραρίστηκαν και οι τόποι SNP κάθε τόπου SLAF ανιχνεύθηκαν μεταξύ των γονέων χρησιμοποιώντας το κιτ λογισμικού GATK (McKenna et al., 2010). Αλληλόμορφα κάθε θέσης SLAF στη συνέχεια ορίστηκαν σύμφωνα με γονικές αναγνώσεις με βάθος αλληλουχίας gt;319,07 φορές, ενώ για κάθε απόγονο χρησιμοποιήθηκαν οι αναγνώσεις με βάθος αλληλουχίας gt;29,12 φορές για τον ορισμό των αλληλίων. Για διπλοειδή είδη, ένας τόπος SLAF μπορεί να περιέχει το πολύ 4 γονότυπους, επομένως οι τόποι SLAF με περισσότερα από 4 αλληλόμορφα ορίστηκαν ως επαναλαμβανόμενα SLAF και απορρίφθηκαν. Μόνο τα SLAF με 2 έως 4 αλληλόμορφα αναγνωρίστηκαν ως πολυμορφικά και θεωρήθηκαν πιθανοί δείκτες. Όλοι οι τόποι SLAF πολυμορφισμού γονότυποι προσδιορίστηκαν με συνέπεια στους γονικούς και απογόνους τόπους SNP. Επειδή οι πληθυσμοί χαρτογράφησης προήλθαν από δύο γονείς DH κρεμμυδιού με γονότυπο aa ή bb, μόνο τα πολυμορφικά SLAF αναλύθηκαν με βάση τον τύπο πληθυσμού F2 (aa × bb). ενώ για κάθε απόγονο χρησιμοποιήθηκαν οι αναγνώσεις με βάθος αλληλουχίας gt;29,12 φορές για τον ορισμό των αλληλίων. Για διπλοειδή είδη, ένας τόπος SLAF μπορεί να περιέχει το πολύ 4 γονότυπους, επομένως οι τόποι SLAF με περισσότερα από 4 αλληλόμορφα ορίστηκαν ως επαναλαμβανόμενα SLAF και απορρίφθηκαν. Μόνο τα SLAF με 2 έως 4 αλληλόμορφα αναγνωρίστηκαν ως πολυμορφικά και θεωρήθηκαν πιθανοί δείκτες. Όλοι οι τόποι SLAF πολυμορφισμού γονότυποι προσδιορίστηκαν με συνέπεια στους γονικούς και απογόνους τόπους SNP. Επειδή οι πληθυσμοί χαρτογράφησης προήλθαν από δύο γονείς DH κρεμμυδιού με γονότυπο aa ή bb, μόνο τα πολυμορφικά SLAF αναλύθηκαν με βάση τον τύπο πληθυσμού F2 (aa × bb). ενώ για κάθε απόγονο χρησιμοποιήθηκαν οι αναγνώσεις με βάθος αλληλουχίας gt;29,12 φορές για τον ορισμό των αλληλίων. Για διπλοειδή είδη, ένας τόπος SLAF μπορεί να περιέχει το πολύ 4 γονότυπους, επομένως οι τόποι SLAF με περισσότερα από 4 αλληλόμορφα ορίστηκαν ως επαναλαμβανόμενα SLAF και απορρίφθηκαν. Μόνο τα SLAF με 2 έως 4 αλληλόμορφα αναγνωρίστηκαν ως πολυμορφικά και θεωρήθηκαν πιθανοί δείκτες. Όλοι οι τόποι SLAF πολυμορφισμού γονότυποι προσδιορίστηκαν με συνέπεια στους γονικούς και απογόνους τόπους SNP. Επειδή οι πληθυσμοί χαρτογράφησης προήλθαν από δύο γονείς DH κρεμμυδιού με γονότυπο aa ή bb, μόνο τα πολυμορφικά SLAF αναλύθηκαν με βάση τον τύπο πληθυσμού F2 (aa × bb). Μόνο τα SLAF με 2 έως 4 αλληλόμορφα αναγνωρίστηκαν ως πολυμορφικά και θεωρήθηκαν πιθανοί δείκτες. Όλοι οι τόποι SLAF πολυμορφισμού γονότυποι προσδιορίστηκαν με συνέπεια στους γονικούς και απογόνους τόπους SNP. Επειδή οι πληθυσμοί χαρτογράφησης προήλθαν από δύο γονείς DH κρεμμυδιού με γονότυπο aa ή bb, μόνο τα πολυμορφικά SLAF αναλύθηκαν με βάση τον τύπο πληθυσμού F2 (aa × bb). Μόνο τα SLAF με 2 έως 4 αλληλόμορφα αναγνωρίστηκαν ως πολυμορφικά και θεωρήθηκαν πιθανοί δείκτες. Όλοι οι τόποι SLAF πολυμορφισμού γονότυποι προσδιορίστηκαν με συνέπεια στους γονικούς και απογόνους τόπους SNP. Επειδή οι πληθυσμοί χαρτογράφησης προήλθαν από δύο γονείς DH κρεμμυδιού με γονότυπο aa ή bb, μόνο τα πολυμορφικά SLAF αναλύθηκαν με βάση τον τύπο πληθυσμού F2 (aa × bb).

Η βαθμολόγηση του γονότυπου πραγματοποιήθηκε με μια Bayesian προσέγγιση για να εξασφαλιστεί η ποιότητα του γονότυπου (Sun et al., 2013). Μια εκ των υστέρων υπό όρους πιθανότητα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την κάλυψη κάθε αλληλόμορφου και τον αριθμό των SNP και η βαθμολογία ποιότητας γονότυπου που μεταφράστηκε από την πιθανότητα χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή αναγνωρισμένων δεικτών. Στη συνέχεια, μετρήθηκαν δείκτες χαμηλής ποιότητας και ο χειρότερος δείκτης ή άτομο διαγράφηκε. Υψηλής ποιότητας δείκτες SLAF για τη γενετική χαρτογράφηση φιλτραρίστηκαν με τα ακόλουθα κριτήρια: (1) περιείχαν περισσότερα από 5 SNP. (2) δείκτες με περισσότερα από 70% στοιχεία που λείπουν, (δηλαδή, πλήρης βαθμός δεικτών σε κάθε απόγονο κάτω από το 70% που απορρίφθηκε). (3) δείκτες με σημαντική παραμόρφωση διαχωρισμού (p gt; 0,05) με τη χρήση της δοκιμής chi-square. (4) βάθος ακολουθίας γονέων μικρότερο από 10×.

Κατασκευή χάρτη σύνδεσης

Για να διασφαλιστεί η αποτελεσματική κατασκευή του χάρτη υψηλής ανάλυσης και υψηλής ποιότητας, οι δείκτες SLAF ταξινομήθηκαν σωστά από τη στρατηγική HighMap και τα σφάλματα γονότυπου διορθώθηκαν με τον αλγόριθμο SMOOTH (van Os et al., 2005; Liu et al., 2014 ). Αρχικά, υπολογίστηκε ο ρυθμός ανασυνδυασμού και η τιμή του μεγιστοποιημένου λογάριθμου πιθανοτήτων (MLOD) μεταξύ δύο σημείων. Στη συνέχεια, το διάστημα της τιμής MLOD προσδιορίστηκε με τη διάταξη των τιμών MLOD αυτών των δεικτών από το μικρότερο στο μεγαλύτερο και οι υψηλότερες τιμές MLOD μεταξύ των δεικτών ήταν στην ίδια ομάδα σύνδεσης (LG). Τέλος, όλοι οι δείκτες SLAF (MLOD gt; 5) χωρίστηκαν σε 8 ομάδες σύνδεσης κρεμμυδιού (LGs, κάθε ομάδα σύνδεσης θεωρήθηκε ως χρωμόσωμα) για την κατασκευή του γενετικού χάρτη (Zhang et al., 2015). Λαμβάνοντας την LG ως μονάδα, επιλέχθηκε ο αλγόριθμος παλινδρόμησης/ελάχιστο δέντρο εκτεινόμενου ρυθμού (MST) για την εκτίμηση της γενετικής απόστασης μεταξύ γειτονικών δεικτών και η βέλτιστη γραμμική σειρά δεικτών στα LGs ελήφθη με ανάλυση αλληλουχίας παλινδρόμησης (Liu et al., 2014). Στη συνέχεια, ο αλγόριθμος k-πλησιέστερου γείτονα εφαρμόστηκε για να αποδοθούν γονότυποι που λείπουν (Huang et al., 2011) και η συνάρτηση χαρτογράφησης Kosambi χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση των αποστάσεων χάρτη (cM) (Kosambi, 1943).

Χαρτογράφηση QTL

Η σύνθετη ανάλυση εσωτερικής χαρτογράφησης (CIM) εντός του λογισμικού R/QTL εφαρμόστηκε για την QTL χαρτογράφηση της αρσενικής γονιμότητας των φυτών (Broman and Sen, 2009). Ο ουδός λογάριθμου πιθανοτήτων (LOD) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμή 1000 μεταθέσεων (PT, Plt;0,05) για την αξιολόγηση της στατιστικής σημασίας κάθε QTL. Για να εξασφαλιστεί ότι τα QTL μείζονος και δευτερεύουσας επίδρασης μπορούσαν να αναγνωριστούν, υιοθετήθηκαν διαφορετικές βαθμολογίες LOD. Αρχικά, λήφθηκε υπόψη ένα όριο LOD που αντιστοιχεί σε 0,99 εμπιστοσύνη, ακολουθούμενο από 0,95 και 0,90. Στη συνέχεια, εάν δεν ανιχνεύτηκε διάστημα QTL, το αποτέλεσμα PT δεν ελήφθη υπόψη και το όριο μειώθηκε χειροκίνητα σε 3,0, 2,5 και 2,0 διαδοχικά. Τα QTL ονομάζονταν κανονικά σύμφωνα με τις τοποθεσίες των ομάδων σύνδεσης και τα ονόματα χαρακτηριστικών τους.

Αποτελέσματα

Δεδομένα SLAF-seq και ανάλυση δείκτη SLAF

Η αλληλουχία SLAF του πληθυσμού 321 F2, συμπεριλαμβανομένων των δύο γονέων, παρήγαγε συνολικά 857,58 GB καθαρά δεδομένα που περιλαμβάνουν 4,29 G αναγνώσεις αλληλουχίας ζευγαρωμένων άκρων περίπου 100 bp (Πίνακας 1). Μεταξύ αυτών των αναγνώσεων, το 95,70% πέτυχε ή ξεπέρασε βαθμολογία ποιότητας 30 (Q30, που δείχνει πιθανότητα 0,1% σφάλματος και 99,9% εμπιστοσύνη) και η περιεκτικότητα σε γουανίνη-κυτοσίνη (GC) ήταν 40,54%. Υπήρχαν 131.741.300 αναγνώσεις από τον άνδρα γονέα DH-17 και 119.231.892 από τον θηλυκό γονέα DH-1 και ο μέσος αριθμός αναγνώσεων από τον πληθυσμό F2 ήταν 11.567.116. Συγκεκριμένα, οι αναγνώσεις του ρυζιού (Oryza sativa L. var. Japonica, μέγεθος γονιδιώματος ≈ 382 Mb), που χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος για την εκτίμηση της εγκυρότητας της κατασκευής της βιβλιοθήκης, ήταν 6.852.482 με 95,46% βάσεις Q30 και 45,60% GC (Πίνακας 1 ).

Πίνακας 1 Περίληψη των δεδομένων αλληλουχίας SLAF.

Ο αριθμός των SLAF (βάσει της διαδικασίας ανάπτυξης SLAF, με τις αναγνώσεις στην ίδια τοποθεσία να ορίζονται ως ετικέτα SLAF) στον πληθυσμό των ανδρών, γυναικών γονέων και F2 ήταν 533.049, 458.885 και 323.656, αντίστοιχα. Τα μέσα βάθη αλληλουχίας του αρσενικού, του θηλυκού γονέα και του F2 ήταν 90,84×, 100,19× και 13,68×, αντίστοιχα. Μεταξύ των 692.676 SLAF που αναπτύχθηκαν, 155.067 ήταν πολυμορφικά SLAF με ποσοστό 22,39% (Συμπληρωματικός Πίνακας S1). Από αυτές τις 155.067 πολυμορφικές ετικέτες SLAF, οι 93.539 κωδικοποιήθηκαν με επιτυχία και ομαδοποιήθηκαν σε οκτώ μοτίβα διαχωρισμού (ab×cd, ef×π.χ., ab×cc, cc×ab, hk×hk, lm×ll, nn×np και aa×bb. Εικόνα 2. Συμπληρωματικός Πίνακας S2). Λόγω του πληθυσμού F2 που λήφθηκε με τον αυτοπροσδιορισμό του F1 μιας διασταύρωσης μεταξύ δύο γονέων με τον ομόζυγο γονότυπο aa ή bb, μόνο τα φυτά F2 με το πρότυπο διαχωρισμού aa×bb ήταν έγκυρα πολυμορφικά SLAF. Υπήρχαν 77.766 SLAF που αντιστοιχούσαν στο 83,14% των συνολικών κωδικοποιημένων δεικτών που κατηγοριοποιήθηκαν με μοτίβο διαχωρισμού aa×bb σε αυτή τη μελέτη (Εικόνα 2).

Εικόνα 2 Γονοτυπική κατανομή δεικτών SLAF στο κρεμμύδι. Ο άξονας Υ υποδεικνύει τον αριθμό των δεικτών SLAF, ο άξονας x υποδεικνύει τα μοτίβα διαχωρισμού των δεικτών.

Ένας χάρτης γενετικής σύνδεσης υψηλής ανάλυσης

Για την παραγωγή ενός χάρτη υψηλής ποιότητας, SLAF χαμηλής ποιότητας με γονικό βάθος αλληλουχίας lt; 10×, αριθμό SNP gt; 5, παραμόρφωση διαχωρισμού p lt; 0,05 και MOLD μεταξύ γειτονικών δεικτών lt; 5 απορρίφθηκαν. Για την κατασκευή ενός γενετικού χάρτη, διατηρήθηκαν 10.584 υψηλής ποιότητας SLAF, συμπεριλαμβανομένων 21.250 SNPs (Πίνακας 2). Για τον χάρτη, η συνολική απόσταση του γενετικού χάρτη ήταν 928,32 cm και το μέσο διάστημα μεταξύ των δεικτών ήταν 0,09 cm (Πίνακας 2). Τα μέσα βάθη των SNP για τον θηλυκό, τον άνδρα γονέα και τον πληθυσμό F2 ήταν 313,74×, 324,40× και 29,12×, αντίστοιχα.

Πίνακας 2 Βασικές πληροφορίες για το γενετικό χάρτη υψηλής ανάλυσης του κρεμμυδιού.

Με βάση αυτές τις αναλύσεις, κατασκευάσαμε έναν νέο γενετικό χάρτη κρεμμυδιού υψηλής ανάλυσης που περιέχει 8 ομάδες σύνδεσης (LGs, Εικόνα 3Α). Οι γραμμικές διατάξεις και οι γενετικές αποστάσεις των δεικτών σε κάθε LG αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό HighMap. Η μέση ακεραιότητα των χαρτογραφημένων δεικτών ήταν 96,01%, γεγονός που εξασφάλιζε επαρκώς την ακρίβεια του γονότυπου. Οι γενετικές αποστάσεις στον χάρτη εκτείνονταν από 96,24 cm (LG7) έως 140,43 cm (LG3), με τον αριθμό των δεικτών SLAF σε κάθε LG να κυμαίνεται από 198 (LG6) έως 1.704 (LG2) και τους αριθμούς δεικτών SNP να κυμαίνεται από 352 έως (LG) 3.448 (LG8, Πίνακας 2). Ο μέσος αριθμός δεικτών SLAF και SNP σε όλα τα LG ήταν 1.323 και 2.656, αντίστοιχα, και οι δείκτες κάλυπταν ένα μέσο μήκος 116,04 cm. Επιτεύχθηκε ικανοποιητική ομοιομορφία στην κατανομή, με κενά lt; 5 cm να αποτελούν το 99,94% του συνόλου των LG,

Εικόνα 3 Γενετικός χάρτης κρεμμυδιού υψηλής ανάλυσης. (Α) Χάρτης γενετικής σύνδεσης κρεμμυδιού. Οι μαύρες γραμμές σε κάθε ομάδα σύνδεσης αντιπροσωπεύουν δείκτες SLAF στον χάρτη. (Β) Τοποθεσίες αρσενικών-γόνιμων χαρακτηριστικών στο γενετικό χάρτη. Ο κόκκινος κύκλος δείχνει τη θέση του αρσενικού γόνιμου χαρακτηριστικού.

Αρσενικά γόνιμος φαινοτυπικός χαρακτηρισμός του γενετικού πληθυσμού

Εκτελώντας PCR για την ανίχνευση του γονότυπου των γραμμών DH με συνδιαχωρισμένους δείκτες Ms/ms DNF-566 και DNS-357 (Yang et al., 2013), τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο τόπος Ms του DH-1 ήταν S (msms), ο οποίος ήταν ένας στείρος φαινότυπος. ο γονότυπος του DH-17 ήταν S (MsMs) με γόνιμο φαινότυπο (Εικόνα 1D). Σύμφωνα με τον γονότυπο του φυτού, ο πληθυσμός F2 χωρίστηκε στις ακόλουθες τρεις ομάδες (Συμπληρωματικό Excel S1): MsM 75 ατόμων, Msms 166 ατόμων και msms 80 ατόμων, με αναλογία διαχωρισμού 1:2:1. Με τη δοκιμή chi-square, η αναλογία διαχωρισμού των γόνιμων (241 άτομα) και των στείρων φυτών (81 άτομα) ήταν 3:1. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το χαρακτηριστικό Ms/ms του κρεμμυδιού ελέγχεται από έναν κυρίαρχο τόπο, ο οποίος ήταν σύμφωνος με τα προηγούμενα συμπεράσματα (Jones και Clarke, 1943).

Αναπαραγωγιμότητα χαρτογράφησης QTL στον πληθυσμό F2

Πριν από τη διεξαγωγή χαρτογράφησης QTL για τα αγρονομικά χαρακτηριστικά του κρεμμυδιού με βάση τον γενετικό χάρτη υψηλής ανάλυσης, πραγματοποιήσαμε χαρτογράφηση QTL ενός αρσενικού γόνιμου χαρακτηριστικού για να επαληθεύσουμε την ποιότητα του χάρτη. Μόνο ένας τόπος QTL για το αρσενικό γόνιμο χαρακτηριστικό, που ονομάστηκε MS8.1, χαρτογραφήθηκε στο LG8 (Εικόνα 3Β), το οποίο θα μπορούσε να εξηγήσει το 110,31% της παρατηρούμενης φαινοτυπικής παραλλαγής (PVE). Το διάστημα γενετικής απόστασης του qtl-MS8.1 κυμαινόταν από 84,83 έως 85,42 cm, και 11 δείκτες SLAF αποκαλύφθηκαν σε αυτόν τον τόπο. Η προσθετική και η κυρίαρχη επίδραση για το qtl-MS8.1 ήταν -0,49 και 0,49, αντίστοιχα, και η τιμή κατωφλίου LOD του QTL ήταν 241,64. Με βάση τη μελέτη των δεικτών DNF-566 και RNS-357 από τους Yang et al. (2013), (Kim et al., 2014; Kim et al., 2015) ανέπτυξε έναν συν-κυρίαρχο δείκτη jnurf13 [έναν δείκτη διαγραφής εισαγωγής (indel)] το 2014 και πρότεινε το 2015 ότι το γονίδιο επιδιόρθωσης ασυμφωνίας DNA κρεμμυδιού του βολβού (AcPMS1) ήταν ο πιο πιθανός υποψήφιος για τη ρύθμιση της αποκατάστασης της γονιμότητας. Οι Huo et al. (2015) αναγνώρισε την πιθανή πρωτεΐνη 1 (SKP1) που σχετίζεται με την κινάση S-φάσης σε ανισορροπία σύνδεσης με τον τόπο Ms. Συμπερασματικά, είναι πιθανό ότι ο τόπος QTL ανδρικής γονιμότητας που εντοπίζεται σε αυτή τη μελέτη είναι ο ίδιος με αυτόν που χαρτογραφήθηκε από τους King et al. (1998). Τα αποτελέσματα κατανομής δεικτών SLAF σε αυτή τη μελέτη παρουσιάζονται στο Σχήμα 4. Λεπτομερείς πληροφορίες ακολουθίας και οι θέσεις των SNP που αποκαλύπτονται εντός των SLAF παρουσιάζονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3. (2015) αναγνώρισε την πιθανή πρωτεΐνη 1 (SKP1) που σχετίζεται με την κινάση S-φάσης σε ανισορροπία σύνδεσης με τον τόπο Ms. Συμπερασματικά, είναι πιθανό ότι ο τόπος QTL ανδρικής γονιμότητας που εντοπίζεται σε αυτή τη μελέτη είναι ο ίδιος με αυτόν που χαρτογραφήθηκε από τους King et al. (1998). Τα αποτελέσματα κατανομής δεικτών SLAF σε αυτή τη μελέτη παρουσιάζονται στο Σχήμα 4. Λεπτομερείς πληροφορίες ακολουθίας και οι θέσεις των SNP που αποκαλύπτονται εντός των SLAF παρουσιάζονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3. (2015) αναγνώρισε την πιθανή πρωτεΐνη 1 (SKP1) που σχετίζεται με την κινάση S-φάσης σε ανισορροπία σύνδεσης με τον τόπο Ms. Συμπερασματικά, είναι πιθανό ότι ο τόπος QTL ανδρικής γονιμότητας που εντοπίζεται σε αυτή τη μελέτη είναι ο ίδιος με αυτόν που χαρτογραφήθηκε από τους King et al. (1998). Τα αποτελέσματα κατανομής δεικτών SLAF σε αυτή τη μελέτη παρουσιάζονται στο Σχήμα 4. Λεπτομερείς πληροφορίες ακολουθίας και οι θέσεις των SNP που αποκαλύπτονται εντός των SLAF παρουσιάζονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3.

Εικόνα 4 Γραφική άποψη της κατανομής των δεικτών που σχετίζονται με σχετικά χαρακτηριστικά στο κρεμμύδι LG 2, 5, 8.

Χαρτογράφηση QTL του χαρακτηριστικού FSH

Τα φαινοτυπικά δεδομένα FSH για όλα τα υλικά κρεμμυδιού (συμπεριλαμβανομένων δύο αρχικών επαγόμενων υβριδίων, δύο γονέων και πληθυσμών F1 και F2) παρουσιάζονται στα Σχήματα 1Β, Γ. Η FSH των διπλών απλοειδών DH-1 και DH-17 ήταν χαμηλότερη από την FSH του αυθεντικά επαγωγικά υβρίδια από τα οποία αναπτύχθηκαν οι μητρικές γραμμές DH κατά περισσότερο από 30%. Η FSH των φυτών F1 από τη διασταύρωση με το DH-1×DH-17 αποκαταστάθηκε στην FSH των αρχικών υβριδίων επαγωγής και το ύψος των φυτών F1 ήταν εξαιρετικά ομοιόμορφο και σταθερό (Εικόνα 1Ε). Το ύψος των μίσχων λουλουδιών σε αυτή τη μελέτη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν χάρακα. Η FSH κυμαινόταν σε ένα φάσμα από κοντό μίσχο έως ψηλό στέλεχος στους διαχωρισμένους πληθυσμούς και έτσι αξιολογήθηκε σε μια κλίμακα ύψους 1-5. Υπήρχε ένα μικρό ποσοστό ατόμων F2 εντός της περιοχής 90,01-100 cm (3%, 11 άτομα) και 130,01-140 cm (5%, 17 άτομα), στη συνέχεια 16% στην περιοχή 100,01-110 cm (51 άτομα), και το μεγαλύτερο ποσοστό εντός της περιοχής 110,01-120 cm (39%, 125 άτομα) και 120,01-130 cm (36%, 117 άτομα). Οι αναλύσεις των δεδομένων FSH έδειξαν μια κανονική κατανομή στον πληθυσμό F2 (Εικόνα 1C, Συμπληρωματικό Excel S1). Σύμφωνα με τον γονότυπο του πληθυσμού του κρεμμυδιού F2 από τα δεδομένα SLAF-seq, ανιχνεύθηκαν 49 δείκτες SLAF (βρίσκονται σε 4 QTL) και θεωρήθηκαν ως ευνοϊκοί δείκτες αλληλικής παραλλαγής (FAV) για το ύψος του στελέχους λουλουδιών. Τα LG, οι αρχικές θέσεις, οι θέσεις τερματισμού, οι δείκτες SLAF, τα LOD, οι προσθετικές τιμές, οι τιμές κυριαρχίας και οι PVE φαίνονται στα Σχήματα 4, 5, Πίνακας 3 και Συμπληρωματικός Πίνακας S4. Οι αναλύσεις των δεδομένων FSH έδειξαν μια κανονική κατανομή στον πληθυσμό F2 (Εικόνα 1C, Συμπληρωματικό Excel S1). Σύμφωνα με τον γονότυπο του πληθυσμού του κρεμμυδιού F2 από τα δεδομένα SLAF-seq, ανιχνεύθηκαν 49 δείκτες SLAF (βρίσκονται σε 4 QTL) και θεωρήθηκαν ως ευνοϊκοί δείκτες αλληλικής παραλλαγής (FAV) για το ύψος του στελέχους λουλουδιών. Τα LG, οι αρχικές θέσεις, οι θέσεις τερματισμού, οι δείκτες SLAF, τα LOD, οι προσθετικές τιμές, οι τιμές κυριαρχίας και οι PVE φαίνονται στα Σχήματα 4, 5, Πίνακας 3 και Συμπληρωματικός Πίνακας S4. Οι αναλύσεις των δεδομένων FSH έδειξαν μια κανονική κατανομή στον πληθυσμό F2 (Εικόνα 1C, Συμπληρωματικό Excel S1). Σύμφωνα με τον γονότυπο του πληθυσμού του κρεμμυδιού F2 από τα δεδομένα SLAF-seq, ανιχνεύθηκαν 49 δείκτες SLAF (βρίσκονται σε 4 QTL) και θεωρήθηκαν ως ευνοϊκοί δείκτες αλληλικής παραλλαγής (FAV) για το ύψος του στελέχους λουλουδιών. Τα LG, οι αρχικές θέσεις, οι θέσεις τερματισμού, οι δείκτες SLAF, τα LOD, οι προσθετικές τιμές, οι τιμές κυριαρχίας και οι PVE φαίνονται στα Σχήματα 4, 5, Πίνακας 3 και Συμπληρωματικός Πίνακας S4.

Εικόνα 5 Τοποθεσίες QTL του χαρακτηριστικού ύψους του μίσχου λουλουδιών χρησιμοποιώντας τον γενετικό χάρτη. (Α) ανάλυση QTL του χαρακτηριστικού ύψους του μίσχου λουλουδιών σε οκτώ ομάδες σύνδεσης. (Β) Φαινοτυπικό ποσοστό συνεισφοράς για παραλλαγή του χαρακτηριστικού ύψους του μίσχου λουλουδιών. (Γ) Η βαθμολογία LOD για τα QTL του χαρακτηριστικού ύψους του μίσχου λουλουδιών στο 2ο ^, 5ο ^και 8ο ^LG . Ο κόκκινος κύκλος ή το πλαίσιο υποδεικνύουν όλες τις περιοχές QTL που σχετίζονται με το χαρακτηριστικό του ύψους του μίσχου λουλουδιών.

Πίνακας 3 Ανάλυση ποσοτικών χαρακτηριστικών τόπων (QTL) για το ύψος του μίσχου λουλουδιών στο κρεμμύδι.

Για να αποφευχθούν ψευδώς θετικές θέσεις που προκαλούνται από επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες ή σφάλματα ματίσματος και να περιοριστεί περαιτέρω το εύρος των δεικτών FAV, κατά τη γνώμη μας, αυτοί οι δείκτες SLAF που ήταν ωφέλιμοι για το ύψος του μίσχου των ετερόζυγων απογόνων θα μπορούσαν να θεωρηθούν ως αποτελεσματικοί δείκτες FAV και θα πρέπει να επιλέγονται κατά προτίμηση για ανάλυση. Δεδομένου ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην FSH μεταξύ των γονέων που χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή του πληθυσμού, υπολογίσαμε μόνο την αναλογία των απογόνων ετεροζυγώτων που φέρουν δείκτες FAV για την προοπτική του φαινομένου ετερογένεσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αναλογία των ετερόζυγων ατόμων που έφεραν 20 δείκτες συσχετίστηκε θετικά με το ύψος του μίσχου λουλουδιών στον πληθυσμό F2 επιλέχθηκαν από τους 49 δείκτες SLAF (Συμπληρωματικός Πίνακας S5). Μετά την αξιολόγηση της αναλογίας των ετερόζυγων ατόμων F2 που έφεραν τον δείκτη FAV με δύο μέτρα, τη μέση αναλογία και τη συνολική αναλογία στον πληθυσμό F2, προτείναμε ότι υπήρχαν 20 δείκτες SLAF (σε 3 QTL) που θα μπορούσαν να θεωρηθούν ως αποτελεσματικοί δείκτες FAV της FSH. Σχήμα 6Α, Πίνακας 4). Αυτά τα 3 QTL που σχετίζονται με το χαρακτηριστικό FSH κατανεμήθηκαν στις ομάδες σύνδεσης LG2 και LG8 (Εικόνες 4, 5, Πίνακας 3). Το διάστημα γενετικής απόστασης των QTL κυμαινόταν από 0 έως 0,59 cm. Το PVE από τα 3 QTL κυμάνθηκε από 5,17-7,19%, και το συσσωρευμένο PVE ήταν 19,90%. Η τιμή LOD των 20 δεικτών SLAF κυμαινόταν από 5,17-6,84 (Πίνακας 5). Ο αριθμός των θέσεων SNP σε κάθε SLAF κυμαινόταν από 1 έως 5. Λεπτομερείς πληροφορίες ακολουθίας και θέσεις ευθυγράμμισης για όλους τους δείκτες παρουσιάζονται στον Πίνακα 3 και στο Σχήμα 4. αναλύσαμε τον αριθμό των αποτελεσματικών FAV που έφεραν 17 άτομα F2 με ύψος από 130 έως 140 cm. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Β, 11 από τα 17 μεμονωμένα φυτά περιείχαν περισσότερο από 50% αποτελεσματικών δεικτών FAV και ένα από τα καλύτερα άτομα F2-98 έφερε 20 αποτελεσματικούς δείκτες FAV της FSH.

Σχήμα 6 Στατιστική ανάλυση αποτελεσματικών ευνοϊκών ποικιλιών αλληλόμορφων (FAVs) στον πληθυσμό F2. (Α) Μέση αναλογία (συσσώρευση) απογόνων ετεροζυγώτων που φέρουν αποτελεσματικούς δείκτες FAV στον πληθυσμό F2. Η πορτοκαλί καμπύλη υποδεικνύει την καμπύλη τάσης μεταξύ της σωρευτικής αναλογίας και του ύψους του μίσχου του λουλουδιού. (Β) Συχνότητες των 20 τόπων FAV στα άτομα F2 με εύρος ύψους από 130-140 cm.

Πίνακας 4 Είκοσι αποτελεσματικές ευνοϊκές αλληλόμορφες παραλλαγές SLAF που σχετίζονται με το χαρακτηριστικό του ύψους του στελέχους λουλουδιών και την ετερότητα στον πληθυσμό F2.

Πίνακας 5 Λεπτομερείς πληροφορίες αποτελεσματικών ευνοϊκών αλληλόμορφων δεικτών SLAF για το ύψος του μίσχου του άνθους.

Συζήτηση

Κατασκευή γενετικού χάρτη υψηλής ανάλυσης βασισμένου σε διπλές απλοειδείς γραμμές κρεμμυδιού

Για να αναλυθεί ένα κρεμμύδι που είναι φυτό με διασταυρούμενη επικονίαση, με μεγάλο, επαναλαμβανόμενο γονιδίωμα (Khosa et al., 2016; Finkers et al., 2021), οι γραμμές DH είναι η πιο ιδανική πρώτη επιλογή για τη χαρτογράφηση διαχωρισμένων πληθυσμών. Μια στείρα κίτρινη διπλή απλοειδής γραμμή (DH-1) και μια γόνιμη κίτρινη διπλή απλοειδής γραμμή (DH-17) χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή ενός πληθυσμού χαρτογράφησης F2 (που περιέχει 321 άτομα) κρεμμυδιών σε αυτή τη μελέτη. Η στρατηγική SLAF-seq που εφαρμόσαμε βασίστηκε σε τεχνολογίες προσδιορισμού αλληλουχίας υψηλής απόδοσης και αναπτύχθηκε ως απλοποιημένη μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας γονιδιώματος (Sun et al., 2013). Τα πλεονεκτήματα της χρήσης της τεχνολογίας SLAF-seq αντί άλλων διαθέσιμων μεθόδων (όπως RAD, GBS) είναι ότι η SLAF υιοθέτησε ένα ευέλικτο πρωτόκολλο διπλού ενζύμου και ένα σύστημα διπλού γραμμωτού κώδικα, που θα μπορούσε να εξασφαλίσει τους φιλτραρισμένους μοριακούς δείκτες πιο ομοιόμορφα κατανεμημένους στο γονιδίωμα (Baird et al., 2008; Elshire et al., 2011; Sun et al., 2013) και αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί αλληλουχία υψηλού βάθους για να ορίσει de novo γονότυπους χωρίς αλληλουχία γονιδιώματος αναφοράς και SNP αναφοράς, που είναι κατάλληλο για την κατασκευή γενετικού χάρτη κρεμμυδιού.

Τα τελευταία χρόνια, το SLAF-seq έχει εφαρμοστεί ευρέως στην κατασκευή γενετικών χαρτών υψηλής ανάλυσης όχι μόνο για καλλιέργειες με γονιδιώματα αναφοράς (Dai et al., 2018; Wang et al., 2018; Wei et al., 2020; Tao et al. ., 2022), αλλά και για φυτά χωρίς γονιδίωμα αναφοράς, όπως το οπωροφόρα (Zhao et al., 2016) και το μπιζέλι (Zheng et al., 2018). Λεπτομερείς πληροφορίες για το γονιδίωμα του Allium cepa DHCU066619 δεν έχουν ακόμη δημοσιευθεί και το τεράστιο γονιδίωμά του (14,9 Gb) αποτελείται από πολύπλοκες εξαιρετικά επαναλαμβανόμενες περιοχές με (ρετρό) τρανσποζόνια (Finkers et al., 2021). Επομένως, χρησιμοποιήσαμε την τεχνική SLAF-seq για να δημιουργήσουμε έναν υψηλής ποιότητας γενετικό χάρτη του κρεμμυδιού χωρίς γονιδίωμα αναφοράς το 2018. Μέχρι σήμερα, αν και έχουν κατασκευαστεί αρκετοί γενετικοί χάρτες κρεμμυδιού (Duangjit et al., 2013; Jo et al., 2017 Choi et al., 2020; Ryu et al., 2021), χρησιμοποιήσαμε 10, 584 πολυμορφικοί δείκτες με πλήρη βαθμό 96,01% για την κατασκευή χάρτη γενετικής σύνδεσης κρεμμυδιού 8 ομάδων σύνδεσης (LGs) συνολικού μήκους 928,32 cm. Ο μέσος δείκτης που κατανεμήθηκε στα 8 LG ήταν 1.323, αλλά μόνο 198 δείκτες αναπτύχθηκαν από το LG6. Αναφέρθηκε στη σχετική βιβλιογραφία για τον γενετικό χάρτη του κρεμμυδιού και διαπίστωσε ότι οι δείκτες που αναπτύχθηκαν για κάθε LG ήταν περίπου 50-200 (Choi et al., 2020; Cho et al., 2021; Fujito et al., 2021) και ελήφθησαν υπόψη μεγάλος αριθμός επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών που υπάρχουν στο γονιδίωμα του κρεμμυδιού (Finkers et al., 2021), πιστεύαμε ότι η ποιότητα αυτού του γενετικού χάρτη δεν επηρεάστηκε, αν και ο αριθμός των δεικτών που εντοπίστηκαν στο LG6 ήταν χαμηλός. Στο σύνολό του, ο χάρτης σύνδεσης φέρει τον μεγαλύτερο αριθμό θέσεων σήμανσης μεταξύ όλων των χαρτών σύνδεσης κρεμμυδιού που έχουν κατασκευαστεί μέχρι σήμερα. Σε συνδυασμό με το υψηλό βάθος της γονικής αλληλουχίας, πληροφορίες χαμηλού ρυθμού δεδομένων που λείπουν, μέσο διάστημα μεταξύ δεικτών (0,09 cm) και μέγιστη τιμή χάσματος (Πίνακας 2, Εικόνα 3Α, Συμπληρωματικός Πίνακας S6), ο χάρτης σύνδεσης που κατασκευάστηκε στη μελέτη μας έχει την υψηλότερη ποιότητα και ανάλυση μεταξύ των χαρτών σύνδεσης κρεμμυδιού. Αν και το συνολικό μήκος του γενετικού χάρτη ήταν πολύ μικρό συγκριτικά με το μέγεθος του γονιδιώματος του κρεμμυδιού, ο γενετικός μας χάρτης υψηλής ανάλυσης όχι μόνο θα πρέπει να είναι χρήσιμος για ακριβή και αξιόπιστη χαρτογράφηση για QTL, αλλά έχει επίσης σημαντική σημασία αναφοράς για τη συναρμολόγηση γονιδιώματος κρεμμυδιού DH-17. Ωστόσο, η χρωμοσωμική ταυτότητα των LGs δεν έχει γίνει ακόμη γνωστή σε αυτήν τη μελέτη, θα προσπαθήσουμε να κατασκευάσουμε έναν δείκτη αντιστοίχισης φυσικών χρωμοσωμάτων με βάση το μεταγραφικό δείκτη unigene (Fujito et al., 2021) ή να πραγματοποιήσουμε συναρμολόγηση γονιδιώματος DH-17 κρεμμυδιού για να επιλύσουμε αυτό θέμα σε μελλοντικές εργασίες. μέσο διάστημα μεταξύ δεικτών (0,09 cm) και μέγιστης τιμής χάσματος (Πίνακας 2, Εικόνα 3Α, Συμπληρωματικός Πίνακας S6), ο χάρτης σύνδεσης που κατασκευάστηκε στη μελέτη μας έχει την υψηλότερη ποιότητα και ανάλυση μεταξύ των χαρτών σύνδεσης κρεμμυδιού. Αν και το συνολικό μήκος του γενετικού χάρτη ήταν πολύ μικρό συγκριτικά με το μέγεθος του γονιδιώματος του κρεμμυδιού, ο γενετικός μας χάρτης υψηλής ανάλυσης όχι μόνο θα πρέπει να είναι χρήσιμος για ακριβή και αξιόπιστη χαρτογράφηση για QTL, αλλά έχει επίσης σημαντική σημασία αναφοράς για τη συναρμολόγηση γονιδιώματος κρεμμυδιού DH-17. Ωστόσο, η χρωμοσωμική ταυτότητα των LGs δεν έχει γίνει ακόμη γνωστή σε αυτήν τη μελέτη, θα προσπαθήσουμε να κατασκευάσουμε έναν δείκτη αντιστοίχισης φυσικών χρωμοσωμάτων με βάση το μεταγραφικό δείκτη unigene (Fujito et al., 2021) ή να πραγματοποιήσουμε συναρμολόγηση γονιδιώματος DH-17 κρεμμυδιού για να επιλύσουμε αυτό θέμα σε μελλοντικές εργασίες. μέσο διάστημα μεταξύ δεικτών (0,09 cm) και μέγιστης τιμής χάσματος (Πίνακας 2, Εικόνα 3Α, Συμπληρωματικός Πίνακας S6), ο χάρτης σύνδεσης που κατασκευάστηκε στη μελέτη μας έχει την υψηλότερη ποιότητα και ανάλυση μεταξύ των χαρτών σύνδεσης κρεμμυδιού. Αν και το συνολικό μήκος του γενετικού χάρτη ήταν πολύ μικρό συγκριτικά με το μέγεθος του γονιδιώματος του κρεμμυδιού, ο γενετικός μας χάρτης υψηλής ανάλυσης όχι μόνο θα πρέπει να είναι χρήσιμος για ακριβή και αξιόπιστη χαρτογράφηση για QTL, αλλά έχει επίσης σημαντική σημασία αναφοράς για τη συναρμολόγηση γονιδιώματος κρεμμυδιού DH-17. Ωστόσο, η χρωμοσωμική ταυτότητα των LGs δεν έχει γίνει ακόμη γνωστή σε αυτήν τη μελέτη, θα προσπαθήσουμε να κατασκευάσουμε έναν δείκτη αντιστοίχισης φυσικών χρωμοσωμάτων με βάση το μεταγραφικό δείκτη unigene (Fujito et al., 2021) ή να πραγματοποιήσουμε συναρμολόγηση γονιδιώματος DH-17 κρεμμυδιού για να επιλύσουμε αυτό θέμα σε μελλοντικές εργασίες. ο χάρτης σύνδεσης που κατασκευάστηκε στη μελέτη μας έχει την υψηλότερη ποιότητα και ανάλυση μεταξύ των χαρτών σύνδεσης κρεμμυδιού. Αν και το συνολικό μήκος του γενετικού χάρτη ήταν πολύ μικρό συγκριτικά με το μέγεθος του γονιδιώματος του κρεμμυδιού, ο γενετικός μας χάρτης υψηλής ανάλυσης όχι μόνο θα πρέπει να είναι χρήσιμος για ακριβή και αξιόπιστη χαρτογράφηση για QTL, αλλά έχει επίσης σημαντική σημασία αναφοράς για τη συναρμολόγηση γονιδιώματος κρεμμυδιού DH-17. Ωστόσο, η χρωμοσωμική ταυτότητα των LGs δεν έχει γίνει ακόμη γνωστή σε αυτήν τη μελέτη, θα προσπαθήσουμε να κατασκευάσουμε έναν δείκτη αντιστοίχισης φυσικών χρωμοσωμάτων με βάση το μεταγραφικό δείκτη unigene (Fujito et al., 2021) ή να πραγματοποιήσουμε συναρμολόγηση γονιδιώματος DH-17 κρεμμυδιού για να επιλύσουμε αυτό θέμα σε μελλοντικές εργασίες. ο χάρτης σύνδεσης που κατασκευάστηκε στη μελέτη μας έχει την υψηλότερη ποιότητα και ανάλυση μεταξύ των χαρτών σύνδεσης κρεμμυδιού. Αν και το συνολικό μήκος του γενετικού χάρτη ήταν πολύ μικρό συγκριτικά με το μέγεθος του γονιδιώματος του κρεμμυδιού, ο γενετικός μας χάρτης υψηλής ανάλυσης όχι μόνο θα πρέπει να είναι χρήσιμος για ακριβή και αξιόπιστη χαρτογράφηση για QTL, αλλά έχει επίσης σημαντική σημασία αναφοράς για τη συναρμολόγηση γονιδιώματος κρεμμυδιού DH-17. Ωστόσο, η χρωμοσωμική ταυτότητα των LGs δεν έχει γίνει ακόμη γνωστή σε αυτήν τη μελέτη, θα προσπαθήσουμε να κατασκευάσουμε έναν δείκτη αντιστοίχισης φυσικών χρωμοσωμάτων με βάση το μεταγραφικό δείκτη unigene (Fujito et al., 2021) ή να πραγματοποιήσουμε συναρμολόγηση γονιδιώματος DH-17 κρεμμυδιού για να επιλύσουμε αυτό θέμα σε μελλοντικές εργασίες. Ο υψηλής ανάλυσης γενετικός μας χάρτης όχι μόνο θα πρέπει να είναι χρήσιμος για ακριβή και αξιόπιστη χαρτογράφηση για QTL, αλλά έχει επίσης σημαντική σημασία αναφοράς για τη συναρμολόγηση γονιδιώματος DH-17 κρεμμυδιού. Ωστόσο, η χρωμοσωμική ταυτότητα των LGs δεν έχει γίνει ακόμη γνωστή σε αυτήν τη μελέτη, θα προσπαθήσουμε να κατασκευάσουμε έναν δείκτη αντιστοίχισης φυσικών χρωμοσωμάτων με βάση το μεταγραφικό δείκτη unigene (Fujito et al., 2021) ή να πραγματοποιήσουμε συναρμολόγηση γονιδιώματος DH-17 κρεμμυδιού για να επιλύσουμε αυτό θέμα σε μελλοντικές εργασίες. Ο υψηλής ανάλυσης γενετικός μας χάρτης όχι μόνο θα πρέπει να είναι χρήσιμος για ακριβή και αξιόπιστη χαρτογράφηση για QTL, αλλά έχει επίσης σημαντική σημασία αναφοράς για τη συναρμολόγηση γονιδιώματος DH-17 κρεμμυδιού. Ωστόσο, η χρωμοσωμική ταυτότητα των LGs δεν έχει γίνει ακόμη γνωστή σε αυτήν τη μελέτη, θα προσπαθήσουμε να κατασκευάσουμε έναν δείκτη αντιστοίχισης φυσικών χρωμοσωμάτων με βάση το μεταγραφικό δείκτη unigene (Fujito et al., 2021) ή να πραγματοποιήσουμε συναρμολόγηση γονιδιώματος DH-17 κρεμμυδιού για να επιλύσουμε αυτό θέμα σε μελλοντικές εργασίες.

Επιπτώσεις για τον κυτταροπλασματικό δείκτη ανδρικής γονιμότητας κρεμμυδιού

Επειδή το κρεμμύδι είναι ένα διετές φυτό με μακρύ κύκλο αναπαραγωγής, είναι σημαντικό να αναπτυχθούν αποτελεσματικοί μοριακοί δείκτες για την αναγνώριση της γονιμότητας που μπορούν να χρησιμοποιηθούν κατά την πρακτική αναπαραγωγή του κρεμμυδιού. Η κυτταροπλασματική αρσενική στειρότητα (CMS), ένα μητρικά κληρονομικό χαρακτηριστικό που χαρακτηρίζεται από την αδυναμία παραγωγής βιώσιμων κόκκων γύρης σε ανώτερα φυτά, έχει εφαρμοστεί ευρέως για την παραγωγή υβριδικών σπόρων F1 σε αγρονομικές καλλιέργειες όπως το κρεμμύδι, το μπρόκολο, το λάχανο και το ραπανάκι. Havey, 2004· Bang et al., 2011). Υπάρχουν δύο κύριες πηγές συστημάτων CMS στο onion: CMS-S και CMS-T. Για το σύστημα CMS-S, η ανδρική γονιμότητα ελέγχεται από ένα μόνο πυρηνικό γονίδιο και έναν κυτταροπλασματικό παράγοντα (Jones and Clarke, 1943) και υπάρχουν τρεις τόποι που εμπλέκονται στην αποκατάσταση της γονιμότητας στο σύστημα CMS-T (Schweisguth, 1973). Επομένως, το CMS-S χρησιμοποιήθηκε ευρύτερα για υβριδικές ποικιλίες κρεμμυδιού λόγω της σταθερότητάς του σε διάφορα περιβάλλοντα (Havey, 1995; Havey, 2000). Μέχρι σήμερα, έχει γίνει πολλή έρευνα σε μοριακούς δείκτες για την αναγνώριση της γονιμότητας CMS-S που σχετίζονται με την αναπαραγωγή κρεμμυδιών (Sato, 1998· Engelke et al., 2003· Kim et al., 2009· Yang et al. , 2013· Huo et al., 2015).

Στη μελέτη μας, η γονιμότητα και η στειρότητα της γύρης του πληθυσμού F2 διαχωρίστηκαν σε αναλογία 3:1. Η αναλογία διαχωρισμού για τα άτομα MsM: Msms: msms που επισημαίνονται με συν-διαχωρισμένους δείκτες DNF-566 και DNS-357 (Yang et al., 2013) ήταν 1:2:1, κάτι που ήταν σύμφωνο με ένα Μεντελικό 3:1 αναλογία διαχωρισμού. Συμπτωματικά, μόνο ένας τόπος QTL (με υψηλότερες τιμές LOD και PVE, Σχήμα 3Β) που σχετίζεται με το αρσενικό γόνιμο χαρακτηριστικό εντοπίστηκε σε αυτόν τον γενετικό χάρτη, ο οποίος μπορεί να είναι το ίδιο qtl που χαρτογραφήθηκε από τους King et al. (1998). Συνοψίζοντας, μπορέσαμε να αναπαράγουμε τη χαρτογράφηση του QTL ανδρικής γονιμότητας κρεμμυδιού στον πληθυσμό μας F2, η οποία έδειξε την υψηλότερη ποιότητα του κατασκευασμένου χάρτη γενετικής μας σύνδεσης και, επομένως, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον αποτελεσματικό εντοπισμό νέων QTL για σημαντικά χαρακτηριστικά του κρεμμύδι.

Συνέπειες για την προκαταρκτική χαρτογράφηση της FSH QTL κρεμμυδιού

Το κατάλληλο ύψος φυτού είναι ένα σημαντικό αγρονομικό χαρακτηριστικό για τους ελίτ υβριδικούς σπόρους, ειδικά για τις καλλιέργειες με σιτηρά όπου το όργανο της κορυφαίας απόδοσης κόκκου (σπόρος) υποστηρίζεται από ένα μίσχο, όπως το σόργο, το ρύζι και το σιτάρι (Zhou et al., 2012; Li et. al., 2015· Jiang et al., 2017) και παίζει ζωτικό ρόλο στον σχηματισμό τελικής απόδοσης. Για το κρεμμύδι, η FSH επηρεάζει άμεσα την αντίσταση κατάθεσης και σχετίζεται στενά με την απόδοση και την ποιότητα των σπόρων. Σε αυτή τη μελέτη, τα διπλά απλοειδή DH-1 και DH-17 προέρχονταν από εμπορικά υβρίδια F1 και τα FSH τους ήταν χαμηλότερα από αυτά των αρχικών υβριδίων επαγωγής κατά περισσότερο από 30% (Εικόνα 1Ε). Το FSH των υβριδίων F1 που διασταυρώθηκε με το DH-1×DH-17 αποκαταστάθηκε σε αυτό των αρχικών υβριδίων και τα ύψη των υβριδίων ήταν εξαιρετικά ομοιόμορφα και συνεπή. Το φαινόμενο αυτό ανήκει στην κατηγορία της ετερότητας. Αφού λήφθηκε υπόψη η φαινοτυπική ανάλυση της FSH και των τεσσάρων QTL (που βρίσκονται σε LG2, LG5, LG8), μόνο το 26,60% της φαινοτυπικής παραλλαγής του πληθυσμού F2 μπορούσε να εξηγηθεί (Πίνακας 3). Σύμφωνα με αυτό το αποτέλεσμα, οι Baldwin et al. (2014) αποκάλυψε περιοχές γονιδιώματος σε τρία χρωμοσώματα που σχετίζονται με βιδώσεις χρησιμοποιώντας έναν χάρτη σύνδεσης χαμηλής πυκνότητας. Συμπεράσαμε ότι το ύψος του μίσχου του λουλουδιού κρεμμυδιού μπορεί να ελέγχεται από ένα φαινόμενο ετερογένεσης μεταξύ πολλαπλών γονιδίων νάνων. Η ανάλυση των αποτελεσματικών FAV της FSH κρεμμυδιού έδειξε ότι η γενετική ουσία της ετέρωσης μπορεί να είναι η συνολική επίδραση διαφόρων γονιδίων που περιέχουν ένα αποτέλεσμα κυριαρχίας, αθροιστικό αποτέλεσμα, επιστατικό αποτέλεσμα, συμπληρωματικό και υπερκυριαρχικό αποτέλεσμα και αποτέλεσμα αλληλεπίδρασης που ποικίλλει ανάλογα με διάφορα χαρακτηριστικά ή γονίδια. Το 60% της φαινοτυπικής παραλλαγής του πληθυσμού F2 θα μπορούσε να εξηγηθεί (Πίνακας 3). Σύμφωνα με αυτό το αποτέλεσμα, οι Baldwin et al. (2014) αποκάλυψε περιοχές γονιδιώματος σε τρία χρωμοσώματα που σχετίζονται με βιδώσεις χρησιμοποιώντας έναν χάρτη σύνδεσης χαμηλής πυκνότητας. Συμπεράσαμε ότι το ύψος του μίσχου του λουλουδιού κρεμμυδιού μπορεί να ελέγχεται από ένα φαινόμενο ετερογένεσης μεταξύ πολλαπλών γονιδίων νάνων. Η ανάλυση των αποτελεσματικών FAV της FSH κρεμμυδιού έδειξε ότι η γενετική ουσία της ετέρωσης μπορεί να είναι η συνολική επίδραση διαφόρων γονιδίων που περιέχουν ένα αποτέλεσμα κυριαρχίας, αθροιστικό αποτέλεσμα, επιστατικό αποτέλεσμα, συμπληρωματικό και υπερκυριαρχικό αποτέλεσμα και αποτέλεσμα αλληλεπίδρασης που ποικίλλει ανάλογα με διάφορα χαρακτηριστικά ή γονίδια. Το 60% της φαινοτυπικής παραλλαγής του πληθυσμού F2 θα μπορούσε να εξηγηθεί (Πίνακας 3). Σύμφωνα με αυτό το αποτέλεσμα, οι Baldwin et al. (2014) αποκάλυψε περιοχές γονιδιώματος σε τρία χρωμοσώματα που σχετίζονται με βιδώσεις χρησιμοποιώντας έναν χάρτη σύνδεσης χαμηλής πυκνότητας. Συμπεράσαμε ότι το ύψος του μίσχου του λουλουδιού κρεμμυδιού μπορεί να ελέγχεται από ένα φαινόμενο ετερογένεσης μεταξύ πολλαπλών γονιδίων νάνων. Η ανάλυση των αποτελεσματικών FAV της FSH κρεμμυδιού έδειξε ότι η γενετική ουσία της ετέρωσης μπορεί να είναι η συνολική επίδραση διαφόρων γονιδίων που περιέχουν ένα αποτέλεσμα κυριαρχίας, αθροιστικό αποτέλεσμα, επιστατικό αποτέλεσμα, συμπληρωματικό και υπερκυριαρχικό αποτέλεσμα και αποτέλεσμα αλληλεπίδρασης που ποικίλλει ανάλογα με διάφορα χαρακτηριστικά ή γονίδια. (2014) αποκάλυψε περιοχές γονιδιώματος σε τρία χρωμοσώματα που σχετίζονται με βιδώσεις χρησιμοποιώντας έναν χάρτη σύνδεσης χαμηλής πυκνότητας. Συμπεράσαμε ότι το ύψος του μίσχου του λουλουδιού κρεμμυδιού μπορεί να ελέγχεται από ένα φαινόμενο ετερογένεσης μεταξύ πολλαπλών γονιδίων νάνων. Η ανάλυση των αποτελεσματικών FAV της FSH κρεμμυδιού έδειξε ότι η γενετική ουσία της ετέρωσης μπορεί να είναι η συνολική επίδραση διαφόρων γονιδίων που περιέχουν ένα αποτέλεσμα κυριαρχίας, αθροιστικό αποτέλεσμα, επιστατικό αποτέλεσμα, συμπληρωματικό και υπερκυριαρχικό αποτέλεσμα και αποτέλεσμα αλληλεπίδρασης που ποικίλλει ανάλογα με διάφορα χαρακτηριστικά ή γονίδια. (2014) αποκάλυψε περιοχές γονιδιώματος σε τρία χρωμοσώματα που σχετίζονται με βιδώσεις χρησιμοποιώντας έναν χάρτη σύνδεσης χαμηλής πυκνότητας. Συμπεράσαμε ότι το ύψος του μίσχου του λουλουδιού κρεμμυδιού μπορεί να ελέγχεται από ένα φαινόμενο ετερογένεσης μεταξύ πολλαπλών γονιδίων νάνων. Η ανάλυση των αποτελεσματικών FAV της FSH κρεμμυδιού έδειξε ότι η γενετική ουσία της ετέρωσης μπορεί να είναι η συνολική επίδραση διαφόρων γονιδίων που περιέχουν ένα αποτέλεσμα κυριαρχίας, αθροιστικό αποτέλεσμα, επιστατικό αποτέλεσμα, συμπληρωματικό και υπερκυριαρχικό αποτέλεσμα και αποτέλεσμα αλληλεπίδρασης που ποικίλλει ανάλογα με διάφορα χαρακτηριστικά ή γονίδια.

Με βάση τον γενετικό χάρτη υψηλής ανάλυσης που κατασκευάστηκε από γραμμές DH, πραγματοποιήσαμε χαρτογράφηση QTL για FSH. Οι συνέπειες είναι: (1) να προταθεί η υπόθεση της ετέρωσης της FSH στο κρεμμύδι. (2) για την ανάπτυξη δεικτών KASP για SNP ή γονίδια που σχετίζονται με την FSH, τα οποία θα θέσουν τα θεμέλια για την κατασκευή ενός συστήματος αναπαραγωγής υποβοηθούμενη από μοριακούς δείκτες και θα παρέχουν νέες γνώσεις για τους αναπτυξιακούς γενετικούς μηχανισμούς της FSH.

συμπέρασμα

Συμπερασματικά, η μελέτη μας παρείχε έναν γενετικό χάρτη υψηλής ανάλυσης που βασίζεται σε διπλές απλοειδείς γραμμές με SLAF-seq σε κρεμμύδι. Πραγματοποιήσαμε χαρτογράφηση QTL του αρσενικού γόνιμου χαρακτηριστικού κρεμμυδιού για να επαληθεύσουμε ότι ο γενετικός χάρτης είχε την υψηλότερη ποιότητα και θα μπορούσε να είναι αποτελεσματικός στον εντοπισμό νέων QTL για σημαντικά χαρακτηριστικά του κρεμμυδιού. Πραγματοποιήσαμε επίσης χαρτογράφηση QTL για το χαρακτηριστικό του ύψους του μίσχου λουλουδιών και 20 από τους 49 δείκτες SLAF (σε 3/4 QTL) θεωρήθηκαν αποτελεσματικοί δείκτες FAV, οι οποίοι ήταν κατάλληλοι για την ανάπτυξη δεικτών KASP για SNP ή γονίδια που σχετίζονται με το ύψος του μίσχου του λουλουδιού στο μελλοντικός. Αυτά τα ευρήματα θα έθεσαν τα θεμέλια για την κατασκευή ενός συστήματος αναπαραγωγής με τη βοήθεια μοριακών δεικτών και θα παρείχαν νέες γνώσεις σχετικά με τους αναπτυξιακούς γενετικούς μηχανισμούς του ύψους του μίσχου λουλουδιών στο κρεμμύδι.

Δήλωση διαθεσιμότητας δεδομένων

Τα σύνολα δεδομένων που παρουσιάζονται σε αυτή τη μελέτη μπορούν να βρεθούν σε διαδικτυακά αποθετήρια. Τα ονόματα του αποθετηρίου/των αποθετηρίων και οι αριθμοί πρόσβασης βρίσκονται στο άρθρο/Συμπληρωματικό Υλικό.

Συνεισφορές συγγραφέα

Οι YL και XW συνέλαβαν και σχεδίασαν την έρευνα. Ο YL πραγματοποίησε την κύρια ανάλυση δεδομένων, τη σύνταξη χειρογράφων και την αναθεώρηση. Οι XW, ZW και YH πραγματοποίησαν τα πειράματα. Οι BL και YH κατασκεύασαν τον πληθυσμό, συνέλεξαν φαινότυπους και SLAF-seq. Οι ZW, YY και YS πραγματοποίησαν τις εργασίες πεδίου. Όλοι οι συγγραφείς συνέβαλαν στο άρθρο και ενέκριναν την υποβληθείσα έκδοση.

Χρηματοδότηση

Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το China Agriculture Research System (CARS-24-A-10) και το Agricultural Science and Technology Innovation Project της SAAS (CXGC2022E08).

Σύγκρουση συμφερόντων

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη απουσία εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.

Σημείωση εκδότη

Όλοι οι ισχυρισμοί που εκφράζονται σε αυτό το άρθρο είναι αποκλειστικά εκείνοι των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραιτήτως αυτούς των συνδεδεμένων οργανισμών τους ή του εκδότη, των εκδοτών και των κριτικών. Οποιοδήποτε προϊόν μπορεί να αξιολογηθεί σε αυτό το άρθρο ή ισχυρισμός που μπορεί να προβληθεί από τον κατασκευαστή του, δεν είναι εγγυημένο ούτε εγκρίνεται από τον εκδότη.

Συμπληρωματικό υλικό

Το συμπληρωματικό υλικό για αυτό το άρθρο βρίσκεται στο διαδίκτυο στη διεύθυνση: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2023.1100691/full#suplementary-material

Διπλό απλοειδές (DH), αλληλουχία SLAF, Γενετικός χάρτης, ανάλυση QTL, κρεμμύδι