Νέες γνώσεις για τη λιγνίωση μέσω αναλύσεων δικτύου και πολλαπλών ομικών αναλύσεων Arogenate Dehydratase Knock-out Mutants στο Arabidopsis thaliana

• ¹ Institute of Biological Chemistry, Washington State University, Pullman, WA, Ηνωμένες Πολιτείες
• ² Διεύθυνση Earth and Biological Sciences, Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA, Ηνωμένες Πολιτείες
• ³ National Center for Genome Resources, Santa Fe, NM, Ηνωμένες Πολιτείες

Μελετήθηκαν πολλαπλά μεταλλαγμένα νοκ-άουτ (KO) arogenate dehydratase (ADT) Arabidopsis, με φαινότυπους που έχουν μεταβλητά επίπεδα λιγνίνης (έως και 70% περίπου μείωση), για να διερευνηθεί πώς οι διαφορικές μειώσεις στα ADT διαταράσσουν τη συνολική βιολογία των φυτικών συστημάτων. Διεξήχθησαν ολοκληρωμένες αναλύσεις “omics” (μεταβολικό, μεταγραφικό και πρωτεόμιο) άγριου τύπου (WT), μονής και πολλαπλών γραμμών ADT KO. Τα δεδομένα του μεταγραφώματος και του πρωτεώματος συμπτύχθηκαν σε δεδομένα γονιδιακής ορθολογίας (GO), με αυτό να επιτρέπει την ενζυματική αντίδραση και τις διασταυρούμενες συγκρίσεις μεταβολισμού για την αποκάλυψη κυρίαρχων ή πιθανών αντιδράσεων μεταβολικής βιοσύνθεσης που επηρεάζονται. Η ανάλυση δικτύου των ενζύμων –που συσχετίζονται σε μεγάλο βαθμό με τα επίπεδα λιγνίνης στελέχους– συνήγαγε τη συμμετοχή νέων υποτιθέμενων πρωτεϊνών ή διεργασιών που σχετίζονται με τη λιγνίνη. Αυτά περιελάμβαναν εκείνα που σχετίζονται με τα ριβοσώματα, το μάτισμα, τη μεταφορά mRNA, βιοσύνθεση αμινοακυλο tRNA και φωσφορυλίωση. Ενώ η προηγούμενη εργασία βοήθησε στην εξήγηση της ρύθμισης της βιοσύνθεσης λιγνίνης σε μεταγραφικό επίπεδο, τα δεδομένα μας εδώ παρέχουν υποστήριξη για μια νέα υπόθεση ότι υπάρχουν πρόσθετες διαδικασίες μετα-μεταγραφικού και μεταφραστικού επιπέδου που πρέπει να ληφθούν υπόψη. Αυτά τα ευρήματα αναμένεται να οδηγήσουν στην ανάπτυξη ακριβέστερων απεικονίσεων μοντέλων βιοσύνθεσης λιγνίνης/φαινυλοπροπανοειδούς in situ, με νέους πρωτεϊνικούς στόχους που προσδιορίζονται για περαιτέρω βιοχημική ανάλυση ή/και βιοτεχνική φυτών. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας την καθορισμένη από το KEGG λειτουργική κατηγοριοποίηση πρωτεομικών και μεταγραφικών αναλύσεων, εντοπίσαμε σημαντικές αλλαγές στο γλυκοσινολικό, α-λινολενικό οξύ, άζωτο, καροτενοειδές, αρωματικό αμινοξύ, φαινυλοπροπανοειδές και μεταβολικές οδούς που σχετίζονται με τη φωτοσύνθεση σε μεταλλάξεις ADT KO.

Εισαγωγή

Το αρογονικό είναι ένα σημαντικό σημείο διακλάδωσης είτε προς τυροσίνη (Tyr) είτε φαινυλαλανίνη (Phe) σε αγγειακά φυτά, των οποίων ο σχηματισμός από το αρογενικό (Agn) καταλύεται από την αρογονική αφυδρογονάση (ADH) και την αρογενική αφυδατάση (ADT), αντίστοιχα (Εικόνα 1). Το Phe που σχηματίζεται έτσι μπορεί στη συνέχεια να ενσωματωθεί είτε σε πρωτεΐνες είτε να χρησιμοποιηθεί μαζικά στο φαινυλοπροπανοειδές μονοπάτι για την παραγωγή λιγνινών, καθώς και άλλων σχετικών μεταβολιτών (π.χ. λιγνάνες, αλλυλ/προπενυλ φαινόλες, φλαβονοειδή, κουμαρίνες, ανθοκυανίνες) ανάλογα με το είδος. Σε προηγούμενες μελέτες μας, λήφθηκαν ομόζυγες απλές και πολλαπλές γραμμές Arabidopsis ADT knock-out (KO) με ομόλογες μεταλλάξεις εισαγωγής Τ-DNA, με τους πιο ακραίους φαινοτύπους να δείχνουν μείωση ~70% στην περιεκτικότητα σε λιγνίνη σε σύγκριση με άγριου τύπου (WT) φυτά (Corea et al., 2012a, b, c).

Σχήμα 1. Απλοποιημένες μεταβολικές οδοί που συνδέουν τη φωτοσύνθεση, τη στερέωση του άνθρακα και τη βιοσύνθεση λιγνίνης, καθώς και την τοποθέτηση της αφυδρατάσης του αρογενικού άλατος (ADT) μεταξύ των οδών chorismate-shikimate, αρωματικού αμινοξέος και φαινυλοπροπανοειδούς στα αγγειακά φυτικά συστήματα. Επιλεγμένοι μεταβολίτες απεικονίζονται μαζί με ένζυμα που απεικονίζονται με βέλη.

Διαφορικά μεταβαλλόμενα επίπεδα λιγνίνης όπως παραπάνω, που λαμβάνονται μέσω συστηματικής χειραγώγησης της 6μελούς οικογένειας γονιδίων Arabidopsis ADT (ADT1, At1g11790; ADT2, At3g07630; ADT3, At2g27820; ADT4, At3g4242560, At3g421AD20, At3g42500, ADT4, At3g442506, At3g421AD20, At3g442500, At3g442500; ευκαιρία να διερευνηθεί η ολιστική φύση τέτοιων διαταραχών στη συνολική βιολογία των συστημάτων Arabidopsis. Για να γίνει αυτό, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις πολλαπλών ωμικών (δηλαδή, μεταγραφική, πρωτεϊνομική και μεταβολομική) των ιστών φύλλων και στελέχους απλών (adt1, adt3, adt4, adt5 και adt6), διπλών, τριπλών και τετραπλών (adt4/5 , adt1/4/5, adt3/4/5 και adt3/4/5/6) μετάλλαξη KO και γραμμές WT, σε 4 εβδομάδες ανάπτυξης/ανάπτυξης.

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν στρατηγικές «κανονικοποίησης» πολλαπλών ωμικών για να καταστεί δυνατή η άμεση ενσωμάτωση και οπτικοποίηση των ανόμοιων συνόλων δεδομένων «omics» των σχετικών μεταγραφών, πρωτεϊνών και μεταβολιτών, επιτρέποντας έτσι μεγαλύτερη κατανόηση, εμπιστοσύνη και επικύρωση των συστημικών βιολογικών διαταραχών που παρατηρήθηκαν. Η ανάλυση δικτύου (Szklarczyk et al., 2015) χρησιμοποιήθηκε επίσης για (α) εντοπισμό ενζύμων ή διεργασιών που σχετίζονται περισσότερο με διαφορετικά επίπεδα λιγνίνης και (β) αποκάλυψη δυνητικά νέων ενζύμων ή διεργασιών που σχετίζονται με τη ρύθμιση και τη βιοσύνθεση των επιπέδων λιγνίνης. Αυτή η ανάλυση οδήγησε στην προσωρινή συναγωγή νέων μεταγραφικών, μετα-μεταγραφικών και μεταφραστικών ρυθμιστικών διαδικασιών, όταν η ροή άνθρακα μειώθηκε στην οδό του φαινυλοπροπανοειδούς και η οποία επηρέασε βαθιά την εναπόθεση λιγνίνης.

Πολλές πρωτεΐνες που εντοπίστηκαν στην ανάλυση του δικτύου μας δεν έχουν αναφερθεί ως δυνητικά συνδεδεμένες με τη ρύθμιση της βιοσύνθεσης λιγνίνης. Για παράδειγμα, εντοπίστηκαν αρκετές υπομονάδες ριβοσώματος με υψηλές συσχετίσεις με τα προφίλ επιπέδου λιγνίνης, υποδηλώνοντας την πιθανή παρουσία ενός «ριβοσώματος». Αυτές οι πρωτεΐνες, καθώς και άλλες πρωτεΐνες επεξεργασίας mRNA που αλληλεπιδρούν με ριβόσωμα που ανιχνεύθηκαν στην ανάλυση του δικτύου μας, υποδεικνύουν ότι τα επίπεδα λιγνίνης των αγγείων των φυτών δεν ελέγχονται μόνο στο σημείο της μεταγραφής αλλά συνεργάζονται με ρυθμιστικούς παράγοντες σε μετα-μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο, όπως περιγράφεται παρακάτω.

Υλικά και μέθοδοι

Χημικά

Για μεταβολομικές αναλύσεις, το νερό ποιότητας Optima ^ΤΜ , το ακετονιτρίλιο και το μυρμηκικό οξύ αγοράστηκαν από τη Fisher Scientific (Hampton, NH, Ηνωμένες Πολιτείες). Τα αυθεντικά πρότυπα που χρησιμοποιούνται για τη μεταβολομική του δευτερογενούς μεταβολίτη περιγράφονται στους Höhner et al. (2018). Για την παρασκευή δειγμάτων πρωτεομικής και RNA-Seq, χρησιμοποιήθηκε νανοκαθαρό νερό και όλα τα χημικά ελήφθησαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Ηνωμένες Πολιτείες) και ήταν αναλυτικής ποιότητας εκτός εάν σημειώνεται διαφορετικά.

Εισαγωγή Arabidopsis T-DNA Knock Out (KO).

Οι γραμμές εισαγωγής Τ-DNA του Arabidopsis thaliana WT (Columbia) ελήφθησαν από το Εργαστήριο Γονιδιωματικής Ανάλυσης του Ινστιτούτου Salk (SIGnAL) ¹ . Μεμονωμένες μεταλλαγμένες γραμμές ADT KO δημιουργήθηκαν σε ομόζυγη μορφή, με μεμονωμένες γραμμές διασταυρούμενες για να παράσχουν τελικά διπλά, τριπλά και τετραπλά ομόζυγα μεταλλάγματα ADT KO (Corea et al., 2012c).

Συνθήκες ανάπτυξης και συγκομιδής φυτών

Οι μεταλλαγμένες γραμμές A. thaliana WT (Columbia) και KO αναπτύχθηκαν σε θερμοκήπια του Ινστιτούτου Βιολογικής Χημείας (Washington State University) με κύκλο φωτός/σκότους 16/8 ωρών στους 27–28°C/24–26°C, αντίστοιχα. Λίπασμα με βάση το άζωτο (200 ppm) προστέθηκε πέντε φορές την εβδομάδα. Τα φυτά συλλέχθηκαν 4 εβδομάδες μετά τη φύτευση με ιστούς φύλλων ροζέτας και στελέχους που συλλέχθηκαν μεμονωμένα και καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό Ν2. Κάθε δείγμα αποθηκεύτηκε στους -80°C μέχρι περαιτέρω ανάλυση.

Παραγωγοποίηση Πρωτογενούς Μεταβολίτη

Εννέα μεμονωμένα φυτά από κάθε σειρά καταψύχθηκαν σε υγρό Ν2 και λυοφιλοποιήθηκαν. Οι ξηροί φυτικοί ιστοί αλέστηκαν σε λεπτές σκόνες χρησιμοποιώντας συσκευή λύσεως ιστών II (Qiagen, Γερμανία) για 30 δευτερόλεπτα σε συχνότητα 30 Hz στους -80°C. Κονισμένα λυοφιλοποιημένα φύλλα ή μίσχοι Arabidopsis (20 mg) εναιωρήθηκαν μεμονωμένα σε 500 μL μεθανόλης:2-ισο-προπανόλης:νερού (5:2:2, v/v/v). Μετά την προσθήκη ¹³Πρότυπο ριβιτόλης με επισήμανση C (1,5 μg), κάθε υλικό εκχυλίστηκε με στροβιλισμό για 10 λεπτά, ακολουθούμενο από υπερήχηση για 5 λεπτά. Τα εκχυλίσματα φυγοκεντρήθηκαν μεμονωμένα για 10 λεπτά στα 15.000 × g, με τα υπερκείμενα να μεταφέρονται σε ένα νέο φιαλίδιο και στη συνέχεια να ξηραίνονται υπό κενό. Τα ξηρά υπολείμματα επαναιωρήθηκαν μεμονωμένα σε νερό:ακετονιτρίλιο (500 μL, 1:1 v/v) και εκχυλίστηκαν εκ νέου με διαδοχική περιδίνηση και υπερήχηση, ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση στα 15.000 × g για 5 λεπτά με υπερκείμενα και στη συνέχεια αφαιρέθηκαν και ξηράνθηκαν κάτω από κενό. Τα ξηρά υπολείμματα εναιωρήθηκαν μεμονωμένα σε υδροχλωρική Ο-μεθοξυλαμίνη (40 mg mL ^-1σε πυριδίνη, 5 μL, Sigma) και επωάστηκε για 90 λεπτά στους 30°C στις 1.000 rpm (Eppendorf Thermomixer). Στη συνέχεια, τα δείγματα παραγωγοποιήθηκαν μεμονωμένα με MSTFA (45 μL) με 1% TMCS (Thermo-Pierce) για 30 λεπτά στους 37°C και 1.000 rpm (Eppendorf Thermomixer).

Ανάλυση Πρωτογενούς Μεταβολίτη με χρήση Αέριας Χρωματογραφίας Φασματομετρίας Μάζας Χρόνου Πτήσης

Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας φασματόμετρο μάζας χρόνου πτήσης Pegasus 4D (LECO) εξοπλισμένο με αυτόματο δειγματολήπτη Gerstel MPS2 και φούρνο Agilent 7890A. Τα προϊόντα παραγωγοποίησης διαχωρίστηκαν σε στήλη Rxi ^® -5Sil (30 m × 0,25 mm id × 0,25 μm) με μια προ-στήλη IntegraGuard® χρησιμοποιώντας υπερκαθαρό He σε σταθερή ροή 1 mL min ^{–1 ως} φέρον αέριο. Η γραμμική θερμική κλίση ξεκίνησε με 1 λεπτό στους 50°C, ακολουθούμενη από ράμπα στους 330°C στους 20°C min ^–1 . Η τελική θερμοκρασία διατηρήθηκε για 5 λεπτά πριν από την επιστροφή στις αρχικές συνθήκες και τα φάσματα μάζας συλλέχθηκαν στα 17 φάσματα s ^–1 . Η θυρίδα έγχυσης διατηρήθηκε στους 250°C και εγχύθηκε ένα κλάσμα του δείγματος (1 μL).

Επεξεργασία δεδομένων GC-MS

Ο σχολιασμός κορυφής χρησιμοποίησε τη βιβλιοθήκη πρωτογενών μεταβολιτών Fiehn (Kind et al., 2009), όπου χρησιμοποιήθηκε αποκοπή βαθμολογίας ταυτότητας 600. Η ευθυγράμμιση κορυφής και οι συγκρίσεις φασμάτων μάζας πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δυνατότητα Statistical Compare του λογισμικού ChromaTOF® ⁽ LECO). Το υποκατάστατο πρότυπο ριβιτόλης ¹³ C και το αρχικό βάρος ιστού χρησιμοποιήθηκαν για κανονικοποίηση.

Δευτερεύουσα μεταβολομική ανάλυση με χρήση φασματομετρίας μάζας χρόνου πτήσης υγρής χρωματογραφίας

Οι μεταβολίτες εξήχθησαν από λυοφιλοποιημένο υλικό από κάθε μεμονωμένο φυτικό ιστό (10 mg) όπως περιγράφεται (Lu et al., 2017) σε 200 μL μεθανόλης:νερού (70:30, v/v) που περιέχει ναρινγενίνη (Aldrich) ως εσωτερικό πρότυπο. Τα δείγματα στροβιλίστηκαν, υποβλήθηκαν σε υπερήχους για 10 λεπτά και τελικά φυγοκεντρήθηκαν στα 14.000 × g στους 4°C για 15 λεπτά. Τα υπερκείμενα αποθηκεύτηκαν ξεχωριστά στους -80°C μέχρι την ανάλυση.

Τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Waters Acquity ^TMΣύστημα LC Ultra Performance όπως περιγράφεται στους Lu et al. (2017) με τις ακόλουθες τροποποιήσεις: Η υγρή χρωματογραφία πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας στήλη UPLC BEH C18 (Νερά) 100 × 2,1 mm id (μέγεθος σωματιδίων 1,7 μm). Μάζες εκλουόμενων ενώσεων ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας μια πηγή ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (ESI) στον τρόπο λειτουργίας αρνητικών ιόντων με τριχοειδή τάση στα 2,2 kV. τάση κώνου στα 20 eV. ενέργεια σύγκρουσης στα 6 eV και στα 30 eV. Τα χρωματογράμματα και τα φάσματα επιθεωρήθηκαν και προσδιορίστηκαν αρχεία ακατέργαστων δεδομένων και αντιστοιχίσεις μεταβολιτών όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Lu et al., 2017). Πριν από τη στατιστική ανάλυση, τα αποτελέσματα ολοκλήρωσης χαρακτηριστικών κανονικοποιήθηκαν σε ναρινγενίνη εσωτερικού προτύπου (M271T1197_1, χρόνος κατακράτησης 1197 s και m/z (μέσος όρος) 271,0609 και υπολογίστηκαν 271,0606, για C15H11O5). Πολλοί μεταβολίτες αναγνωρίστηκαν ξεκάθαρα σε σύγκριση με τους χρόνους κατακράτησης, Φάσματα UV και μοτίβα κατακερματισμού MS/MS αυθεντικών τυπικών ενώσεων. Άλλοι μεταβολίτες υποτίθεται ότι σχολιάστηκαν με βάση την ακριβή μάζα, την αναγνώριση ισοτοπικού σχεδίου και τα φάσματα MS/MS. Αυτά αναζητήθηκαν τόσο στη βιβλιογραφία όσο και στις βάσεις δεδομένων φάσματος μάζας που είναι διαθέσιμες στο κοινό [π.χ. Metlin, Respect² , Massbank ³ και HMDB ⁴ ].

Εκχύλιση RNA και Ανάλυση HiSeq Illumina

Για κάθε δείγμα, κατεψυγμένο υγρό άζωτο δείγμα ιστού (100 mg) αλέστηκε χρησιμοποιώντας γουδί και γουδοχέρι που ψύχθηκε παρουσία υγρού αζώτου. Ένα Spectrum ^TMΤο κιτ Ολικού RNA φυτών (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Ηνωμένες Πολιτείες) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο ποιοτικός έλεγχος πραγματοποιήθηκε σε ένα Thermo Scientific NanoDrop με όλες τις μετρήσεις 260/280 nm και 260/230 nm πάνω από 1,8. Οι βιβλιοθήκες RNA TruSeq της Illumina κατασκευάστηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, με την ποιότητα να αξιολογείται χρησιμοποιώντας τον Agilent Bioanalyzer. Η αλληλουχία των δειγμάτων έγινε σε ένα όργανο HiSeq 2000 (Illumina, San Diego, CA, Ηνωμένες Πολιτείες). Έξι λωρίδες πολυπλεξήθηκαν με πέντε δείγματα ανά λωρίδα στη διαμόρφωση ενός άκρου, 50 bp. Λήφθηκε ένας μέσος όρος φίλτρων ποιότητας διέλευσης 41 Μ αναγνώσεων για κάθε δείγμα (ελάχ. 31 Μ, μέγ. 50 Μ). Η δημιουργία συμπλέγματος χρησιμοποίησε το κιτ cBot SR Cluster Gen (V3) και το κελί ροής που χρησιμοποιήθηκε ήταν SR FC Information (V3).

Εργασία δεδομένων RNA-Seq

CyVerse (πρώην iPlant Collaborative) ⁵(Goff et al., 2011), χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση και αξιολόγηση των δεδομένων HiSeq. Μόλις όλα τα αρχεία FASTQ που παράγονται από την αλληλουχία Illumina μεταφορτώθηκαν στο Discovery Environment (DE), η εφαρμογή TopHat2-SE, η οποία περιλάμβανε TopHat 2.0.9 και Bowtie 2.1.0, χρησιμοποιήθηκε για την ευθυγράμμιση των αναγνώσεων RNA-Seq με το A. γονιδίωμα thaliana TAIR10 χρησιμοποιώντας τον ευθυγραμμιστή σύντομης ανάγνωσης Bowtie, ο οποίος είναι ικανός να αναλύει τα αποτελέσματα της χαρτογράφησης για να εντοπίσει συνδέσεις ματίσματος μεταξύ εξονίων. Το γονιδίωμα αναφοράς και οι σχολιασμοί αναφοράς χρησιμοποιούσαν το γονιδίωμα A. thaliana TAIR10 (A. thaliana Ensembl 19). Χρησιμοποιήθηκαν προεπιλεγμένες επιλογές ανάλυσης με εξαίρεση την κλίμακα ποιότητας FASTQ της Illumina 1.3-1.8 (PHRED64). Μήκος άγκυρας: 8; Μέγιστος αριθμός αναντιστοιχιών που μπορούν να εμφανιστούν στην περιοχή αγκύρωσης της ματισμένης ευθυγράμμισης: 0; Το ελάχιστο μήκος εσωνίου: 70; το μέγιστο μήκος εσωνίου: 50000; Ελάχιστο κλάσμα ισομορφής: 0,15; Μέγιστος αριθμός ευθυγραμμίσεων που επιτρέπονται: 20; Ελάχιστο μήκος ιντρονίου που μπορεί να βρεθεί κατά την αναζήτηση διαχωρισμένου τμήματος (προεπιλογή): 50; Μέγιστο μήκος ιντρονίου που μπορεί να βρεθεί κατά την αναζήτηση διαχωρισμένου τμήματος (προεπιλογή): 500000; Αριθμός αναντιστοιχιών που επιτρέπονται σε κάθε στοίχιση τμήματος για αναγνώσεις που αντιστοιχίζονται ανεξάρτητα: 2; Ελάχιστο μήκος τμημάτων ανάγνωσης: 20. Στη συνέχεια, το Cufflinks2 (μια διεπαφή για Cufflinks έκδοση 2.1.1) που βρίσκεται στο DE του CyVerse χρησιμοποιήθηκε για τη σύνδεση σύντομων ευθυγραμμίσεων RNA-Seq ανάγνωσης που βρέθηκαν από την ανάλυση TopHat με τους σχολιασμούς αναφοράς από το γονιδίωμα TAIR10 . Τα μανικετόκουμπα εντόπισαν αλληλουχίες που δεν ευθυγραμμίζονται με το σχολιασμένο γονιδίωμα και τις επισήμαναν με νέα αναγνωριστικά. Οι προεπιλεγμένες ρυθμίσεις χρησιμοποιήθηκαν στα Μανικετόκουμπα. Αυτές οι παράμετροι περιελάμβαναν επιλογές εκτίμησης αφθονίας των: Αριθμός σπουδαιότητας για τα δείγματα που δημιουργούνται για κάθε τόπο: 1000; Αριθμός επαναλήψεων που επιτρέπονται κατά τη διάρκεια MLE (εκτιμήσεις μέγιστης πιθανότητας) αφθονιών: 5000; Πρόθεμα για μεταγραφές σε αναφερόμενο GTF (Γενική μορφή μεταφοράς): Περιχειρίδα. Ελάχιστο κλάσμα ισομορφής: 0,1; Κλάσμα προ-mRNA: 0,1; Μέγιστο μήκος εσωνίου: 300000; Τιμή άλφα για τη διωνυμική δοκιμή που χρησιμοποιήθηκε κατά τη διήθηση με ψευδώς θετική ευθυγράμμιση: 0,001; Μικρό κλάσμα άγκυρας: 0,09; Ελάχιστα θραύσματα ανά transfrag: 10; Ο αριθμός των bp που επιτρέπεται να εισαχθεί στο εσώνιο μιας μεταγραφής κατά τον προσδιορισμό εάν μια ανάγνωση ή μια άλλη μεταγραφή μπορεί να χαρτογραφηθεί με αυτό: 8; Μέγιστο επιτρεπόμενο γονιδιωματικό μήκος για μια δεδομένη δέσμη: 3500000; Ελάχιστο μήκος ιντρονίου: 50; Ελάχιστη μέση κάλυψη που απαιτείται για την προσπάθεια κοπής 3′: 10; Το κλάσμα της μέσης κάλυψης κάτω από το οποίο πρέπει να κοπεί το 3′ άκρο μιας συναρμολογημένης μεταγραφής: 0,1.

Εκχύλιση και Πέψη Πρωτεϊνών

Παγωμένο 0,1 Μ οξικό αμμώνιο σε μεθανόλη (10 mL) και β-μερκαπτοαιθανόλη (250 μL) προστέθηκαν σε κάθε κονιοποιημένο δείγμα σκόνης (αλεσμένο σε υγρό άζωτο σε γουδί και γουδοχέρι) ακολουθούμενη από έντονη ανακίνηση για 15 δευτερόλεπτα. Για ιστούς στελέχους, χρησιμοποιήθηκε ομογενοποιητής Polytron για περίπου 30 δευτερόλεπτα με ταχύτητα 30 για περαιτέρω ομογενοποίησή τους. Τα δείγματα τοποθετήθηκαν μεμονωμένα σε καταψύκτη στους -20°C για 2 ώρες και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στα 5000 × g στους 4°C. Κάθε υπερκείμενο στη συνέχεια αφαιρέθηκε και απορρίφθηκε. Η παραπάνω προσθήκη διαλύματος οξικού αμμωνίου/μεθανόλης και τα στάδια φυγοκέντρησης επαναλήφθηκαν άλλες τέσσερις φορές για να απομακρυνθούν οι μεταβολίτες και τα λιπίδια από κάθε δείγμα. Η περίσσεια μεθανόλης απομακρύνθηκε με ξήρανση των σφαιριδίων ήπια υπό ροή αζώτου για περίπου 2 λεπτά. Διάλυμα διαλυτοποίησης πρωτεϊνών που περιέχει 7 M ουρία, 2 M θειουρία, 4% CHAPS και 5 mM εξουδετερωμένης τρις(2-καρβοξυαιθυλ)φωσφίνης (TCEP) (Bond-Breaker, Thermo Fisher, San Jose, CA, Ηνωμένες Πολιτείες) προστέθηκαν σε κάθε δείγμα για να καλύψει πλήρως κάθε σφαιρίδιο, συν 500 μL επιπλέον. Τα δείγματα στη συνέχεια επωάστηκαν μεμονωμένα στους 4°C όλη τη νύχτα. Τα συντρίμμια από το καθένα αναμίχθηκαν φυσικά σε διάλυμα με ένα άκρο πιπέτας και ο πολτός υποβλήθηκε σε υπερήχους σε επεξεργαστή υπερήχων Hielscher UTR200 για 10-20 δευτερόλεπτα σε πλάτος 100%. Οι ιλύς πρωτεΐνης στη συνέχεια επωάστηκαν ξεχωριστά στους 60°C για 30 λεπτά, με τα δείγματα να στροβιλίζονται και να υποβάλλονται σε υπερήχους στον υπερηχητικό αντιδραστήρα ξανά για περίπου 30 δευτερόλεπτα. Κάθε δείγμα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στα 5000 x g στους 4°C. Μια δοκιμασία πρωτεΐνης Coomassie Plus (Pierce, Rockford, IL, Ηνωμένες Πολιτείες), χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο λευκωματίνης ορού βοοειδών (BSA), διεξήχθη στη συνέχεια σε μεμονωμένα υπερκείμενα για την εκτίμηση των περιεχομένων πρωτεΐνης. Μετά, μετουσιωμένα δείγματα αραιώθηκαν δεκαπλάσια με 50 mM διττανθρακικό αμμώνιο (ρΗ 8,0). Προστέθηκε CaCl2 σε συγκέντρωση 2 mM και θρυψίνη (Affymetrix, Santa Clara, CA, Ηνωμένες Πολιτείες) σε αναλογία θρυψίνης:δείγματος 1:50 (β/β). Τα δείγματα υπέστησαν πέψη μεμονωμένα όλη τη νύχτα στους 37°C και στη συνέχεια αλκυλιώθηκαν με χλωροακεταμίδιο σε συγκέντρωση 5 mM στο σκοτάδι στους 37°C για 30 λεπτά. Τα πεπτίδια από κάθε κατεργασία αφαλατώθηκαν με ένα SCX SPE (SUPELCO Supelclean) χρησιμοποιώντας 10 mM μυρμηκικό αμμώνιο (ρΗ 3,0), 25% ακετονιτρίλιο (v/v) σε νερό, για να αφαιρεθούν τα CHAPS, και στη συνέχεια ένα 80:15:5 (v/ ν/ν) μεθανόλη:νερό:υδροξείδιο αμμωνίου (14,8 Μ) χρησιμοποιήθηκε για την έκλουση πεπτιδίων. Οι στήλες C-18 SPE (SUPELCO Discovery) χρησιμοποιήθηκαν για την απομάκρυνση των αλάτων αμμωνίου, χρησιμοποιώντας ένα 0,1% TFA (v/v) σε νανοκαθαρό νερό για την έκπλυση των πεπτιδίων και ένα 80:20 (v/v) ακετονιτρίλιο:νερό με 0. 1% (ν/ν) διαλύτης TFA για έκλουση πεπτιδίων. Τα πεπτίδια ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία BCA (Pierce, Rockford, IL, Ηνωμένες Πολιτείες) με ένα πρότυπο BSA.

Επισήμανση πεπτιδίου iTRAQ

Τα πεπτίδια επισημάνθηκαν με αντιδραστήρια 8-plex iTRAQ (AB Sciex, Redwood City, CA, Ηνωμένες Πολιτείες): Κάθε δείγμα πεπτιδίου (30 μg) τοποθετήθηκε σε νέο σωλήνα και στέγνωσε. Ρυθμιστικό διάλυμα διάλυσης (κιτ ρυθμιστικού διαλύματος iTRAQ, 13 μL) προστέθηκε σε κάθε δείγμα. Το αντιδραστήριο iTRAQ (10 μL) αραιώθηκε περαιτέρω με ισοπροπανόλη (35 μL) και αυτή προστέθηκε σε κάθε δείγμα. Κάθε αντίδραση διεξήχθη σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες, με 50 mM διττανθρακικό αμμώνιο (200 μL) που προστέθηκαν για να σβήσει κάθε αντίδραση. Μετά από 1 ώρα, τα περιεχόμενα από όλες τις αντιδράσεις καναλιού iTRAQ προστέθηκαν σε έναν σωλήνα και στη συνέχεια το δείγμα στροβιλίστηκε και στέγνωσε σε φυγοκεντρικό συμπυκνωτή κενού.

Κλασματοποίηση πεπτιδίων εκτός σύνδεσης και Παρασκευή δειγμάτων πρωτεώματος

Τα επισημασμένα πεπτίδια διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας διαχωρισμό αντίστροφης φάσης (RP) εκτός γραμμής υψηλού pH (pH 10) με στήλη Waters XBridge C18 (250 mm × 4,6 mm id, 5 μm μέγεθος σωματιδίων) και προστατευτική στήλη (4,6 mm × 20). mm) χρησιμοποιώντας σύστημα Agilent 1200 HPLC. Κάθε δείγμα που φορτώθηκε στη στήλη C18 πλύθηκε για 15 λεπτά με Διαλύτη Α [10 mM μυρμηκικό αμμώνιο, ρυθμισμένο σε ρΗ 10 με υδροξείδιο του αμμωνίου (14,8 Μ)]. Η βαθμίδα ξεκίνησε με μια γραμμική αύξηση 0% Διαλύτης Β [10 mM μυρμηκικό αμμώνιο, pH 10, ακετονιτρίλιο:νερό (90:10 v/v)] σε: 5% Διαλύτης Β σε 10 λεπτά, 45% Διαλύτης Β σε 65 λεπτά και στη συνέχεια σε 100% Διαλύτη Β σε 15 λεπτά. Ο διαλύτης Β διατηρήθηκε στο 100% για 10 λεπτά, και στη συνέχεια αυτό άλλαξε σε 100% Διαλύτης Α, διατηρώντας αυτό για 20 λεπτά για την αποκατάσταση της στήλης. Ο ρυθμός ροής ήταν 0,5 mL min ^–1. Συνολικά 48 κλάσματα συλλέχθηκαν για κάθε δείγμα σε μια πλάκα 96 φρεατίων σε όλη την παραπάνω βαθμίδωση LC. Τα κλάσματα RP με υψηλό pH στη συνέχεια συνδυάστηκαν σε 12 κλάσματα χρησιμοποιώντας τη στρατηγική συνένωσης που αναφέρθηκε προηγουμένως (Wang et al., 2011). Τα πεπτιδικά κλάσματα ξηράνθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε νανοκαθαρό νερό σε συγκέντρωση 75 ng μL ^-1 για ανάλυση φασματομετρίας μάζας χρησιμοποιώντας ένα σύστημα LTQ-Orbitrap Velos MS (Thermo Scientific) όπως περιγράφεται παρακάτω.

Ανάλυση δειγμάτων πεπτιδίων με βάση τη φασματομετρία μάζας

Το σύστημα LC κατασκευάστηκε κατά παραγγελία χρησιμοποιώντας δύο αντλίες νανοροής Agilent 1200 και μια αντλία με καπάκι Agilent 1200 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Ηνωμένες Πολιτείες), διάφορες βαλβίδες Valco (Valco Instruments Co., Houston, TX, Ηνωμένες Πολιτείες) και μια Αυτόματη δειγματοληψία PAL (Leap Technologies, Carrboro, NC, Ηνωμένες Πολιτείες). Ο πλήρης αυτοματισμός έγινε εφικτός από προσαρμοσμένο λογισμικό που επιτρέπει τον παράλληλο συντονισμό συμβάντων και επομένως κοντά στο 100% του κύκλου εργασίας MS μέσω της χρήσης δύο στηλών παγίδευσης και ανάλυσης. Οι στήλες αντίστροφης φάσης παρασκευάστηκαν εσωτερικά με συσκευασία πολτού 3 μm Jupiter C18 (Phenomenex, Torrance, CA, Ηνωμένες Πολιτείες) σε 40 cm × 360 μm από × 75 μm id τηγμένου πυριτίου (Polymicro Technologies Inc., Phoenix, AZ, United States, AZ, πολιτείες) χρησιμοποιώντας κολλοειδές πήκτωμα 1 cm για συγκράτηση μέσων (Maiolica et al., 2005). Οι στήλες παγίδευσης παρασκευάστηκαν με παρόμοιο τρόπο με τη συσσώρευση πολτού 5-μm Jupiter C18 σε ένα μήκους 4 cm 150 μm id συντηγμένου πυριτίου και τήγματος και στα δύο άκρα. Οι κινητές φάσεις αποτελούνταν από 0,1% μυρμηκικό οξύ σε νερό (Α) και 0,1% μυρμηκικό οξύ σε ακετονιτρίλιο (Β) που λειτουργούσαν στα 300 nL^–1 λεπτό με γραμμικό προφίλ κλίσης ως εξής (min:%B): 0:5, 2:8, 20:12, 75:35, 97:60, 100: 85. Οι ενέσεις δειγμάτων (5 μL) παγιδεύτηκαν και πλύθηκε στις στήλες παγίδευσης στα 3 μL min ^–1 για 20 λεπτά πριν από την ευθυγράμμιση με τις αναλυτικές στήλες. Η απόκτηση δεδομένων καθυστέρησε τους χρόνους έναρξης και λήξης της κλίσης κατά 15 λεπτά για να ληφθεί υπόψη ο νεκρός όγκος στήλης που επέτρεψε τη στενότερη δυνατή επικάλυψη σε μια λειτουργία δύο στηλών. Η λειτουργία δύο στηλών επέτρεψε επίσης στις στήλες να “πλυθούν” (μικρές κλίσεις) και να αναδημιουργηθούν εκτός σύνδεσης χωρίς κόστος για τον κύκλο λειτουργίας.

Το φασματόμετρο μάζας LTQ Orbitrap Velos λειτουργούσε σε λειτουργία εξαρτώμενη από δεδομένα αποκτώντας σαρώσεις σύγκρουσης υψηλότερης ενέργειας (HCD) (R = 7.500, 5 × 104 ιόντα στόχου) μετά από κάθε πλήρη σάρωση MS (R = 30.000, 3 × 106 ιόντα στόχου ) για τα δέκα κορυφαία ιόντα με τη μεγαλύτερη αφθονία εντός του εύρους μάζας από 300 έως 1.800 m/z. Ένα παράθυρο απομόνωσης 2,5 μονάδων Thomson (Th) χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση ιόντων πριν από την HCD. Όλες οι σαρώσεις HCD χρησιμοποιούσαν κανονικοποιημένη ενέργεια σύγκρουσης 45 και μέγιστο χρόνο έγχυσης 1000 ms. Ο δυναμικός χρόνος αποκλεισμού ορίστηκε στα 60 δευτερόλεπτα και η εξέταση κατάστασης φόρτισης ενεργοποιήθηκε για την απόρριψη μη εκχωρημένων και μεμονωμένα φορτισμένων ιόντων.

Ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση πεπτιδίων

Για την ταυτοποίηση πεπτιδίων, τα φάσματα MS/MS αναζητήθηκαν έναντι μιας πρωτεΐνης δόλωμα A. thaliana TAIR10 ⁶βάση δεδομένων χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο SEQUEST (Eng et al., 1994). Οι παράμετροι αναζήτησης περιελάμβαναν: καμία εξειδίκευση ενζύμου για δεδομένα πρωτεώματος και εξειδίκευση ενζύμου θρυψίνης με μέγιστο δύο χαμένες σχισμές, ±50 ppm ανοχή μάζας πρόδρομων ουσιών, ανοχή μάζας προϊόντος ±0,05 Da και καρβαμιδομεθυλίωση κυστεϊνών και επισήμανση iTRAQ των λυσινών και του πεπτιδίου N-ter ως σταθερές τροποποιήσεις. Επιτρεπόμενες μεταβλητές τροποποιήσεις ήταν η οξείδωση της μεθειονίνης και της προλίνης. Οι τιμές πιθανότητας φασμάτων MS-GF (Kim et al., 2008) υπολογίστηκαν επίσης για πεπτίδια που ταυτοποιήθηκαν από τις αναζητήσεις SEQUEST. Η μετρημένη ακρίβεια μάζας και η πιθανότητα φασμάτων MS-GF χρησιμοποιήθηκαν για το φιλτράρισμα των αναγνωρισμένων πεπτιδίων σε lt;0,4% ποσοστό ψευδούς ανακάλυψης (FDR) σε επίπεδο φάσματος και lt;1% FDR σε επίπεδο πεπτιδίου χρησιμοποιώντας την προσέγγιση δόλωμα. Τα ιόντα αναφοράς iTRAQ εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό MASIC (Monroe et al.,

Προσδιορισμοί σχετικής αλλαγής αναδίπλωσης πρωτεΐνης και μεταγραφής, βαθμολογία Z και τιμή P

Για τα δεδομένα πρωτεΐνης, οι σχετικές αφθονίες πεπτιδίων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας αναλογίες έντασης ιόντων αναφοράς iTRAQ από κάθε φάσμα MS/MS. Οι μεμονωμένες τιμές έντασης πεπτιδίου προσδιορίστηκαν διαιρώντας την ένταση της κορυφής βάσης με τη σχετική αναλογία που σχετίζεται με κάθε ιόν αναφοράς. Κάθε πείραμα iTRAQ αναφέρεται σε μια δεξαμενή πεπτιδίων, έτσι ώστε όλα τα πειράματα να μπορούν να συνδεθούν. Όλα τα πεπτιδικά δεδομένα συνδυάστηκαν σε έναν ενιαίο πίνακα δεδομένων και μετασχηματίστηκαν σε μια τιμή log2, μετά την οποία κάθε σειρά δεδομένων κάθε πειράματος iTRAQ μετατοπίστηκε έτσι ώστε η τιμή συγκέντρωσης αναφοράς σε κάθε πείραμα iTRAQ να είναι ίση. Στη συνέχεια, κάθε στήλη δεδομένων που αντιπροσωπεύει κάθε κανάλι κάθε πειράματος iTRAQ ήταν κεντραρισμένη κατά μέσο όρο. Όλες οι τιμές πεπτιδίου στη συνέχεια μετασχηματίστηκαν για να αναιρεθεί το log2, υπολογίζοντας το 2 στην ισχύ κάθε σημείου δεδομένων. Οι τιμές αφθονίας πεπτιδίων διαχωρίστηκαν στη συνέχεια σε δύο σύνολα δεδομένων, ένα από τα πεπτίδια που είναι μοναδικά για μια μεμονωμένη πρωτεΐνη και τα πεπτίδια που μοιράζονται μεταξύ δύο ή περισσότερων πρωτεϊνών. Τα πεπτίδια αναδιπλώθηκαν σε μια τιμή πρωτεΐνης αθροίζοντας τα πεπτίδια που ανήκουν σε κάθε πρωτεΐνη σε κάθε σύνολο δεδομένων. Όπου η ίδια πρωτεΐνη υπολογίστηκε και στα δύο σύνολα δεδομένων, επιλέχθηκε μόνο μία τιμή πρωτεΐνης σε έναν τελικό πίνακα συνάθροισης πρωτεϊνών με την τιμή πρωτεΐνης από τη μοναδική συλλογή πεπτιδίων να προτιμάται εάν ταυτοποιηθεί σε όλα τα κανάλια. Οι μεμονωμένοι υπολογισμοί συγκέντρωσης πρωτεϊνών από τον μοναδικό ή κοινό πίνακα πεπτιδίων προσδιορίστηκαν στον τελικό πίνακα συγκέντρωσης πρωτεϊνών. Οι ομάδες πρωτεϊνικής οικογένειας ορθολογίας KEGG (KEGOs) προσδιορίστηκαν επίσης τόσο για τα δεδομένα πρωτεΐνης όσο και για τα δεδομένα μεταγραφής. Τα πρωτεϊνικά KEGO υπολογίστηκαν αθροίζοντας όλες τις μοναδικές τιμές πεπτιδίου που βρέθηκαν σε ένα KEGO. Τα KEGO μεταγραφής υπολογίστηκαν αθροίζοντας όλα τα δεδομένα καταμέτρησης μεταγραφών σε ένα παρόμοιο KEGO. Όλες οι τιμές πρωτεΐνης, μεταγραφής και KEGO μετατράπηκαν σε τιμή log2. Οι τιμές Log2 κάτω από το 2 σε όλα τα σύνολα δεδομένων πρωτεϊνών αφαιρέθηκαν καθώς αυτές αντιπροσωπεύουν κυρίως σήματα θορύβου που παρεμβαίνουν στους υπολογισμούς του z-score. Όλα τα αντίγραφα υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο και κατασκευάστηκαν διαγράμματα ΜΑ για κάθε σύγκριση μεταξύ της μέσης τιμής κάθε WT και μεταλλαγμένης γραμμής. Όλα τα ζεύγη αλλαγής πτυχών που αναλύθηκαν σε διαγράμματα MA, συνδυάστηκαν σε ένα ενιαίο σύνολο δεδομένων και οι τιμές που ελήφθησαν στον άξονα Α ταξινομήθηκαν από το χαμηλότερο προς το υψηλότερο. Ένα συρόμενο παράθυρο που αντιπροσώπευε το 10% του συνολικού αριθμού των σημείων δεδομένων χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της τιμής βαθμολογίας z κατά μήκος του άξονα Α για κάθε σημείο δεδομένων (στο διάγραμμα MA). Z-score (z = x-μ/σ = (σημείο δεδομένων–διάμεσος)/τυπική απόκλιση). Αυτό τυποποίησε την κατανομή αλλαγής log2 fold μεταξύ όλων των σημείων δεδομένων (χαμηλή και υψηλή αφθονία εξίσου). Από την κανονική κατανομή όλων των αλλαγών στο log2 fold, υπολογίστηκε μια τιμή p για κάθε σύγκριση αλλαγής log2 fold χρησιμοποιώντας τη συνάρτηση normsdist στο Excel.

Ανάλυση Δικτύου

Όλες οι πρωτεΐνες με υψηλή συσχέτιση κατάταξης Spearman (rho gt; 0,85) με τα μονομερή τμήματα γουαϊακυλίου (G) και συριγγυλίου (S) που προέρχονται από λιγνίνη, και οι οποίες είχαν τιμή αναλογίας z-score όχι μεγαλύτερη από ±0,5 στην ανάλυση adt1 έναντι WT , εντοπίστηκαν σε μεταλλάγματα WT και adt1, adt3, adt4, adt5, adt4/5, adt1/4/5, adt3/4/5 και adt3/4/5/6 και εισήχθησαν στον αλγόριθμο ανάλυσης δικτύου STRING ⁷(Szklarczyk et al., 2017) αναζητώντας τη βάση δεδομένων A. thaliana. Το STRING επέστρεψε συσχετισμούς πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, τύπο συσχέτισης και δύναμη συσχέτισης. Λήφθηκαν γνωστές αλληλεπιδράσεις είτε από επιμελημένες βάσεις δεδομένων είτε από τις οποίες προσδιορίστηκαν πειραματικά, μαζί με προβλεπόμενες αλληλεπιδράσεις από σύντηξη γονιδίων, συν-εμφάνιση γονιδίων, πειράματα γειτονίας γονιδίων, καθώς και από εξόρυξη κειμένου, σύνολα δεδομένων συνέκφρασης και σύνολα δεδομένων ομολογίας πρωτεϊνών. Οι αλληλεπιδράσεις κόμβων επιλέχθηκαν μόνο εάν το STRING επέστρεφε ελάχιστο σκορ αλληλεπίδρασης 0,4 ή υψηλότερο και για κόμβους με τουλάχιστον μία αλληλεπίδραση. Αυτά τα δεδομένα στη συνέχεια εξήχθησαν σε έναν πίνακα αλληλεπίδρασης, ο οποίος στη συνέχεια μετατράπηκε σε ένα έγγραφο SIF και μεταφορτώθηκε στο Cytoscape 3.4.0 (Smoot et al., 2011). Στο Cytoscape, το χαρακτηριστικό διάταξης Organic επιλέχθηκε στο yFiles Layout. Οι κόμβοι σε κοντινή απόσταση συγκεντρώθηκαν περαιτέρω χειροκίνητα με βάση είτε την λειτουργική κατηγορία του όρου KEGG είτε μιας γονιδιακής ορθολογίας (GO) εάν δεν υπήρχε κατηγορία KEGG. Οι κόμβοι αντιπροσωπεύτηκαν από ορθογώνια χρωματισμένα με ένα κόκκινο-μπλε συνδυασμό χρωμάτων για να αντιπροσωπεύουν τις βαθμολογίες z των αναλογιών log2 (ADT KO mutant/WT), όπου το κόκκινο αντιπροσωπεύει πρωτεΐνες υψηλότερη σε αφθονία σε μεταλλάξεις ADT KO σε σύγκριση με το WT, το λευκό συμβολίζει καμία αλλαγή και Το μπλε αντιπροσωπεύει πρωτεΐνες υψηλότερη σε αφθονία στο WT σε σύγκριση με τα μεταλλαγμένα ADT KO. Το πάχος της ακμής αντιπροσωπεύει την ισχύ της σχέσης μεταξύ κόμβων/πρωτεϊνών, όπως προσδιορίζεται από την τελική συνδυασμένη απόδοση βαθμολογίας του STRING. Πραγματοποιήθηκε μια πιο εστιασμένη ανάλυση STRING μόνο σε πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην επεξεργασία ριβοσώματος, ματίσματος και mRNA για την προβολή των υποτιθέμενων ειδικών συνδέσεων. Εξετάστηκαν μόνο συσχετίσεις που σχετίζονται με γνωστές και προβλεπόμενες αλληλεπιδράσεις. Μια ελάχιστη βαθμολογία αλληλεπίδρασης 0,4 ή μεγαλύτερη χρησιμοποιήθηκε για κόμβους με τουλάχιστον μία αλληλεπίδραση.

Αποτελέσματα

Μια αξιολόγηση πολλαπλών ωμικών μεταλλαγμένων γραμμών Arabidopsis ADT KO (σε σύγκριση με φυτά WT) διεξήχθη σε 4 εβδομάδες ανάπτυξης/ανάπτυξης, όταν τα φυτά είχαν αναπτύξει πλήρως φύλλα ροζέτας και είχαν μίσχους ύψους περίπου 10-20 cm (~1/3 ύψος στην ωριμότητα). Και για τους δύο τύπους ιστών, διεξήχθησαν μεταγραφομικές πλήρεις RNA-Seq, πρωτεϊνικές πολυπλεξίας iTRAQ 8-πλέγματος σε συνδυασμό με LC-MS/MS, μαζί με πρωτογενείς (GC-MS) και δευτερογενείς (LC-MS) μεταβολομικές αναλύσεις. Η ανάκριση δεδομένων οδήγησε σε σίγουρη ανίχνευση (1% FDR) 27.181 μεταγραφών, 8.672 πρωτεϊνών, μαζί με 132 πρωτογενείς και 30 δευτερογενείς μεταβολίτες.

Κανονικοποίηση Δεδομένων Έκφρασης για Ενσωμάτωση Multi-Omics

Κάθε βιομοριακή κατηγορία (δηλαδή, μεταγραφές, πρωτεΐνες και μεταβολίτες) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ανόμοιες ροές εργασίας. Δεδομένου ότι μόνο μερικές επαναληπτικές αναλύσεις ήταν εφικτές, όπως είναι τυπικό για την ανάλυση RNA-Seq και πρωτεώματος, οι εκτιμήσεις διακύμανσης αντισταθμίστηκαν με «δανεισμό» πληροφοριών από γονίδια ή πρωτεΐνες σε ολόκληρη την ανάλυση (Subramaniam and Hsiao, 2012). Η γενική λογική για αυτήν την προσέγγιση βασίστηκε στην υπόθεση ότι η διακύμανση είναι παρόμοια για βιομόρια παρόμοιας αφθονίας. Οι μετρήσεις μεταγραφής ή πεπτιδίων με παρόμοια αφθονία μπορούν επομένως να λειτουργήσουν ως ψευδο-αντίγραφα που παράγουν παρόμοιες παραμέτρους κατανομής. Αυτή η στρατηγική χρησιμοποιείται συνήθως για δεδομένα έκφρασης και με διάφορα εργαλεία βιοπληροφορικής [π.χ. SAM (Tusher et al., 2001), limma (Ritchie et al., 2015) και VAMPIRE (Hsiao et al., 2005)].

Εφαρμόσαμε αυτήν την προσέγγιση στα δεδομένα μεταγραφής, πρωτεώματος και μεταβολισμού log2 αλλαγών μεταξύ κάθε μετάλλαξης ADT KO και ανάλυσης WT. Τα δεδομένα υποβλήθηκαν αρχικά σε επεξεργασία ως γραφικές παραστάσεις MA (Dudoit et al., 2002; Labbe and Dudoit, 2012) (Συμπληρωματικό Σχήμα 1), μια προσέγγιση που κατανέμει τα δεδομένα αλλαγής log2 φορές (M = y-άξονας) σύμφωνα με τη μέση αφθονία (A = άξονας x) των δύο μετρήσεων που συγκρίνονται. Οι υπολογισμοί αλλαγής αναδίπλωσης Log2 για οποιονδήποτε τύπο δεδομένων έκφρασης (γονίδιο/πρωτεΐνη/μεταβολίτης) τυπικά σχηματίζουν μια κανονική κατανομή, με επακόλουθη χρήση εντοπισμένων δεδομένων (ή συρόμενου παραθύρου δεδομένων αλλαγής log2 φορές με παρόμοια αφθονία) που επιτρέπει τον υπολογισμό πιο ακριβούς z- βαθμολογίες και τιμές p για εκτιμήσεις σημαντικότητας. Οι υπολογισμοί που προέκυψαν από το z-score επέτρεψαν στη συνέχεια την κανονικοποίηση των δεδομένων σε μονάδες τυπικής απόκλισης (μακριά από μια μέση ή μηδενική τιμή αλλαγής). Αυτή η κανονικοποίηση επιτρέπει στη συνέχεια να συγκριθούν απευθείας τα σύνολα δεδομένων που λαμβάνονται σε διαφορετικές πλατφόρμες (δηλαδή, αλληλουχία Illumina, φασματομετρία μάζας).

Μεταβολομική Ανάλυση

Τα προφίλ μεταβολιτών αντιπροσωπεύουν τον απόλυτο μοριακό φαινοτυπικό δείκτη ενός οργανισμού σε ένα συγκεκριμένο στάδιο ανάπτυξης/ανάπτυξης. Οι μεταβολίτες συχνά λειτουργούν ως συμπαράγοντες, πηγές ενέργειας, μόρια σηματοδότησης, πρόδρομοι πολυμερείς (π.χ. σε κυτταρίνη, λιγνίνες, πρωτεΐνες, DNA), καθώς και ως μόρια άμυνας, ελκυστικών και δραστικών μορίων. Στο πλαίσιο της βιομηχανικής των φυτών, οι μεταβολομικές αναλύσεις παρέχουν την τελική επικύρωση ως προς το ποιοι μεταβολίτες αυξάνονται ή μειώνονται σε ποσότητα ως απόκριση σε μια γενετική αλλαγή ή άλλη διαταραχή. Εδώ χρησιμοποιήσαμε δύο φασματομετρικές μεθόδους μάζας για να αξιολογήσουμε τις διαφορές μεταξύ κάθε μετάλλαξης ADT KO και WT όσον αφορά τόσο τον πρωτογενή όσο και τον δευτερογενή μεταβολισμό.

Τα συμπληρωματικά σχήματα 2, 3 δείχνουν χάρτες θερμότητας που εμφανίζουν z-score αλλαγών log2 φορές μεταξύ μεταλλαγμάτων ADT KO και WT για τους μεταβολίτες που προσδιορίζονται από GC-MS (δηλ. πρωτογενείς μεταβολίτες) και LC-MS (δηλαδή δευτερογενείς μεταβολίτες), αντίστοιχα. Τα δεδομένα ομαδοποιήθηκαν κατά λειτουργικές κατηγορίες, όπως ορίζονται από το KEGG ⁸(Kanehisa et al., 2017), όταν είναι διαθέσιμο. Οι τιμές Z-score που σχετίζονται με τα συμπληρωματικά σχήματα 2, 3 βρίσκονται στον συμπληρωματικό πίνακα 1. Τα αποτελέσματα GC-MS (Συμπληρωματικό Σχήμα 2) εμφανίζονται ως θερμικός χάρτης που εμφανίζει το z-score των τιμών αλλαγής log2 φορές κάθε μεταβολίτη που βρίσκεται σε κάθε ADT KO μεταλλαγμένο σε σύγκριση με το WT. Οι μεγαλύτερες κατηγορίες πρωτογενών μεταβολιτών που εντοπίστηκαν σχετίζονταν με υδατάνθρακες, αμινοξέα και λιπίδια. Οι αναδιπλώσεις που βρέθηκαν στην κατηγορία των υδατανθράκων περιελάμβαναν κατά μέσο όρο μειώσεις στο ασκορβικό (2,6 στο φύλλο, 2,3 στο στέλεχος) και στο αφυδροασκορβικό (2,6 στο φύλλο, 1,5 στο στέλεχος). Αν και δεν ανιχνεύθηκε στον ιστό των φύλλων, η μελιβιόζη (3,2 φορές) και η ξυλιτόλη (2,3 φορές) ήταν χαμηλότερη σε αφθονία στους μίσχους.

Τόσο στους ιστούς των φύλλων όσο και στους ιστούς του στελέχους, η πιο σημαντική αλλαγή όλων των μεταβολιτών που εντοπίστηκαν από τα δεδομένα GC-MS ήταν αυτή της αύξησης της σορβιτόλης (5,9 φορές στο φύλλο, 152 φορές στο στέλεχος). Ο αποκλεισμός έστω και μίας ισομορφής ADT στο Arabidopsis έχει βαθιές επιπτώσεις στη βιοσύνθεση της σορβιτόλης και ίσως σε επίπεδο φυτού. Οι Jain et al. (2010) ανέφερε ότι η επεξεργασία δενδρυλλίων αραβοσίτου με αυξημένες συγκεντρώσεις σορβιτόλης (α) μείωσε τη συνολική περιεκτικότητα σε χλωροφύλλη, πρωτεΐνες και RNA, ενώ αύξησε τα επίπεδα προλίνης και τη δραστηριότητα της νιτρικής αναγωγάσης. και (β) προκάλεσε μια απόκριση στρες που ανέστειλε συνολικά την ανάπτυξη του αραβοσίτου. Παράγοντας τόση πολλή σορβιτόλη in vivo, τα μεταλλαγμένα ADT KO μπορεί επίσης να παρουσιάζουν αλλαγές στα επίπεδα χλωροφύλλης, πρωτεΐνης και RNA. Επιπλέον, αυτές οι σειρές φυτών μπορεί επίσης να βρίσκονται υπό αυξημένα επίπεδα καταπόνησης σε σχέση με τα φυτά WT. Γλυκολικό οξύ (2. 1 φορές στο φύλλο και 2,3 φορές στο στέλεχος) βρέθηκε επιπλέον ότι αυξήθηκε σε μεταλλάξεις ADT KO έναντι WT. Το γλυκολικό οξύ παράγεται όταν η διφωσφορική ριβουλόζη (RuBisCo) σταθεροποιεί το O2 αντί για το CO2. Η αυξημένη παρουσία γλυκολικού οξέος τόσο στους ιστούς των φύλλων όσο και στους ιστούς του στελέχους υποδηλώνει αυξημένη χρήση της οδού φωτοαναπνοής, η οποία οδηγεί σε απελευθέρωση CO2 πίσω στην ατμόσφαιρα.

Στον ιστό του στελέχους, άλλοι υδατάνθρακες όπως το D-γλυκερικό οξύ (2,8 φορές), η 6-δεοξυ-D-γλυκόζη (10,1 φορές) και η φρουκτόζη-6-φωσφορική (4,1 φορές) είχαν επίσης υψηλότερα επίπεδα σε γραμμές ADT KO έναντι WT. ενώ ήταν σημαντικά αυξημένα επίπεδα D-γλυκοεπτόζης (36,1 φορές), αλόζης (4,0 φορές), γλυκονικής λακτόνης (3,5 φορές), σορβόζης (2,5 φορές), θρεονικού οξέος (7,3 φορές) και 1-φωσφορικής γλυκόζης (3,9 φορές) παρατηρείται στα φύλλα.

Τα αμινοξέα με τα πιο αυξημένα επίπεδα στους μεταλλάκτες ADT KO έναντι των ιστών στελέχους WT περιελάμβαναν αλλοθρεονίνη (4,2 φορές), αλανίνη (2,3 φορές) και γλουταμικό (2,2 φορές). Αντίθετα, μειώσεις στις γραμμές ADT KO βρέθηκαν για την οξοπρολίνη (2,4 φορές) στους μίσχους. Είναι ενδιαφέρον ότι το σικιμικό, το οποίο είναι βασικός μεταβολίτης που βρίσκεται στα μονοπάτια αρωματικού αμινοξέος/σχικιμικού χορισμού ανάντη της ADT, ήταν κατά μέσο όρο αυξημένο (2,6 φορές) στα μεταλλαγμένα φύλλα ADT KO, αλλά μειώθηκε (8,3 φορές) σε αφθονία στους ιστούς στελέχους.

Η μεταβολομική ανάλυση LC-MS των υδροαλκοολικών εκχυλισμάτων φύλλων και στελεχών οδήγησε στην ανίχνευση πολλών σημαντικών δευτερογενών μεταβολιτών (Συμπληρωματικό Σχήμα 3). Αυτή η προσέγγιση επιλέχθηκε με βάση προηγούμενες γνώσεις σημαντικών και χαρακτηριστικών μεταβολιτών που παράγονται από το A. thaliana, οι οποίοι περιλαμβάνουν φλαβονοειδή, φαινυλοπροπανοειδή (π.χ. εστέρες sinapat, λιγνάνες) και γλυκοζινολικά. Βρήκαμε ότι τα υποτιθέμενα γαλακτολιπίδια και καροτενοειδή γενικά αυξήθηκαν σε αφθονία και στους δύο ιστούς, ενώ τα περισσότερα από τα ταυτοποιημένα φλαβονοειδή, 1-O-β-D-γλυκοπυρανοσυλ σιναπικός εστέρας, 5-υδροξυφερουλοϋλ μηλικός εστέρας και λιγνάνες (π. γενικά μειώθηκε σε αφθονία πιο έντονα στους ιστούς του στελέχους, με τις μεγαλύτερες μειώσεις να σημειώνονται στους μίσχους με μονές ή πολλαπλές KO της ADT5. Εννέα γλυκοσινολικά, Ταυτοποιήθηκαν επίσης, οι οποίοι είναι μεταβολίτες που περιέχουν άζωτο και θείο και συντίθενται από τα φυτά ως άμυνα έναντι φυτοφάγων και παθογόνων. Τα γλυκοζινολικά που προέρχονται από ομομεθειόνη (δηλαδή, γλυκοϊμπερίνη, γλυκοχιρσουτίνη, 7-μεθυλοσουλφινυλεπτυλγλυκοσινολικός εστέρας και γλυκοεσπεραλίνη) γενικά μειώθηκαν σε αφθονία στα μεταλλάγματα ADT KO σε σύγκριση με το WT, ενώ εκείνα που προέρχονται από Trp ή Phe εμφάνισαν μεταβολές KO και ADT ανάλογα με την αφθονία του KO τύπος. Η γλυκοβρασικίνη, η 4-υδροξυγλυκομπρασικίνη και η 1-μεθοξυγλυκομπρασικίνη, όλα προερχόμενα από το Trp, εμφάνισαν αυξήσεις και μειώσεις ανάλογα με το συγκεκριμένο μετάλλαγμα ADT KO που αναλύθηκε. Η 4-μεθοξυγλυκοβρασικίνη (προερχόμενη από Trp) αυξήθηκε σε αφθονία στα περισσότερα δείγματα φύλλων μεταλλαγμάτων ADT KO και στα περισσότερα από τα διπλά/τριπλά/τετραπλά μεταλλάγματα ADT KO καθώς και στο adt5. Οι δεσμοί μεταξύ γλυκοσινολικών και φαινυλοπροπανοειδών, με τη λιγνίνη να συντίθεται στο φαινυλοπροπανοειδές μονοπάτι, έχουν τεκμηριωθεί προηγουμένως στη βιβλιογραφία, υποδηλώνοντας ότι υπάρχει ισχυρή σύνδεση μεταξύ αυτών των δύο οδών. Για παράδειγμα, οι Kim et al. (2015) αναγνώρισε μια γλυκοζινολική ινδόλη που περιορίζει τη συσσώρευση φαινυλοπροπανοειδών μέσω μιας ανασταλτικής επίδρασης στα πρώιμα στάδια της βιοσύνθεσης φαινυλοπροπανοειδών.

Transcriptomics and Proteomics Analysis

Διάφοροι μεταβολίτες μπορούν συχνά να συντεθούν ή να μεταβολιστούν από ένα ή περισσότερα ισοένζυμα που περιέχονται σε διαφορετικά φυτικά διαμερίσματα και/ή εκφράζονται σε διαφορετικούς χρόνους εντός της διάρκειας ζωής ενός φυτού. Αυτό καθιστά τον προσδιορισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό του μεταβολίτη από μόνες τους όχι εντελώς επαρκείς για τη μεταφορά βασικών πληροφοριών σχετικά με συγκεκριμένους στόχους γονιδίων/ενζύμων που είναι απαραίτητοι για την πλήρη κατανόηση ενός συστήματος ή για σκοπούς βιομηχανικής. Για το λόγο αυτό, η μεταγραφομική και η πρωτεομική αποδεικνύονται ανεκτίμητες για τον εντοπισμό σημαντικά επηρεαζόμενων μονοπατιών, ειδικών γονιδιακών/ενζυμικών στόχων, συμβάντων γονιδιακής ρύθμισης και πληροφοριών ενζύμου στόχου ειδικών για τον ιστό και/ή το υποκυτταρικό διαμέρισμα.

Το συμπληρωματικό Σχήμα 4 δείχνει τις μετρήσεις RNA-Seq που παρατηρήθηκαν σε φύλλα και μίσχους για κάθε γραμμή που ερευνήθηκε. Στα φυτά WT, η σχετική σειρά αφθονίας μεταγραφής στους μίσχους (όπου η εναπόθεση λιγνίνης είναι η μεγαλύτερη) προσδιορίστηκε ότι είναι ADT5 gt; ADT4 gt; ADT3 gt; ADT1 gt; ADT6. Προηγούμενη φυλογενετική αξιολόγηση έδειξε ότι οι ADT3, ADT4 και ADT5 αποτελούν μέρος της ίδιας φυλογενετικής υποομάδας. Καθορίστηκε επίσης ότι αυτές οι τρεις ADT αντιστοιχούν σε πρωτεΐνες που χρησιμοποιούν αποκλειστικά αρογονικό ως υπόστρωμα (Cho et al., 2007), ενώ οι ADT1, ADT2 και ADT6 έδειξαν προτίμηση για το αρογονικό αλλά θα μπορούσαν δυνητικά, αν και λιγότερο αποτελεσματικά, να χρησιμοποιούν προφαινικό σε σύνθεση Phe. Τα ευρήματά μας ότι ADT3, ADT4, και ADT5 ήταν υψηλότερα σε αφθονία σε μίσχους ηλικίας 4 εβδομάδων επιβεβαιώθηκε από παρόμοια ευρήματα των επιπέδων RT-PCR που βρέθηκαν σε ιστούς στελέχους Arabidopsis ηλικίας 5 εβδομάδων (Corea et al., 2012c) και ξεχωριστές αναλύσεις στυπώματος Northern (Rippert et al., 2009) σε ηλικίας 4 εβδομάδων WT Arabidopsis. Το τελευταίο έδειξε ότι οι ADT4 και ADT5 ήταν υψηλότερες σε αφθονία στους ιστούς του στελέχους και της ρίζας.

Τα δεδομένα RNA-Seq έδειξαν επίσης μια αύξηση στην έκφραση ADT μεταξύ ADT3, ADT4 και ADT5, όταν ένα από τα ADT σε αυτήν την υποομάδα τέθηκε εκτός λειτουργίας. Μεγάλες αυξήσεις της ADT5 παρατηρήθηκαν στα στελέχη όταν οι ADT3 και ADT4 αποκλείστηκαν, δείχνοντας ~2 φορές και ~4 φορές στις γραμμές νοκ-άουτ adt3 και adt4, αντίστοιχα. Όταν η ADT5 αποκλείστηκε, η ADT4 εκφράστηκε σε μεγαλύτερες ποσότητες (~ 2 φορές αύξηση). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι, ειδικά στον ιστό του στελέχους, η έκφραση ADT mRNA μεταξύ ADT3, ADT4 και ADT5 φαινόταν να συντονίζεται, καθώς τα υπόλοιπα ADT στην υποομάδα ADT3/ADT4/ADT5 αυξήθηκαν όταν άλλα μέλη της υποομάδας αποκλείστηκαν. Στον ιστό των φύλλων, μόνο μέτριες επιδράσεις παρατηρήθηκαν σε αυτήν την υποομάδα.

Για να δείτε την κάλυψη και τις σχετικές ποσότητες (δηλ. μετρήσεις) θραυσμάτων mRNA που προσδιορίζονται σε κάθε ανάλυση RNA-Seq (σε αναφορά σε κάθε ADT σε φύλλα ή μίσχους), τη θέση των διαφόρων εισαγωγών Τ-DNA που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή των ΚΟ και των πεπτιδίων που ταυτοποιούνται από η πρωτεομική ανάλυση, τα δεδομένα γονιδιακού προϊόντος για κάθε γονίδιο απεικονίστηκαν δίπλα-δίπλα. Το πρόγραμμα περιήγησης IGV (Robinson et al., 2011; Thorvaldsdóttir et al., 2013) χρησιμοποιήθηκε για να χαρτογραφήσει τις αναγνώσεις του γονιδίου και χρησιμοποιώντας ένα σενάριο που αναπτύχθηκε PNNL 9, τα δεδομένα πεπτιδίου ^{μετατράπηκαν} σε αρχεία BED τα οποία στη συνέχεια θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από οποιοδήποτε λογισμικό προβολής γονιδιώματος. Αυτό επέτρεψε την οπτικοποίηση των δεδομένων πρωτεϊνικής σε σχέση με το γονίδιο παράλληλα με τα δεδομένα RNA-Seq.

Το συμπληρωματικό Σχήμα 5 δείχνει ένα παράδειγμα συγκρίσεων οπτικοποίησης γονιδίου-μεταγραφής-πεπτιδίου που ανιχνεύθηκαν σε γραμμές WT και ADT KO για ADT5. Οι συγκρίσεις όλων των άλλων ADT σε όλα τα δεδομένα RNA-Seq και proteomics μπορούν να προσπελαστούν στις τοποθεσίες αποθήκευσης δεδομένων MassIVE και ProteomeXchange (αριθμοί πρόσβασης MSV000081518 και PXD007701, αντίστοιχα). Οι αλληλουχίες ανάγνωσης κατάντη της μεταγραφής από εισαγωγές Τ-DNA εμφάνισαν πολύ μειωμένα επίπεδα όπως αναμενόταν. Τα πρωτεομικά δεδομένα έδειξαν επίσης ότι λίγα πεπτίδια από ADT ήταν αναγνωρίσιμα στην ανάλυση υψηλής απόδοσης εδώ, η οποία έδειξε ότι τα ADT ήταν πιθανότατα χαμηλή σε αφθονία σε σχέση με ολόκληρο το πρωτεώμα στα φύλλα. Αντίθετα, στους ιστούς των βλαστών, περισσότερα μεταγραφήματα και πεπτίδια ADT ήταν γενικά αναγνωρίσιμα, υποστηρίζοντας την υπόθεση ότι τα γονίδια ADT, καθώς και οι πρωτεΐνες, ήταν σχετικά υψηλότερη σε αφθονία στους ιστούς του στελέχους σε σύγκριση με τα φύλλα. Αυτό πιθανότατα οφείλεται στο ότι οι ιστοί του στελέχους χρειάζονται βιοσύνθεση λιγνίνης σε μεγαλύτερες σχετικές ποσότητες σε σύγκριση με τα φύλλα.

Στη συνέχεια εξετάσαμε ποια αναλογία κάθε λειτουργικής κατηγορίας KEGG περιείχε, κατά μέσο όρο, τις πιο σημαντικά (p-value lt; 0,05) αλλαγμένες πρωτεΐνες και μεταγραφές τόσο στους ιστούς των φύλλων όσο και στους ιστούς του στελέχους σε όλες τις σειρές ADT KO (Συμπληρωματικό Σχήμα 6). Κατηγορίες με τη μεγαλύτερη αναλογία σημαντικά αλλαγμένων πρωτεϊνών/μεταγραφών συμμετείχαν στη βιοσύνθεση γλυκοσινολικών, στον μεταβολισμό του α-λινολενικού οξέος, στη βιοσύνθεση αζώτου, καροτενοειδών και φαινυλοπροπανοειδών, καθώς και στον μεταβολισμό των αρωματικών αμινοξέων. Αυτά τα ευρήματα συμφωνούν σε μεγάλο βαθμό με τις σημαντικές αλλαγές που παρατηρούνται στα μεταβολομικά δεδομένα (Συμπληρωματικά Σχήματα 2, 3).

Οι αναλύσεις πρωτεϊνών και μεταγράφων της υποτιθέμενης οδού βιοσύνθεσης καροτενοειδών έδειξαν υψηλό βαθμό σημαντικά αλλαγμένων (p-value lt; 0,05) μελών πρωτεΐνης/μεταγραφής (Συμπληρωματικό Σχήμα 6) όταν η περιεκτικότητα σε ADT μειώθηκε. Οι μετρήσεις μεταβολιτών των υποτιθέμενων καροτενοειδών έδειξαν επίσης μια σχεδόν καθολική αύξηση στην αφθονία σε όλες τις γραμμές ADT KO τόσο στα φύλλα όσο και στα στελέχη (Συμπληρωματικό Σχήμα 3). Τα καροτενοειδή λειτουργούν στα φυτά ως βοηθητικές χρωστικές σε μεμβράνες πλαστιδίων και στους χλωροπλάστες πιστεύεται ότι συμβάλλουν στη διάχυση ενέργειας και μπορούν να λειτουργήσουν ως προστατευτικοί παράγοντες έναντι των αντιδρώντων ειδών οξυγόνου (ROS) (Nisar et al., 2015). Τα καροτενοειδή και τα αποκαροτενοειδή προϊόντα διάσπασής τους, τα οποία μπορεί επίσης να χρησιμεύσουν ως μόρια σηματοδότησης, είναι σημαντικές στη συναρμολόγηση της φωτοσύνθεσης και των πρωτεϊνών κεραίας για φωτοσύνθεση και φωτοπροστασία (Cazzonelli and Pogson, 2010). Η πρωτεϊνική ανάλυση της φωτοσύνθεσης και των μονοπατιών βιοσύνθεσης πρωτεΐνης κεραίας έδειξε σχετικά υψηλό ποσοστό σημαντικώς αλλαγμένων πρωτεϊνών (τιμή p lt; 0,05) (Συμπληρωματικό Σχήμα 6Α) σε μεταλλάκτες ADT KO υποδηλώνοντας ότι η εξάλειψη των ADTs στα φυτά επηρεάζει επίσης τη φωτοσύνθεση.

Ενώ παρατηρήθηκαν αυξήσεις στην αναλογία των σημαντικά αλλαγμένων πρωτεϊνών στις οδούς φωτοσύνθεσης και στερέωσης του άνθρακα, ειδικά στα στελέχη, τόσο μεγάλες αλλαγές δεν παρατηρήθηκαν στο αντίστοιχο επίπεδο μεταγραφής. Το γεγονός ότι οι δεξαμενές mRNA που σχετίζονται με τη φωτοσύνθεση και τη στερέωση του άνθρακα δεν άλλαξαν πολύ, ενώ οι αριθμοί των αντιγράφων μετάφρασης αυξήθηκαν σε μεγάλο βαθμό, αυξάνει την πιθανότητα ενός μετα-μεταγραφικού ρυθμιστικού μηχανισμού. Άλλες κατηγορίες που ήταν αξιοσημείωτα διαφορετικές μεταξύ των δεδομένων πρωτεΐνης και μεταγραφής περιελάμβαναν αυτές που εμπλέκονται στον μεταβολισμό του Phe και στον μεταβολισμό γλυκολικών/αποκαρβοξυλικών. Διαπιστώθηκε ότι αυτά άλλαξαν σε μεγάλο βαθμό στα δεδομένα πρωτεϊνών, ειδικά στους ιστούς του στελέχους, αλλά λιγότερο σε επίπεδο μεταγραφής. Κατηγορίες που παρουσίασαν σχετικά υψηλές αλλαγές σε επίπεδο μεταγραφής, αλλά δεν φάνηκε να μεταφράζεται σε υψηλότερες αλλαγές σε επίπεδο πρωτεΐνης, περιλάμβανε εκείνες τις οδούς που εμπλέκονται στον μεταβολισμό της αλανίνης/ασπαρτικού/γλουταμινικού, προπανοϊκού και γαλακτόζης, αντίστοιχα. Αυτό δεν ήταν περίεργο δεδομένου ότι τα ADT βιοσυνθέτουν Phe.

Παρατηρήσαμε επίσης ότι τα μονοπάτια μεταβολισμού που προέρχονται από σικιμικό-χορισμικό (δηλαδή, προς Phe, Tyr και τρυπτοφάνη) άλλαξαν σε μεγάλο βαθμό τόσο σε επίπεδα μεταγραφής όσο και σε επίπεδα πρωτεΐνης. Είναι γνωστό ότι τα Phe, Tyr και Trp που παράγονται μέσω της οδού σικιμικού-χορισμού συμβάλλουν στους μηχανισμούς αναστολής ανάδρασης διαφόρων ενζύμων της οδού σικιμικού ανάντη της ADT (Tzin and Galili, 2010) και ότι οι ADT KOs μπορούν να αλλάξουν όχι μόνο τα επίπεδα Phe αλλά και επίπεδα Tyr και Trp (Corea et al., 2012a). Υποθέτουμε λοιπόν ότι στα μεταλλάγματα ADT KO πιθανόν να υπάρχουν αλλαγές στα επίπεδα άλλων μεταβολιτών που συντίθενται από πρόδρομους Phe/Tyr/Trp. Αυτά θα μπορούσαν ενδεχομένως να επηρεάσουν τους μεταβολίτες, συμπεριλαμβανομένων των φυτοορμονών, οι οποίες θα μπορούσαν, με τη σειρά τους, να παράγουν αποτελέσματα σε όλο το σύστημα. Για παράδειγμα, η φυτορμόνη ινδολο-3-οξικό οξύ (IAA) συντίθεται από το Trp και το IAA μπορεί να επηρεάσει τις αλλαγές στην ανάπτυξη,

Μια άλλη φυτορμόνη που δυνητικά μεταβάλλεται σε μεταλλάγματα ADT KO μπορεί να είναι το ιασμονικό οξύ (JA). Αν και δεν εντοπίσαμε συγκεκριμένα JA ή οποιαδήποτε άλλη φυτοορμόνη στα μη στοχευμένα δεδομένα μεταβολομικής, οι αλλαγές στους πρόδρομους JA μπορεί να είναι ενδεικτικές πιθανών αλλαγών στα κατάντη επίπεδα φυτοορμόνης. Το JA προέρχεται από το α-λινολενικό οξύ (Weber, 2002) και τα μονοπάτια μεταβολισμού του α-λινολενικού οξέος άλλαξαν σε μεγάλο βαθμό τόσο σε επίπεδο μεταγραφής όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης (Συμπληρωματικό Σχήμα 6). Το α-λινολενικό οξύ δεν είναι μόνο πρόδρομος του JA, αλλά βοηθά επίσης στη ρευστότητα της φωτοσυνθετικής μεμβράνης του θυλακοειδούς (Yashroy, 1987) ενεργώντας δυνητικά ως ένας άλλος παράγοντας που συμβάλλει σε αλλαγές που επηρεάζουν τη φωτοσύνθεση. Άλλες μελέτες έδειξαν ότι τα επίπεδα JA έχουν ισχυρή σχέση με τα επίπεδα λιγνίνης. Οι Denness et αϊ. (2011) έδειξε ότι τόσο η παραγωγή JA-ισολευκίνης όσο και η παραγωγή ROS θα μπορούσαν να σχηματίσουν έναν βρόχο αρνητικής ανάδρασης που μπορεί στη συνέχεια να καταστείλει την παραγωγή του άλλου και να επηρεάσει τη συσσώρευση λιγνίνης. Δεδομένου ότι υπήρχαν χαμηλότερα επίπεδα ασκορβικού και αφυδροασκορβικού στα μεταβολώματα που προέρχονται τόσο από τον ιστό φύλλων όσο και από τον βλαστικό ιστό των μεταλλαγμάτων ADT KO σε σύγκριση με το WT, μπορεί να είναι ότι το ROS είναι υψηλότερο σε συγκέντρωση στα μεταλλάγματα ADT KO δεδομένου ότι υπάρχει λιγότερο ασκορβικό για τον καθαρισμό του ROS . Αυτό μαζί με τα μεταβαλλόμενα επίπεδα JA θα μπορούσαν ενδεχομένως να συμβάλλουν σήματα που επηρεάζουν τη βιοσύνθεση λιγνίνης. Το ασκορβικό είναι επίσης ένας συμπαράγοντας για τη βιοσύνθεση πολλών άλλων φυτοορμονών, όπως το αιθυλένιο, οι γιβερελλίνες και το αψικικό οξύ (Pastori et al., 2003). Λόγω της πιθανότητας για όλες αυτές τις διάφορες φυτοορμόνες να μεταβληθούν σε ποσότητες όταν η ADT αποκλείεται,

Ολοκληρωμένη Ανάλυση Μεταβολώματος, Πρωτεώματος και Μεταγραφώματος

Το Σχήμα 2Α δείχνει τις συσχετίσεις δεδομένων αφθονίας Pearson’s Pairwise log2 μεταξύ κάθε μετάλλαξης WT και ADT KO, σε σύγκριση με κάθε άλλο μετάλλαγμα ADT KO μεταξύ των πρωτεϊνών και των μεταγραφών στο γονιδιακό προϊόν (πρωτεΐνη ή μεταγραφή) και στα επίπεδα της οικογένειας ενζύμου ορθολογικού KEGG (KEGO). Τα μεταγραφήματα και οι πρωτεΐνες είχαν μέση συσχέτιση 0,394 και 0,369 στα δεδομένα των φύλλων και του στελέχους, αντίστοιχα. Οι συσχετίσεις αυξήθηκαν, ωστόσο, όταν τα δεδομένα συμπτύχθηκαν περαιτέρω σε συγκρίσεις KEGO, με τις συσχετίσεις αφθονίας κατά μέσο όρο να είναι 0,615 και 0,645. Μόνο περίπου το 30 και 28% του μεταγραφώματος ανιχνεύθηκε σε επίπεδο πρωτεΐνης σε δεδομένα φύλλων και στελέχους (Εικόνα 2Β), αντίστοιχα, ενώ η κάλυψη σε επίπεδο KEGO ήταν περίπου 65%. Περίπου το 17% των πρωτεϊνών δεν είχαν ανιχνεύσιμο μεταγράφημα και περίπου το 8% των πρωτεϊνικών KEGO δεν είχαν αντίστοιχα ανιχνεύσιμα KEGO μεταγραφής. Τα ποσοστά επικάλυψης μεταξύ ανιχνεύσιμων μεταγραφών και πρωτεϊνών διέφεραν επίσης λόγω της λειτουργικής κατηγορίας KEGG της οποίας ήταν μέλη (Εικόνα 2Γ). Οι παρούσες πρωτεΐνες που δεν έχουν πλέον ανιχνεύσιμο αντίγραφο ενδέχεται να αντιπροσωπεύουν πρωτεΐνες μακράς διάρκειας ή προϊόντα αποικοδόμησης πρωτεϊνών που παραμένουν στα κύτταρα μετά την αποικοδόμηση του αντίστοιχου mRNA.

Σχήμα 2. Προτεινόμενες συσχετίσεις δεδομένων μεταγραφής και πρωτεΐνης. (Α) Διαγράμματα συσχέτισης κατά ζεύγη Pearson για κάθε δεδομένα αναλογίας αφθονίας log2 μεταξύ κάθε μετάλλαξης ADT KO έναντι δεδομένων WT σε σύγκριση με όλα τα άλλα τόσο στα δεδομένα μεταγραφής όσο και στα δεδομένα πρωτεΐνης. Οι δύο πιο αριστερές γραφικές παραστάσεις προέρχονται από δεδομένα μεταγραφής και πρωτεϊνών, και οι δύο τελευταίες γραφικές παραστάσεις αντιπροσωπεύουν δεδομένα ορθολογικού μεταγραφής και πρωτεΐνης KEGG (KEGO) για σετ δειγμάτων φύλλων ή μίσχων. (Β) Μεταγραφές και πρωτεΐνες του διαγράμματος Venn, και μεταγραφές και πρωτεϊνικά KEGO που προσδιορίζονται σε δεδομένα φύλλων και μίσχων. (Γ) Το αντίγραφο και η πρωτεΐνη επικαλύπτονται σε όλα τα δεδομένα πρωτεΐνης και μεταγραφής σύμφωνα με τη λειτουργική κατηγορία KEGG.

Για να ενσωματωθούν δεδομένα μεταγραφής, πρωτεΐνης και μεταβολομικής για μια πιο άμεση σύγκριση, συγκρίθηκαν οι τιμές KEGO. Με αυτόν τον τρόπο, δεδομένου ότι οι τιμές πρωτεΐνης και μεταγραφής αντικατοπτρίζουν μια συνολική αθροιστική συνεισφορά σε κάθε ενζυματική αντίδραση, οι συγκρίσεις τους είναι πιθανότατα πιο κοντά στις αλλαγές της αφθονίας των μεταβολιτών που είναι αθροιστικές τιμές σε όλο τον ιστό. Οι βαθμολογίες Z για κάθε σετ αντίδρασης αναλογίας μεταγραφής-μεταβολίτη-πρωτεΐνης αναλογίας log2 εμφανίζονται στο Σχήμα 3 (δεδομένα φύλλου) και στα συμπληρωματικά σχήματα 7, 8 (δεδομένα στελέχους), αντίστοιχα, με αντίστοιχα δεδομένα στους συμπληρωματικούς πίνακες 2, 3. Όπως φαίνεται στο στους χάρτες θερμότητας μεταγραφής-μεταβολίτη-πρωτεΐνης, υπάρχουν πολλαπλά ένζυμα KEGO που μπορούν να χρησιμοποιήσουν το ίδιο υπόστρωμα, αλλά που θα μπορούσαν να παράγουν διαφορετικά προϊόντα μεταβολίτη. Επιπλέον, μερικές φορές υπάρχουν πολλά KEGO που πραγματοποιούν την ίδια αντίδραση.

Εικόνα 3. Χάρτης θερμότητας μεταγραφής-μεταβολίτης-πρωτεΐνης που εμφανίζει συγκρίσεις z-score των ζευγών αναλογίας log2 (μετάλλαγμα ADT KO/άγριος τύπος, WT) ταυτοποιημένων μεταβολιτών που βρέθηκαν να έχουν ένα αντίστοιχο μέλος της Οικογένειας Γονιδιακών Ορθολόγων KEGG (KEGO) που χρησιμοποιεί αυτόν τον συγκεκριμένο μεταβολίτη ως υπόστρωμα, και τα οποία ανιχνεύθηκαν τόσο σε δεδομένα μεταγραφής όσο και σε δεδομένα πρωτεϊνικής. Κάθε KEGO εμφανίζεται με υπόστρωμα και μεταβολίτη προϊόντος που σχηματίζεται από αυτήν την οικογένεια ενζύμων KEGO. Τα δεδομένα ταξινομούνται περαιτέρω σε ομάδες που δείχνουν: (Α) Ομάδα 1 – Μεταγραφές, μεταβολίτες και πρωτεΐνες που όλα κατά μέσο όρο αυξήθηκαν ή μειώθηκαν στα μεταλλάγματα ADT KO μαζί σε σύγκριση με το WT. (Β) Ομάδα 2 – Τα μεταγραφήματα μειώθηκαν, ενώ οι μεταβολίτες και οι πρωτεΐνες στις σειρές ADT KO, κατά μέσο όρο, αυξήθηκαν σε αφθονία.(Γ) Ομάδα 3 – Τα μεταγραφήματα και οι μεταβολίτες κατά μέσο όρο στις σειρές ADT KO αυξήθηκαν και οι πρωτεΐνες μειώθηκαν σε αφθονία σε σύγκριση με το WT. (Δ) Σύμπλεγμα 4– Οι μεταγραφές και οι πρωτεΐνες μειώθηκαν και οι μεταβολίτες αυξήθηκαν κατά μέσο όρο στα μεταλλάγματα ADT KO σε σύγκριση με το WT. Σε κάθε σύμπλεγμα, οι καταχωρήσεις ομαδοποιούνται περαιτέρω ανάλογα με το εάν ο Metabolite 1 είναι υπόστρωμα ή προϊόν σε μια μονοκατευθυντική αντίδραση ή εάν μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε μια αναστρέψιμη αντίδραση. Στη συνέχεια, οι αντιδράσεις ταξινομούνται από την υψηλότερη μέση βαθμολογία z-score μεταβολίτη έως τη χαμηλότερη βαθμολογία z-score μεταβολίτη. Το κόκκινο αντιπροσωπεύει μεταβολίτες σε μεγαλύτερη αφθονία στο μετάλλαγμα ADT KO σε σύγκριση με το WT, το μπλε αντιπροσωπεύει μεταβολίτες σε υψηλότερη αφθονία στο μετάλλαγμα ADT KO σε σύγκριση με το μετάλλαγμα ADT KO, το λευκό αντιπροσωπεύει μεταβολίτες αμετάβλητους σε αφθονία μεταξύ του μεταλλάγματος WT και του μεταλλάγματος ADT KO και το γκρι αντιπροσωπεύει συστατικά που δεν ανιχνεύονται . Τα πράσινα τετράγωνα υποδεικνύουν την υψηλότερη μέση τιμή KEGO που σχετίζεται με κάθε ανιχνευμένο μεταβολίτη. Οι γκρίζοι κύκλοι αντιπροσωπεύουν αντιδράσεις KEGO όπου υπήρχε μόνο μία γνωστή αντίδραση για τη δεδομένη αντίδραση υποστρώματος-προϊόντος. Οι μπλε κύκλοι αντιπροσωπεύουν δεδομένα μεταγραφής log2 που συσχετίζονται περισσότερο με δεδομένα μεταβολίτη log2 σε μεταλλάγματα ADT KO, δηλαδή εάν η αναλογία αφθονίας μεταξύ μεταγραφών και μεταβολιτών εμφάνιζε αύξηση προφίλ σε απλούς, διπλούς, τριπλούς και τετραπλούς μεταλλάκτες ADT KO, θα είχαν θετική συσχέτιση ανεξάρτητα από το αν οι ίδιες οι τιμές z-score ήταν αρνητικές ή θετικές. Οι πορτοκαλί κύκλοι αντιπροσωπεύουν δεδομένα πρωτεΐνης log2 που συσχετίζονται περισσότερο με δεδομένα μεταβολίτη log2 σε μεταλλάγματα ADT KO, δηλαδή εάν η αναλογία αφθονίας μεταξύ πρωτεϊνών και μεταβολιτών έδειξαν ότι αυξάνεται το προφίλ σε απλούς, διπλούς, τριπλούς και τετραπλούς μεταλλάκτες ADT KO, αυτά θα είχαν θετική συσχέτιση ανεξάρτητα από το αν οι ίδιες οι τιμές του z-score ήταν αρνητικές ή θετικές. Συντομογραφίες: rtm = Συσχέτιση Pearson μεταξύ προφίλ μεταγραφής και μεταβολίτη. rpm = Συσχέτιση Pearson μεταξύ των προφίλ πρωτεΐνης και μεταβολίτη. rtp = Συσχέτιση Pearson μεταξύ προφίλ μεταγραφής και πρωτεΐνης. 1-Acyl-sn-G3P, 1-Acyl-sn-γλυκερόλη 3-φωσφορική; 2-HTD, διφωσφορική 2-(α-υδροξυαιθυλ)θειαμίνη. 3-ΙΑ, 3-ινδόλη ακετονιτρίλιο; 9(S)-HPODE, 9(S)-Υδροϋπεροξυ οκταδεκαδιενοϊκό οξύ. 13(S)-HPODE, 13(S)-Υδροϋπεροξυ-(9Ζ,11Ε)-οκταδεκαδιενοϊκό οξύ. (2S,4S)-4-HTH,(2S,4S)-4-Υδροξυ-2,3,4,5-τετραϋδροδιπικολινικό; α-ΑΡΝ, αΑμινοπροπιονονιτρίλιο; DHA, Dehydroascorbate; GABA, 4-αμινοβουτανοϊκό; MDHA, μονοδεϋδροασκορβικό; 4-AB-ate, 4-Acetamidobutanoate; 4-AB-nal, 4-Acetamidobutanal; Oleoyl-acp, Oleoyl-[ακυλο πρωτείνη φορέα]; O-SHS, Ο-ηλεκτρυλοομοσερίνη;(S)-AMDLP, (S)-αμινομεθυλδιυδρολιποϋλπρωτεΐνη; Succinate SA, Succinate semialdehyde.

Ομαδοποιήσαμε περαιτέρω τις αντιδράσεις σε τέσσερις ομάδες: Η ομάδα 1 (Εικόνα 3Α και συμπληρωματικά σχήματα 7Α, 8Α) αντιπροσωπεύουν αντιδράσεις οι οποίες κατά μέσο όρο αυξήθηκαν ή μειώθηκαν σε αφθονία σε μεταλλάκτες ADT KO σε σύγκριση με δείγματα WT για δεδομένα μεταγραφής, πρωτεΐνης και μεταβολίτη. Το σύμπλεγμα 2 (Εικόνα 3Β και συμπληρωματικά σχήματα 7Β, 8Β) απεικονίζει αντιδράσεις KEGO όπου οι μεταβολίτες και τα πρωτεϊνικά KEGO είτε αυξήθηκαν είτε μειώθηκαν μαζί σε αφθονία στις γραμμές ADT KO σε σύγκριση με το WT, και όπου τα μεταγραφήματα είχαν αντίθετη αλλαγή αφθονίας σε μεταβολίτες. Η ομάδα 3 (Εικόνα 3C και συμπληρωματικά σχήματα 7C, 8C) είναι αντιδράσεων όπου τα μεταγραφήματα και οι μεταβολίτες είτε αυξήθηκαν είτε μειώθηκαν μαζί σε αφθονία στις γραμμές ADT KO σε σύγκριση με το WT, και όπου οι πρωτεΐνες εμφάνισαν την αντίθετη αλλαγή αφθονίας. και Cluster 4 (Εικόνα 3D και συμπληρωματικά σχήματα 7D,

Παράλληλα με τις τιμές z-score για κάθε KEGO και μεταβολίτη, προστέθηκαν δείκτες για να δείξουν την αντίδραση που αντιπροσώπευε το πιο άφθονο KEGO για πολλαπλές αντιδράσεις KEGO για έναν δεδομένο μεταβολίτη. Προστέθηκαν επίσης δείκτες για τους οποίους η αφθονία KEGO συσχετίστηκε περισσότερο με την αφθονία των μεταβολιτών. Επιπρόσθετα, οι αντιδράσεις KEGO ομαδοποιήθηκαν περαιτέρω σε κατηγορίες για το εάν ο ανιχνευόμενος μεταβολίτης ήταν είτε υπόστρωμα είτε προϊόν σε κάθε αντίδραση ή εάν θα μπορούσε να εμπλέκεται σε μια αναστρέψιμη αντίδραση (δηλ. μεταβολίτης που μπορεί να χρησιμεύσει και ως υπόστρωμα και ως προϊόν).

Το Σχήμα 4 δείχνει την κατανομή των τύπων αντίδρασης (μονόδρομο υπόστρωμα προς το προϊόν ή αναστρέψιμο) και την αναλογία κάθε τύπου αντίδρασης με τα KEGO που σχετίζονται περισσότερο με τα επίπεδα μεταβολίτη και τα KEGO με τη μεγαλύτερη αφθονία (όταν υπάρχουν πολλαπλά KEGO για έναν δεδομένο μεταβολίτη). Είναι ενδιαφέρον ότι για τα δεδομένα πρωτεϊνών KEGO, όπου ένας δεδομένος τύπος αντίδρασης έδειξε την υψηλότερη αναλογία των πιο άφθονων KEGO, είχε στη συνέχεια τη μικρότερη αναλογία υψηλότερων συσχετισμών μεταξύ της αφθονίας πρωτεΐνης και μεταβολίτη (Εικόνες 4B,C). Κατά τη σύγκριση των αλλαγών της πρωτεΐνης KEGO και της αφθονίας μεταβολιτών, παρατηρήσαμε επίσης ότι τα KEGO με την υψηλότερη αφθονία δεν ήταν συνήθως τα πιο συνδεδεμένα με το ανιχνευμένο επίπεδο μεταβολίτη (Εικόνα 4), δηλαδή, τα περισσότερα άφθονα ένζυμα δεν παρήγαγαν απαραίτητα τον περισσότερο μεταβολίτη. Δεδομένου ότι οι αφθονίες μεταβολιτών καθορίζονται από πολλούς παράγοντες που δεν αντιπροσωπεύονται από την αφθονία των ενζύμων (δηλαδή, κινητική ενζύμων, διαφορικοί ρυθμοί αποικοδόμησης και μετα-μεταφραστική απενεργοποίηση ενζύμων), αυτή η παρατήρηση δεν προκαλεί έκπληξη. Πράγματι, μπορούμε να γενικεύσουμε ότι μόνο το ~45-50% (Εικόνα 4Δ) από τα πιο άφθονα KEGO παρήγαγαν επίπεδα μεταβολιτών που συσχετίστηκαν περισσότερο με την αφθονία KEGO. Τα επίπεδα μεταβολίτη που ελέγχονται από άλλα KEGO, με χαμηλές συσχετίσεις με τα επίπεδα μεταβολιτών, μπορεί επίσης να επηρεαστούν από την κινητική των ενζύμων και τη μετα-μεταφραστική ενεργοποίηση/απενεργοποίηση. Το Σχήμα 4Ε έδειξε ότι στο Cluster 2 (δηλαδή, τα μεταγραφήματα συσχετίζονται αρνητικά με τις πρωτεΐνες και τους μεταβολίτες) των συγκρίσεων μεταγραφής-μεταβολίτη-πρωτεΐνης, τα πιο άφθονα KEGO υπήρχαν τόσο στα φύλλα όσο και στα στελέχη. Σε αντίθεση, Το Σχήμα 4F είχε αρνητική συσχέτιση τόσο στα φύλλα όσο και στα στελέχη, και στα δεδομένα μεταγραφής και πρωτεΐνης. Το σύμπλεγμα 1 (δηλαδή, το μεταγράφημα, οι πρωτεΐνες και οι μεταβολίτες συσχετίζονται θετικά) και είχε τα υψηλότερα συσχετισμένα προφίλ KEGO με τα προφίλ μεταβολιτών.

Σχήμα 4. Διαγράμματα κατανομής για χάρτες θερμότητας αντίδρασης KEGO που εμφανίζονται στο Σχήμα 3 και συμπληρωματικά σχήματα 7, 8. Κατανομή αντιδράσεων KEGO-μεταβολίτη για ανιχνευθέντες μεταβολίτες που είναι υποστρώματα ή προϊόντα σε μονοκατευθυντικές αντιδράσεις ή αναστρέψιμες αντιδράσεις (Α ) . (Β) Αναλογία κάθε τύπου αντίδρασης KEGO-μεταβολίτη που περιέχει το πιο άφθονο KEGO. (Γ) Αναλογία κάθε τύπου αντίδρασης που περιέχει το πιο συσχετισμένο KEGO προς μεταβολίτη, όταν υπάρχουν πολλά KEGO που αντιδρούν με έναν μεταβολίτη. (Δ) Ποσοστό των υψηλότερων σε αφθονία KEGO που επίσης συσχετίζονται περισσότερο με το επίπεδο μεταβολίτη. (ΜΙ)Αναλογία κάθε συστάδας (που ορίζεται στο Σχήμα 3 και στο Συμπληρωματικό Σχήμα 7) που περιέχει τα πιο άφθονα KEGO. (ΣΤ) Αναλογία κάθε συστάδας που περιείχε τα υψηλότερα συσχετισμένα KEGO με μεταβολίτη, όταν υπάρχουν πολλά KEGO που αντιδρούν στο επίπεδο μεταβολίτη.

Ανάλυση Δικτύου

Τα επίπεδα λιγνίνης μετρήθηκαν προηγουμένως στις γραμμές μετάλλαξης ADT KO και WT από τους Corea et al. (2012c) Ένας συσχετισμός κατάταξης του Spearman μεταξύ του μεταλλάγματος ADT KO και των αναλογιών WT log2 σε αυτά τα επίπεδα λιγνίνης σε μίσχους ηλικίας 4 εβδομάδων υπολογίστηκε έτσι εδώ, με πρωτεΐνες που ταυτοποιήθηκαν με ένα μη παραμετρικό μέτρο συσχέτισης κατάταξης (rho) τουλάχιστον ±0,85 . Οι πρωτεΐνες που προσδιορίστηκε ότι έχουν υψηλή θετική ή αρνητική συσχέτιση με διαφορετικά επίπεδα λιγνίνης μεταξύ των μεταλλαγμάτων ADT KO εισήχθησαν στο εργαλείο ανάλυσης δικτύου STRING (βλ. υποσημείωση κειμένου 7) (Szklarczyk et al., 2017). Οι αλληλεπιδράσεις και οι συσχετίσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης που προσδιορίστηκαν από το STRING χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια ως δεδομένα εισόδου στο λογισμικό δικτύου Cytoscape (Smoot et al., 2011).

Δεδομένα βαθμολογίας Z που αντιπροσωπεύουν αλλαγές αφθονίας μεταξύ μεταλλαγμάτων ADT KO και WT επικαλύφθηκαν σε πρωτεΐνες (κόμβους), με πάχη γραμμής (άκρες) πρωτεϊνών σύνδεσης που αντιπροσωπεύουν πιθανή ισχύ πρωτεϊνικής σύνδεσης όπως υπολογίστηκε με ανάλυση STRING. Οι πρωτεΐνες που βρέθηκαν να είναι εγγύς στις αρχικές αναλύσεις δικτύου Cytoscape ομαδοποιήθηκαν περαιτέρω χειροκίνητα σε λειτουργικές κατηγορίες KEGG για να τονιστούν οι σχέσεις μεταξύ λειτουργικών κατηγοριών. Το συμπληρωματικό Σχήμα 9Β δείχνει μια ανάλυση δικτύου στελέχους που δείχνει τις αλλαγές του βαθμού z πολλαπλών μεταλλαγμάτων ADT KO έναντι αναλύσεων WT. Καθώς περισσότεροι ADTs (και συγκεκριμένα ADT3, ADT4 και ADT5) αποκλείστηκαν και τα επίπεδα λιγνίνης μειώθηκαν (Συμπληρωματικό Σχήμα 9Α), η αφθονία των πρωτεϊνών αποκλίνει περισσότερο από τα επίπεδα WT, όπως υποδεικνύεται από τους κόμβους που εμφανίζονται πιο σκούρο κόκκινο ή μπλε (Συμπληρωματικό Σχήμα 9Β ).

Το σχήμα 5Α δείχνει συγκεκριμένα την ανάλυση δικτύου των δεδομένων στελέχους adt3/4/5 σε σύγκριση με το WT, με το μετάλλαγμα ADT KO να έχει τη μεγαλύτερη μείωση στα επίπεδα λιγνίνης (διασπώμενο μονομερές G S) όπως μετρήθηκε σε στελέχη Arabidopsis ηλικίας 4 εβδομάδων (Συμπληρωματικό Σχήμα 9Α )–αν και η διαφορά επιπέδου λιγνίνης μεταξύ adt3/4/5 και adt3/4/5/6 δεν ήταν στατιστικά διαφορετική. Ένζυμα που σχετίζονται με το μεταβολισμό των αρωματικών αμινοξέων, της φωτοσύνθεσης, των καροτενοειδών και του α-λινολενικού οξέος βρέθηκαν να συσχετίζονται προφανώς με μειωμένα επίπεδα λιγνίνης και αυτό επιβεβαιώθηκε καλά με τις λειτουργικές κατηγορίες KEGG που αναγνωρίστηκαν ότι αλλάζουν σημαντικά (Συμπληρωματικό Σχήμα 6Α). Καθώς η εστίασή μας ήταν στον εντοπισμό πιθανών πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη λιγνίνη στη μετα-μεταγραφική ρύθμιση, Επισημάνθηκαν γνωστές και προβλεπόμενες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών επεξεργασίας του mRNA και του μηχανήματος μετάφρασης (βλ. Εικόνα 5Β). Το Σχήμα 5C εμφανίζει τον χάρτη θερμότητας των αντίστοιχων log2 z-score δεδομένων μεταγραφής και πρωτεΐνης που εξετάστηκαν εξονυχιστικά από τον μηχανισμό επεξεργασίας και μετάφρασης mRNA και για τις 8 γραμμές ADT KO (Εικόνα 5Β).

Εικόνα 5. Ανάλυση δικτύου και σχετικοί συσχετισμοί. (Α) Ανάλυση δικτύου της σχετικής αφθονίας πρωτεϊνών που προσδιορίστηκε ότι συσχετίζεται σε μεγάλο βαθμό σε μια ανάλυση συσχέτισης κατάταξης Spearman (rho gt; 0,85) σε επίπεδα μονομερούς γουαϊακυλίου (G) συριγγυλίου (S) διασπασμένης λιγνίνης σε ιστούς βλαστοκυττάρων ηλικίας 4 εβδομάδων adt3/4/ 5. Οι κόμβοι αντιπροσωπεύονται από ορθογώνια χρωματισμένα με το z-score των αναλογιών log2 (ADT KO mutant/WT), όπου το κόκκινο αντιπροσωπεύει πρωτεΐνες υψηλότερη σε αφθονία στο μετάλλαγμα σε σύγκριση με το WT, το μπλε αντιπροσωπεύει πρωτεΐνες υψηλότερη σε αφθονία στο WT σε σύγκριση με το ADT KO μεταλλαγμένο, και το λευκό αντιπροσωπεύει πρωτεΐνες αμετάβλητες σε αφθονία μεταξύ του WT και του μεταλλάγματος ADT KO. (ΣΙ)Ανάλυση STRING με αποκλειστικά υψηλά συσχετισμένες πρωτεΐνες που εντοπίστηκαν σε λειτουργικές κατηγορίες KEGG που σχετίζονται με μεταφορά ριβοσωμάτων, ματίσματος και RNA που δείχνει τις άμεσες γνωστές και προβλεπόμενες αλληλεπιδράσεις. (Γ) Χάρτης θερμότητας που δείχνει κατανομή αναλογίας log2 (μετάλλαγμα ADT KO/WT) για πρωτεΐνες που σχετίζονται με τη μεταφορά ριβοσώματος, ματίσματος και RNA για κάθε φυτική σειρά για δεδομένα μεταγραφής και πρωτεΐνης.

Συζήτηση

Για να ξεκινήσουμε να θέσουμε τις αναλύσεις και τη συζήτηση παρακάτω στο απαραίτητο πλαίσιο, είναι ευρέως γνωστό ότι οι μεταγραφές και οι πρωτεΐνες συνδέονται βιολογικά με το κεντρικό δόγμα που ισχυρίζεται ότι η ροή γενετικών πληροφοριών από το DNA στο RNA προς τις πρωτεΐνες είναι μονής κατεύθυνσης (Crick, 1958). Πράγματι, οι συγκρίσεις μεταξύ πρωτεωμικών και μεταγραφικών δεδομένων μπορούν να υπογραμμίσουν ποιες πρωτεΐνες και μεταγραφήματα έχουν συνρυθμιστική απόκριση (δηλ. υψηλό επίπεδο μεταγραφής με υψηλό επίπεδο πρωτεΐνης). Το κεντρικό δόγμα ωστόσο επεκτείνεται σε αυτή τη μελέτη για να συμπεριλάβει τη μεταβολομική, καθώς πολλοί μεταβολίτες αντιπροσωπεύουν το τελικό προϊόν(α) που βιοσυντίθεται από συγκεκριμένα κύτταρα/ιστούς υπό διάφορες περιβαλλοντικές συνθήκες ή μέσω καταπονήσεων σε συγκεκριμένους χρόνους κατά τη διάρκεια ζωής ενός οργανισμού.

Συγκρίσεις πρωτεϊνών και μεταγραφών

Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώθηκε ότι τα δεδομένα μεταγραφής και πρωτεΐνης μεταξύ μεταλλαγμάτων ADT KO συσχετίστηκαν καλά με τις δικές τους ομάδες (δηλαδή, μεταγραφή σε μεταγραφή ή συγκρίσεις πρωτεΐνης προς πρωτεΐνη). Ωστόσο, οι συσχετίσεις κατά μέσο όρο ήταν αρκετά χαμηλές για συγκρίσεις μεταγραφής προς πρωτεΐνες, όντας καλύτεροι αλλά ακόμα σχετικά χαμηλοί για συγκρίσεις μεταγραφής προς πρωτεΐνη KEGO/οικογένεια γονιδίου. Τα διαγράμματα Venn που απεικονίζουν την επικάλυψη μεταξύ πρωτεϊνών και μεταγραφών αποκάλυψαν ότι (α) τα περισσότερα μεταγραφήματα που ανιχνεύθηκαν δεν αντιστοιχούσαν σε ανιχνεύσιμη πρωτεΐνη, πιθανότατα λόγω του δυναμικού εύρους και των ορίων δειγματοληψίας της τεχνολογίας πρωτεομικής σε σύγκριση με το βάθος κάλυψης που είναι ικανό με RNA-Seq και (β) δεν αντιστοιχούσαν όλες οι πρωτεΐνες που ανιχνεύθηκαν σε ανιχνεύσιμο μεταγράφημα (Εικόνα 2) όπως θα μπορούσε να προκύψει από διαφορικούς ρυθμούς αποικοδόμησης mRNA και πρωτεΐνης. Ωστόσο, η έλλειψη υψηλών συσχετίσεων μεταξύ μεταγραφών και πρωτεϊνών έχει βρεθεί ότι είναι χαρακτηριστική. Σε πολλές πολυ-ομικές αξιολογήσεις, στα ευκαρυωτικά και προκαρυωτικά συστήματα, τα μεταγραφήματα και οι πρωτεΐνες συσχετίζονται μόνο σε μέτρια σχέση (Foss et al., 2007; Ghazalpour et al., 2011; Battle et al., 2015; Chick et al., 2016; Hasin. et al., 2017). Δύο παραδείγματα από φυτικούς και ζωικούς οργανισμούς τονίζουν αυτό το σημείο. Σε μια έρευνα πολλαπλών ωμικών για τον αραβόσιτο, οι Walley et al. (2016) παρατήρησε ότι τα προφίλ αφθονίας μεταγραφομένων και πρωτεοειδών έδειξαν μικρή επικάλυψη. Σε μια συγκρίσιμη μελέτη της ανθρώπινης νόσου, οι Hasin et al. (2017) διαπίστωσε ότι τα επίπεδα μεταγραφής συχνά εμφάνιζαν φτωχή συσχέτιση με τα επίπεδα πρωτεΐνης, αν και θεωρήθηκε ότι τα πρωτεομικά δεδομένα από μόνα τους ήταν πιο κοντά στους μηχανισμούς της νόσου. Σε πολλές πολυ-ομικές αξιολογήσεις, στα ευκαρυωτικά και προκαρυωτικά συστήματα, τα μεταγραφήματα και οι πρωτεΐνες συσχετίζονται μόνο σε μέτρια σχέση (Foss et al., 2007; Ghazalpour et al., 2011; Battle et al., 2015; Chick et al., 2016; Hasin. et al., 2017). Δύο παραδείγματα από φυτικούς και ζωικούς οργανισμούς τονίζουν αυτό το σημείο. Σε μια έρευνα πολλαπλών ωμικών για τον αραβόσιτο, οι Walley et al. (2016) παρατήρησε ότι τα προφίλ αφθονίας μεταγραφομένων και πρωτεοειδών έδειξαν μικρή επικάλυψη. Σε μια συγκρίσιμη μελέτη της ανθρώπινης νόσου, οι Hasin et al. (2017) διαπίστωσε ότι τα επίπεδα μεταγραφής συχνά εμφάνιζαν φτωχή συσχέτιση με τα επίπεδα πρωτεΐνης, αν και θεωρήθηκε ότι τα πρωτεομικά δεδομένα από μόνα τους ήταν πιο κοντά στους μηχανισμούς της νόσου. Σε πολλές πολυ-ομικές αξιολογήσεις, στα ευκαρυωτικά και προκαρυωτικά συστήματα, τα μεταγραφήματα και οι πρωτεΐνες συσχετίζονται μόνο σε μέτρια σχέση (Foss et al., 2007; Ghazalpour et al., 2011; Battle et al., 2015; Chick et al., 2016; Hasin. et al., 2017). Δύο παραδείγματα από φυτικούς και ζωικούς οργανισμούς τονίζουν αυτό το σημείο. Σε μια έρευνα πολλαπλών ωμικών για τον αραβόσιτο, οι Walley et al. (2016) παρατήρησε ότι τα προφίλ αφθονίας μεταγραφομένων και πρωτεοειδών έδειξαν μικρή επικάλυψη. Σε μια συγκρίσιμη μελέτη της ανθρώπινης νόσου, οι Hasin et al. (2017) διαπίστωσε ότι τα επίπεδα μεταγραφής συχνά εμφάνιζαν φτωχή συσχέτιση με τα επίπεδα πρωτεΐνης, αν και θεωρήθηκε ότι τα πρωτεομικά δεδομένα από μόνα τους ήταν πιο κοντά στους μηχανισμούς της νόσου. 2011; Battle et al., 2015; Chick et al., 2016; Hasin et al., 2017). Δύο παραδείγματα από φυτικούς και ζωικούς οργανισμούς τονίζουν αυτό το σημείο. Σε μια έρευνα πολλαπλών ωμικών για τον αραβόσιτο, οι Walley et al. (2016) παρατήρησε ότι τα προφίλ αφθονίας μεταγραφομένων και πρωτεοειδών έδειξαν μικρή επικάλυψη. Σε μια συγκρίσιμη μελέτη της ανθρώπινης νόσου, οι Hasin et al. (2017) διαπίστωσε ότι τα επίπεδα μεταγραφής συχνά εμφάνιζαν φτωχή συσχέτιση με τα επίπεδα πρωτεΐνης, αν και θεωρήθηκε ότι τα πρωτεομικά δεδομένα από μόνα τους ήταν πιο κοντά στους μηχανισμούς της νόσου. 2011; Battle et al., 2015; Chick et al., 2016; Hasin et al., 2017). Δύο παραδείγματα από φυτικούς και ζωικούς οργανισμούς τονίζουν αυτό το σημείο. Σε μια έρευνα πολλαπλών ωμικών για τον αραβόσιτο, οι Walley et al. (2016) παρατήρησε ότι τα προφίλ αφθονίας μεταγραφομένων και πρωτεοειδών έδειξαν μικρή επικάλυψη. Σε μια συγκρίσιμη μελέτη της ανθρώπινης νόσου, οι Hasin et al. (2017) διαπίστωσε ότι τα επίπεδα μεταγραφής συχνά εμφάνιζαν φτωχή συσχέτιση με τα επίπεδα πρωτεΐνης, αν και θεωρήθηκε ότι τα πρωτεομικά δεδομένα από μόνα τους ήταν πιο κοντά στους μηχανισμούς της νόσου.

Επιπλέον, τα επίπεδα μεταβολιτών δεν έδειξαν κυρίαρχη συσχέτιση ούτε με μεταγραφές ούτε με πρωτεΐνες. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν τους περιορισμούς στη χρήση μόνο μίας ωμικής αξιολόγησης για την πραγματοποίηση βιολογικών αξιολογήσεων σε επίπεδο συστημάτων. Οι συγκρίσεις μεταξύ αυτών των συνόλων δεδομένων omics μπορεί επομένως να αποκαλύψουν (α) ποιες μεταγραφές μεταφράζονται στην πραγματικότητα και σε ποιο αριθμό αντιγράφων, και (β) ποια μεταβολομικά δεδομένα βοηθούν να αποκαλυφθεί ποιες πρωτεΐνες ή οικογένειες πρωτεϊνών είναι περισσότερο ή λιγότερο ενεργές στην παραγωγή των παρατηρούμενων μεταβολιτών. Η ολοκληρωμένη ανάλυση “omics”, όπως παρουσιάζεται εδώ, παρέχει γενικές και συγκεκριμένες πληροφορίες για το μόριο, οι οποίες είναι χρήσιμες για την κατανόηση των γενικών τάσεων των μοριακών μονοπατιών και για τον εντοπισμό στόχων ενδιαφέροντος για σκοπούς βιομηχανικής ή για επακόλουθες αναλύσεις.

Η ανάλυση δικτύου αποκαλύπτει πρωτεΐνες που σχετίζονται με τη βιοσύνθεση λιγνίνης/φαινυλοπροπανοειδούς

Η ανάλυση δικτύου είναι ένα ισχυρό εργαλείο για την κατανόηση των επιπτώσεων της βιολογίας των συστημάτων, αντλώντας από γνωστές και προβλεπόμενες άμεσες (φυσικές) και έμμεσες (λειτουργικές) αλληλεπιδράσεις από πολλαπλές πηγές δεδομένων και βιβλιογραφίας. Τέτοιες αναλύσεις μπορούν να χρησιμοποιήσουν σχέσεις ενζύμων που προέρχονται από εκατοντάδες πηγές (π.χ. υβρίδιο ζυμομύκητα δύο, συνεντοπισμός, συνέκφραση, εξόρυξη κειμένων βιβλιογραφίας, κ.λπ.). Με τη σειρά του, αυτό μπορεί να βοηθήσει στην παροχή νέων γνώσεων σχετικά με τις διασυνδέσεις και τις σημαντικές σχέσεις πρωτεϊνών με γνωστή και μέχρι στιγμής άγνωστη λειτουργία. Δεδομένου ότι η κύρια εστίασή μας ήταν σε πρωτεΐνες που δυνητικά σχετίζονται με αλλοιωμένα επίπεδα λιγνίνης (όπως προσδιορίζεται από την ανάλυση θειοοξεόλυσης), επιλέξαμε αυτές με τις μεγαλύτερες θετικές και αρνητικές τάσεις συσχέτισης με τις ποσότητες λιγνίνης που υπάρχουν σε στελέχη Arabidopsis κάθε γραμμής.

Σε κεντρική τοποθεσία στο δίκτυο πρωτεϊνών που συσχετίζεται με λιγνίνη, τα δεδομένα που δημιουργήθηκαν (Εικόνες 5Α, Β) ήταν έντεκα ριβοσωμικές υπομονάδες που συσχετίστηκαν με μειωμένα επίπεδα λιγνίνης. Αυτό αύξησε την πιθανότητα ότι τα επίπεδα λιγνίνης μπορεί να ρυθμίζονται εν μέρει από ένα φίλτρο ριβοσώματος ή «ριβοκώδικα» (Mauro and Edelman, 2002· Xue and Barna, 2012). Δηλαδή, η ρύθμιση της βιοσύνθεσης λιγνίνης μπορεί να σχετίζεται με την παρουσία ειδικών ριβοσωμικών υπομονάδων που εμπλέκονται στη μετάφραση του mRNA που σχετίζεται με τη βιοσύνθεση λιγνίνης.

Πρόσφατες μελέτες έχουν τεκμηριώσει στοιχεία για ριβοκώδικες, η έννοια των οποίων υποδηλώνει διαφορική, χρονική και χωρική παρουσία συγκεκριμένων ριβοσωμικών υπομονάδων που μεταφράζουν κατά προτίμηση συγκεκριμένα mRNA, αντιπροσωπεύοντας έτσι τη ρύθμιση στη μετάφραση. Άλλες παρατηρήσεις για πιθανούς ριβοκώδικες φυτών περιλαμβάνουν μελέτες ανεπάρκειας φωσφορικών και σιδήρου από τους Rodríguez-Celma et al. (2013) και Wang et al. (2013), οι οποίοι και οι δύο έδειξαν στοιχεία για αναδιαμορφωμένο μεταφραστικό μηχανισμό ως απόκριση σε περιβαλλοντικά σήματα στο Arabidopsis. Οι Liu et al. (2012) ανέφερε επίσης ότι ο μεταφραστικός έλεγχος ήταν ανεξάρτητος από την αφθονία του mRNA, καταλήγοντας στο συμπέρασμα ότι τα επίπεδα mRNA είχαν μικρότερη επίδραση στη γονιδιακή δραστηριότητα από τους μηχανισμούς μεταφραστικού ελέγχου στο Arabidopsis.

Άλλοι πιθανοί στόχοι της ρύθμισης της βιοσύνθεσης λιγνίνης που εντοπίστηκαν περιελάμβαναν εκείνους που σχετίζονται με το μεταβολισμό πουρίνης, το μάτισμα, την αποικοδόμηση RNA, την επιτήρηση του mRNA και τις γενικές πρωτεΐνες επεξεργασίας mRNA. Οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, η μεταφορά πρωτεϊνών και οι μηχανισμοί στόχευσης φάνηκαν επίσης να συσχετίζονται με διαφορετικά επίπεδα λιγνίνης. Επιπρόσθετα, ταυτοποιήθηκε η μετα-μεταφραστική σχετιζόμενη πρωτεϊνική επεξεργασία που περιλαμβάνει το ενδοπλασματικό δίκτυο, καθώς και πρωτεόλυση ουβικιτίνης, φωσφορυλίωση, αυτοφωσφορυλίωση και πρωτεΐνες φωσφατάσης που μπορεί να συνδέονται με σημαντικές διεργασίες που σχετίζονται με τη βιοσύνθεση λιγνίνης.

Στην ανάλυσή μας ως προς το τι συνδέει το μάτισμα, το οποίο επεξεργάζεται το φυσικό mRNA σε ώριμο μεταφράσιμο mRNA και τις ριβοσωμικές υπομονάδες, ήταν η πρωτεΐνη ματίσματος DRH1 (At3g01540) με τη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα RPL2.1 (ATCG00830) (Εικόνα 5Β). Το DRH1 είναι μια εξαρτώμενη από ATP/dATP RNA ελικάση και εξαρτώμενη από πολυνουκλεοτίδιο ΑΤΡάση (Okanami et al., 1998). Η εξαγωγή του πολυ(Α)( ) RNA έχει αποδειχθεί ότι εμποδίζεται σε μεγάλο βαθμό σε μεταλλάγματα DRH1 (Du et al., 2016). Η παρουσία ή η απουσία αυτής της ελικάσης θα μπορούσε έτσι να χρησιμεύσει ως επίπεδο ρύθμισης, αποκλεισμού ή επιτρέποντας την εξαγωγή του mRNA στο κυτταρόπλασμα.

Συνδεδεμένο με τις ταυτοποιημένες πρωτεΐνες ματίσματος ήταν το SAP18 (Song and Galbraith, 2006). Στα φυτά, αυτό λειτουργεί ως μεταγραφικός καταστολέας και συνδέεται με παράγοντες δέσμευσης στοιχείων που ανταποκρίνονται στο αιθυλένιο για να δημιουργήσει ένα σύμπλεγμα πολυμερούς καταστολέα ευαίσθητο στην ορμόνη υπό συνθήκες στρες. Μια μετάλλαξη απώλειας λειτουργίας SAP18 παράγει ένα φυτό τόσο πιο ευαίσθητο στο αλάτι όσο και μειωμένο στη σύνθεση χλωροφύλλης.

Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν αυτό που γενικά παρατηρήσαμε με τα δεδομένα πολλαπλών ομικών μας, δηλαδή ότι: (α) παρά τη σημαντική παρουσία του mRNA, υπάρχουν πρόσθετοι παράγοντες που μπορεί να εμποδίσουν τη σωστή επεξεργασία του mRNA σε ώριμη μεταφράσιμη μορφή. (β) υπάρχουν επίσης άλλοι παράγοντες που μπορεί να εμποδίσουν οποιοδήποτε mRNA που υπάρχει να φύγει ποτέ από τον πυρήνα για να μεταφραστεί.

Μαζί, αυτά τα δεδομένα υπογραμμίζουν επίσης τη σημασία της πρωτεϊνικής για να φωτίσει ποια προϊόντα πρωτεΐνης υπάρχουν στην πραγματικότητα και ποια είναι δυνητικά λειτουργικά.

Επιπλέον, η συντριπτική πλειοψηφία της έρευνας για τη ρύθμιση της βιοσύνθεσης λιγνίνης μέχρι στιγμής έχει επικεντρωθεί στα γονίδια και τον μεταγραφικό έλεγχο (Nakano et al., 2015). Από αυτό το σύνολο γνώσεων, γνωρίζουμε ότι η βιοσύνθεση λιγνίνης επηρεάζεται από μια σειρά παραγόντων μεταγραφής, όπως οι κύριοι διακόπτες NAC, οι οποίοι μπορούν να ενεργοποιήσουν ή να καταστείλουν μια σειρά από άλλους μεταγραφικούς παράγοντες κατάντη (π.χ. MYB). Αυτό που είναι λιγότερο γνωστό είναι ποιοι πρόσθετοι μετα-μεταγραφικοί έλεγχοι λιγνίνης ή άλλων φαινυλοπροπανοειδών υπάρχουν. Λόγω της ανακάλυψής μας ότι η διαμόρφωση ADT παράγει διαφορικά περιεχόμενα λιγνίνης στο Arabidopsis, παρουσιάστηκε η ευκαιρία όπου –μέσω αυτής της μελέτης πολλαπλών ομικών– θα μπορούσαμε να διερευνήσουμε μοριακά προφίλ με σταδιακές μειώσεις ή αυξήσεις στο lockstep σε διαφορετικά επίπεδα λιγνίνης.

Δεδομένου ότι αυτή η μελέτη επικεντρώθηκε σε συσχετίσεις ειδικές για την εναπόθεση λιγνίνης, η μεγαλύτερη προσοχή δόθηκε στα σχετικά επίπεδα που βρέθηκαν στους μίσχους, αν και άλλα βιομόρια που προέρχονται από φαινυλοπροπανοειδή και άλλες οδοί επηρεάστηκαν επίσης από αλλαγές στη σύνθεση της ADT στα φύλλα. Μπορεί να είναι μια ενδιαφέρουσα και κατατοπιστική άσκηση η περαιτέρω διερεύνηση της συσχετιστικής αφθονίας ενζύμων με άλλα φαινυλοπροπανοειδή που μπορεί να διαδραματίσουν πιο κεντρικό ρόλο στη λειτουργία του ιστού των φύλλων. Για παράδειγμα, αυτά που σχετίζονται με την προστασία από την υπεριώδη ακτινοβολία (π.χ. φλαβονοειδή και εστέρες σιναπικού) (Stapleton and Walbot, 1994· Landry et al., 1995· Mazza et al., 2000· Clé et al., 2008· Sullivan et al., 2014 ), προκειμένου να πειραχτεί η ειδική μετα-μεταγραφική ρύθμιση της βιοσύνθεσης του σχηματισμού αυτών των άλλων φαινυλοπροπανοειδών.

Τελικά, η έρευνα πολλαπλών ομικών και η ανάλυση δικτύου που παρουσιάστηκαν εδώ αποδείχθηκαν ανεκτίμητες για την κατανόηση των αλλαγών στο επίπεδο των συστημάτων που προκαλούν οι τροποποιημένες ADT σε ένα μοντέλο αγγειακό φυτό. Είναι σημαντικό ότι τόνισε δυνητικά νέα επίπεδα μεταμεταγραφικής ρύθμισης λιγνίνης/φαινυλοπροπανοειδών που μπορούν προσωρινά να χρησιμεύσουν ως βιομοριακοί στόχοι για επακόλουθες αναλύσεις ή/και για σκοπούς βιομηχανικής, π. Αυτές οι πρωτεΐνες μπορούν επομένως να χρησιμοποιηθούν σε επακόλουθες μελέτες επικύρωσης ενζύμων που σχετίζονται με τη λιγνίνη ή/και μπορούν ενδεχομένως να χρησιμεύσουν ως πραγματικά νέοι στόχοι βιομηχανικής για τον χειρισμό των επιπέδων λιγνίνης/φαινυλοπροπανοειδούς σε αγγειακά φυτά.

Δυνατότητα ενός “Ribocode” που ρυθμίζει τη λιγνίνη

Τα ριβοσώματα είναι οι τελεστές στα τελικά στάδια της γονιδιακής έκφρασης και πρόσφατα αναδείχθηκε ότι τα ίδια τα ριβοσώματα θα μπορούσαν να συμβάλουν στη ρύθμιση μέσω της διαφορικής αφθονίας ριβοσωμικών υπομονάδων. Πρόσφατα στοιχεία έδειξαν επίσης ότι σύμφωνα με τις αναπτυξιακές, περιβαλλοντικές και παθολογικές συνθήκες, τα κύτταρα μπορούν να παράγουν διαφορετικούς πληθυσμούς ριβοσωμάτων που διαφέρουν ως προς τη σύσταση ριβοσωμικών πρωτεϊνών και RNA. Αυτά τα «εξειδικευμένα ριβοσώματα» υποδηλώνουν ότι η μοναδική ριβοσωμική σύνθεση καθορίζει τη μεταφραστική δραστηριότητα του ριβοσώματος και έτσι ελέγχει τη βιοσύνθεση συγκεκριμένων πρωτεϊνών και ενζύμων. Για πολλά χρόνια, τα ριβοσώματα θεωρούνταν ότι αποτελούνταν από έναν καθορισμένο αριθμό ριβοσωμικών πρωτεϊνών (RPs) και rRNAs, με κάθε RP να υπάρχει ως ένα μόνο αντίγραφο με προκύπτουσα συντηρημένη στοιχειομετρία και ομοιογένεια. Μία από τις πρώτες ενδείξεις ότι υπήρχαν διαφορετικοί τύποι ριβοσωμάτων ήταν από τη μελέτη των παραλόγων RP στα φυτά. Σε εργασία που έγινε από τους Williams και Sussex (1995), βρέθηκε ότι τα πρότυπα έκφρασης του παραλόγου γονιδίου RPL16 στο Arabidopsis εκφραζόταν αμοιβαία αποκλειστικά σε διαφορετικά όργανα του φυτού. Σε μελέτες ζυμομύκητα, η διαγραφή συγκεκριμένων παραλόγων RP οδήγησε επίσης σε μοναδικούς φαινοτύπους (Ni and Snyder, 2001· Enyenihi και Saunders, 2003). Σε μελέτες σε ανθρώπους, στοιχεία προήλθαν από ασθενείς που εμφάνιζαν γενετικές ασθένειες (π.χ. ριβοσωμοπάθειες) που προκαλούνται από απλοανεπάρκεια γονιδίων που κωδικοποιούν βασικούς παράγοντες στη βιογένεση ριβοσώματος ή RPs (Draptchinskaia et al., 1999). Οι πρωτεομικές αναλύσεις που διερευνούν τη σύνθεση καθαρισμένων ριβοσωμάτων υπό διάφορες συνθήκες εντόπισαν όλα τα RP που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των συνθηκών σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα ποντικού,

Στη μελέτη μας, χρησιμοποιήσαμε τον αλγόριθμο STRING (βλ. υποσημείωση κειμένου 7) για να προσδιορίσουμε τις συνδέσεις/συσχετίσεις μεταξύ των πρωτεϊνών που σχετίζονται με το προφίλ λιγνίνης. Τα αποτελέσματά μας επέστρεψαν αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών του πυρήνα και του πλαστιδίου (π.χ. RPL2.1 και DRH1). Αν και δεν υπάρχουν επί του παρόντος άμεσες ενδείξεις στο Arabidopsis ότι αυτή η συσχέτιση υπάρχει, υπάρχει αυξανόμενη τεκμηρίωση αλληλεπιδράσεων μεταξύ ομόλογων αυτών των πρωτεϊνών σε άλλους οργανισμούς (π.χ. ανθρώπους, ζυμομύκητες, Escherichia coli και Helicobacter pylori) (Garcia-Gomez et al., 2011 Havugimana et al., 2012). Ωστόσο, θα πρέπει να πραγματοποιηθούν πρόσθετες μελέτες για να επαληθευτεί η πραγματική συσχέτιση, εάν υπάρχει, μεταξύ ευκαρυωτικών και σχετιζόμενων με τη μετάφραση πρωτεϊνών πλαστιδίων στο Arabidopsis.

Αυτές οι μελέτες που υποδεικνύουν την επίδραση της στοιχειομετρίας της διαφορικής ριβοσωμικής υπομονάδας σε διαφορικούς φαινότυπους και/ή μεταφραστικά προϊόντα υποδηλώνουν ότι το ριβόσωμα έχει την ικανότητα να λειτουργεί με ρυθμιστικό τρόπο στη μετάφραση. Αυτά τα υποστηρικτικά δεδομένα, μαζί με τις παρατηρήσεις συσχετίσεων μεταξύ συγκεκριμένων ριβοσωμάτων και παραγωγής λιγνίνης σε αυτήν τη μελέτη εδώ, υποστηρίζουν την υπόθεση ότι τα επίπεδα λιγνίνης στα αγγειακά φυτά μπορεί να ελέγχονται εν μέρει από εξειδικευμένες συνθέσεις ριβοσώματος ή από έναν «ριβοκώδικα» λιγνίνης.

Δήλωση διαθεσιμότητας δεδομένων

Τα σύνολα δεδομένων που παρουσιάζονται σε αυτή τη μελέτη μπορούν να βρεθούν σε διαδικτυακά αποθετήρια. Τα ονόματα του αποθετηρίου/των αποθετηρίων και των αριθμών πρόσβασης είναι: https://massive.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/massive.jsp, MSV000081518; proteom ecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset, PXD007701.

Συνεισφορές Συγγραφέων

KH, CB, ML, LP-T, LD και NL: εννοιολόγηση. KH και JMa: επίσημη ανάλυση. NL, LD και KH: απόκτηση χρηματοδότησης. KH, JMa, JW, JEM, KW, TC, MM, RM, JB, LD και NL: έρευνα και μεθοδολογία. NL, KH, LD, ML και LP-T: διαχείριση έργου. KH και LD: οπτικοποίηση. KH: γραφή–πρωτότυπο προσχέδιο. KH, CB, LD και NL: συγγραφή-αναθεώρηση και επεξεργασία. Όλοι οι συγγραφείς έχουν διαβάσει και έχουν συμφωνήσει με τη δημοσιευμένη έκδοση του χειρογράφου.

Χρηματοδότηση

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από το Τμήμα Χημικών Επιστημών, Γεωεπιστημών και Βιοεπιστημών, το Γραφείο Βασικών Ενεργειακών Επιστημών του DOE (DE-FG-0397ER20259), την Εθνική Υπηρεσία Αεροναυτικής και Διαστήματος (NNX15AG56G) και από το NIH Grant T-32 GM008336 για Εκπαίδευση στη Βιοτεχνολογία. Ένα μέρος αυτής της έρευνας υποστηρίχθηκε επίσης από το πρόγραμμα χρηστών EMSL, μια υποστήριξη του DOE Office of Science User Facility που χρηματοδοτείται από το Γραφείο Βιολογικής και Περιβαλλοντικής Έρευνας και βρίσκεται στο Εθνικό Εργαστήριο Βορειοδυτικού Ειρηνικού.

Σύγκρουση συμφερόντων

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη απουσία εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.

Συμπληρωματικό υλικό

Το συμπληρωματικό υλικό για αυτό το άρθρο βρίσκεται στο διαδίκτυο στη διεύθυνση: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2021.664250/full#supplementary-material

Λιγνίνη, αρογενικές αφυδατάσες, Μεταγραφική, Πρωτεομική, Μεταβολομική, Αναλύσεις Multi-omics, Ανάλυση Δικτύου, Arabidopsis thaliana, Ribocode