Ξετυλίγοντας τις κύριες περιοριστικές τοποθεσίες της φωτοσύνθεσης υπό το θερμικό στρες κάτω και πάνω από το έδαφος στο αγγούρι και τον ανακουφιστικό ρόλο του Luffa Rootstock
- 1 Τμήμα Οπωροκηπευτικών, Πανεπιστήμιο Zhejiang, Hangzhou, Κίνα
- 2 College of Horticulture, Northwest Aamp;F University, Yangling, Κίνα
- 3 Επαρχιακό Βασικό Εργαστήριο Ολοκληρωμένης Βιολογίας Κηπευτικών Φυτών, Χανγκζού, Κίνα
Η φωτοσύνθεση είναι μια από τις πιο θερμοευαίσθητες διαδικασίες στα φυτά. Αν και η σοβαρότητα της θερμικής καταπόνησης θα μπορούσε να μετριαστεί με την προσέγγιση εμβολιασμού, η κύρια κατεστραμμένη θέση του συστήματος φωτοσύνθεσης υπό θερμική καταπόνηση και ο ρυθμιστικός μηχανισμός της θερμικής ανοχής που προκαλείται από το υποκείμενο δεν είναι καλά κατανοητοί. Στην τρέχουσα μελέτη, φυτά αγγουριού που εμβολιάστηκαν στις δικές τους ρίζες και ανθεκτικές στη θερμότητα ρίζες λούφα εκτέθηκαν σε θερμότητα της ζώνης ρίζας (25/40°C) και εναέρια θερμότητα (40/25°C) μεμονωμένα και σε συνδυασμό (40/40 °C) να κατανοήσει την απόκριση της φωτοσυνθετικής διαδικασίας διερευνώντας την απορρόφηση και κατανομή ενέργειας, τη μεταφορά ηλεκτρονίων στο φωτοσύστημα (PS) II και I και την αφομοίωση του CO2. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, το θερμικό στρες στη ζώνη της ρίζας ανέστειλε τη φωτοσύνθεση κυρίως μέσω της μείωσης της δραστηριότητας του Rubisco, ενώ η εναέρια θερμική καταπόνηση κυρίως μέσω της αναστολής της πλευράς δέκτη PSII. Η ανισορροπία στην απορρόφηση και τη χρήση του φωτός είχε ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση ενεργών ειδών οξυγόνου που προκάλεσαν βλάβη στη φωτοσυνθετική συσκευή, σχηματίζοντας έναν φαύλο κύκλο. Αντίθετα, ο εμβολιασμός αγγουριού σε ανθεκτικό στη θερμότητα υποκείμενο λούφα μείωσε τη φωτοσυνθετική αναστολή και το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από τη θερμότητα διατηρώντας υψηλότερη ζωτικότητα της ρίζας, συσσώρευση HSP70 και αντιοξειδωτικό δυναμικό.
Εισαγωγή
Ως άμισχοι οργανισμοί, τα φυτά αντιλαμβάνονται διάφορα περιβαλλοντικά ερεθίσματα που συχνά εμφανίζονται ως στρες, όπως η ακραία θερμοκρασία, η ξηρασία και η αλατότητα στα φυσικά τους οικοσυστήματα. Τα επεισόδια ζέστης, ιδιαίτερα η ακραία και σοβαρότητα των γεγονότων καύσωνα, όπως το κύμα καύσωνα και/ή οι ζεστές μέρες θα γίνουν πιο διαδεδομένα στο μέλλον λόγω της παγκόσμιας κλιματικής αλλαγής (IPCC, 2007). Το θερμικό στρες επηρεάζει σοβαρά τη σταθερότητα των βιομεμβρανών, του RNA, των διαφόρων πρωτεϊνών και των δομών του κυτταροσκελετού και μεταβάλλει την αποτελεσματικότητα των ενζυματικών αντιδράσεων στο κύτταρο, περιορίζοντας έτσι μια σειρά φυσιολογικών διεργασιών (McClung and Davis, 2010; Ruelland and Zachowski, 2010). .
Η φωτοσύνθεση είναι μια σημαντική διαδικασία για την παραγωγή ενέργειας, η οποία είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη στο θερμικό στρες (Berry and Björkman, 1980). Υπάρχουν, τουλάχιστον, τρεις κύριες θέσεις ευαίσθητες στο στρες στον φωτοσυνθετικό μηχανισμό όπως το φωτοσύστημα II (PSII) με τον δότη ηλεκτρονίων (OEC) και τον δέκτη του (QA, PQ) (Heckathorn et al., 1998; Pospisl and Tyystjarvi, 1999 Wen et al., 2005), δέσμευση άνθρακα με τα βασικά ένζυμα όπως η ακτιβάση Rubisco και Rubisco (Crafts-Brandner and Salvucci, 2000; Salvucci and Crafts-Brandner, 2004· Sharkey, 2005) και η θυλακοειδής μεμβράνη (Morgan-K. et al., 2002· Schrader et al., 2004· Vener, 2007). Ωστόσο, εξακολουθεί να υπάρχει ασυμφωνία στη βιβλιογραφία σχετικά με τους πρωταρχικούς στόχους της θερμότητας που προκαλούν αναστολή στη φωτοσύνθεση.
Καθώς οι περισσότερες κυτταρικές αντιδράσεις συνδέονται μεταξύ τους, η διαταραχή που προκαλείται από τη θερμότητα της ροής των μεταβολιτών σε σταθερή κατάσταση οδηγεί τελικά σε συσσώρευση τοξικών παραπροϊόντων, όπως τα ROS που περιλαμβάνουν , H2O2 και ⋅OH. Ως ισχυρό οξειδωτικό, το ROS θα μπορούσε να οδηγήσει σε αποικοδόμηση της χλωροφύλλης και μείωση της φωτοχημικής απόδοσης του φωτοσυστήματος II (PSII) (Woo et al., 2004). Επιπλέον, τα ROS επιταχύνουν τη βλάβη στο PSII καταστρέφοντας την πρωτεΐνη D1 που σχηματίζει ένα ετεροδιμερές με την πρωτεΐνη D2 στο κέντρο αντίδρασης (RC) του PSI (Aro et al., 1993· Andersson and Barber, 1996) και αναστέλλοντας την επιδιόρθωση του φωτοκατεστραμμένου PSII μέσω της καταστολής της de novo σύνθεσης των πρωτεϊνών και της επίδρασης της σταθερότητας της θυλακοειδούς μεμβράνης (Nishiyama et al., 2005, 2006· Sharkey, 2005). Για να αμυνθούν από την τοξικότητα των ROS, τα φυτά έχουν αναπτύξει πολλαπλά συστήματα αποτοξίνωσης,
Για να επιβιώσουν από το θερμικό στρες, τα φυτά έχουν εξελίξει μια ποικιλία αποκρίσεων σε υψηλές θερμοκρασίες που ελαχιστοποιούν τη ζημιά, εξασφαλίζουν τη σωστή κυτταρική ομοιόσταση και επιτρέπουν στον οργανισμό να λειτουργεί κανονικά. Μοριακοί αισθητήρες κατανεμημένοι σε διαφορετικά κυτταρικά διαμερίσματα ανιχνεύουν αυξημένη θερμοκρασία, παράγουν σήματα όπως Ca 2 , H2O2, 4,5-διφωσφορική φωσφατιδυλινοσιτόλη (PIP2) και στη συνέχεια ενεργοποιούν διαφορετικούς μεταγραφικούς ρυθμιστές όπως ο παράγοντας θερμικού σοκ (HSF) μέσω ενεργοποίησης αρκετών ασβεστιοεξαρτώμενων πρωτεϊνικών κινασών (CDPKs) και πολλαπλών κινασών πρωτεΐνης που ενεργοποιούνται από μιτογόνο (MAPKs) (Mittler et al., 2012). Τέλος, ενεργοποιούνται μηχανισμοί προστασίας για τη διατήρηση φυσιολογικών φυσιολογικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης της φωτοσύνθεσης. Οι πρωτεΐνες θερμικού σοκ (HSPs), οι οποίες δρουν ως μοριακές συνοδούς, επάγονται αξιοσημείωτα για να προστατεύουν τις κυτταρικές πρωτεΐνες από μη αναστρέψιμη βλάβη που προκαλείται από τη θερμότητα (Boston et al., 1996). Ομοίως, οι μηχανισμοί δέσμευσης ROS ενεργοποιούνται επίσης για την ανακούφιση του οξειδωτικού στρες που προκαλείται από τη θερμότητα (Larkindale και Knight, 2002· Suzuki και Mittler, 2006).
Η φωτοσυνθετική ικανότητα των φυτών εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη ζωτικότητα των ριζών που διατηρούν τις μεταλλικές και υδάτινες καταστάσεις στα φύλλα μέσω της κατάλληλης απόκτησης ιόντων και νερού από την περιοχή της ριζικής ζώνης. Είναι σημαντικό ότι η πρόσληψη και η μετατόπιση νερού και θρεπτικών ουσιών και ο σχετικός φυσιολογικός και μοριακός μεταβολισμός στα φύλλα ρυθμίζονται από τα σήματα που προέρχονται από τη ρίζα, όπως το αψικικό οξύ (Sauter et al., 2002; Li et al., 2014a). Όταν οι ρίζες υποφέρουν από καταπονήσεις όπως η πίεση νερού και θερμοκρασίας, ο ρυθμός φωτοσύνθεσης μειώνεται δραστικά, ακόμη και κάτω από το μηδέν, ανάλογα με το άκρο της πίεσης. Ως θεραπεία, ο εμβολιασμός ενός ευαίσθητου γονότυπου σε ανεκτικό υποκείμενο θα μπορούσε ουσιαστικά να ανακουφίσει αυτή τη φωτοσυνθετική αναστολή σε δικοτυλήδονα φυτά (Zhou et al., 2007; Li et al., 2014b). Ωστόσο, μέχρι σήμερα,
Το αγγούρι είναι μια από τις σημαντικές καλλιέργειες κηπευτικών, ιδιαίτερα ευαίσθητο στο θερμικό στρες. Προηγουμένως, παρατηρήσαμε ότι ο ρυθμός φωτοσύνθεσης του αγγουριού μειώθηκε σημαντικά υπό θερμική καταπόνηση. Ωστόσο, μια τέτοια αναστολή θα μπορούσε να μετριαστεί χρησιμοποιώντας τη luffa ως υποκείμενο (Li et al., 2014a,b). Στην παρούσα μελέτη, προσπαθήσαμε να διευκρινίσουμε τις πρωταρχικές κατεστραμμένες θέσεις του συστήματος φωτοσύνθεσης μετά από θερμική καταπόνηση και να κατανοήσουμε τον ρυθμιστικό μηχανισμό που ελέγχει τη φωτοσυνθετική βελτίωση στο αγγούρι με τη μεσολάβηση του υποκείμενου luffa. Διερευνήθηκε η απόκριση της φωτοσυνθετικής διαδικασίας, συμπεριλαμβανομένης της απορρόφησης και διανομής ενέργειας, της μεταφοράς φωτοσυνθετικών ηλεκτρονίων, της αφομοίωσης του CO2 και της ζωτικότητας των ριζών, της δημιουργίας και της σάρωσης ROS και της έκφρασης του HSP70 σε διαφορετικά καθεστώτα θερμοκρασίας εναέριας και ριζικής ζώνης.
Υλικά και μέθοδοι
Φυτικά Υλικά και Επεξεργασίες
Χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά εμβολιασμένα φυτά, το αγγούρι (Cucumis sativus L., cv. Jinyan Νο. 4, Cs) εμβολιασμένο σε αγγούρι και η λούφα (Luffa cylindrical Roem., cv. Xiangfei Νο. 236, Lc). Για τα υποκείμενα, οι σπόροι αγγουριού και λούφα σπάρθηκαν απευθείας σε δίσκους γεμάτους με μίγμα τύρφης/βερμικουλίτη (3/1, ν/ν), και για το σπέρμα, σπόροι αγγουριού σπάρθηκαν 7 ημέρες αργότερα. Όταν η κοτυληδόνα του αγγουριού που έχει σπαρθεί για γέμισμα επεκτάθηκε, πραγματοποιήθηκε μια «εμπόλιασμα από την κορυφή της προσέγγισης» (Davis et al., 2008) και οι δύο ομάδες δενδρυλλίων που προέκυψαν χαρακτηρίστηκαν ως Cs/Cs και Cs/Lc σύμφωνα με το είδος του υποκείμενου , αντίστοιχα. Τα εμβολιασμένα φυτά διατηρήθηκαν σε σταθερή υγρασία 95–100%, PPFD 50 μmol m -2 s -1και 25–30°C για 7 ημέρες. Τα σπορόφυτα στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε θαλάμους ανάπτυξης με τις ακόλουθες περιβαλλοντικές συνθήκες: φωτοπερίοδος 12 ωρών, θερμοκρασία 25/18°C (ημέρα/νύχτα) και PPFD 600 μmol m-2 s – 1 . Τα φυτά ποτίζονται καθημερινά και γονιμοποιούνται με θρεπτικό διάλυμα Hoagland κάθε 2 ημέρες. Με την εμφάνιση των πρώτων αληθινών πλήρως διογκωμένων φύλλων, μια ομάδα οκτώ δενδρυλλίων μεταφυτεύθηκε σε ένα δοχείο (40 cm × 25 cm × 15 cm) γεμάτο με θρεπτικό διάλυμα Hoagland.
Στο στάδιο των τεσσάρων φύλλων, τα φυτά Cs/Cs και Cs/Lc εκτέθηκαν σε θερμότητα της ζώνης ρίζας (25/40°C, θερμοκρασία βλαστού/ρίζας), εναέρια θερμότητα (40/25°C) και στη συνδυασμένη θερμότητα ( 40/40°C) όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Li et al., 2014a). Μια φωτοπερίοδος 12 ωρών και PPFD 600 μmol m -2 s -1 διατηρήθηκαν για όλες τις θεραπείες. Μετά από έκθεση σε θερμική επεξεργασία για 48 ώρες, η αφομοίωση του CO2, ο φθορισμός της χλωροφύλλης και η συσσώρευση H2O2 και μετρήθηκαν στο τρίτο φύλλο από τον πυθμένα. Ταυτόχρονα, δείγματα φύλλων και ριζών συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80°C μέχρι να χρησιμοποιηθούν για βιοχημική ανάλυση και ανάλυση μεταγραφής γονιδίων.
Για να μελετηθεί ο ρόλος του HSP70 στην επαγόμενη από τη λούφα ανοχή στη θερμότητα, τα φυτά Cs/Cs και Cs/Lc υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με KNK437 και Quercetin (Sigma–Aldrich), αναστολέα της έκφρασης του γονιδίου HSP70, για 12 ώρες πριν από την επιβολή της θερμικής επεξεργασίας (40/ 40°C). Το KNK437 και η Quercetin διαλύθηκαν σε DMSO για να παρασκευαστεί ένα αποθεματικό διάλυμα 100 mM και αραιώθηκαν στα 200 μM με νερό Milli-Q. Η αντίστοιχη ποσότητα DMSO στο ίδιο ρυθμιστικό χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Μετά από έκθεση σε θερμική επεξεργασία 48 ωρών, ο φθορισμός της χλωροφύλλης μετρήθηκε στο τρίτο φύλλο από τον πυθμένα.
Ανταλλαγή αερίων και μετρήσεις περιεκτικότητας σε χλωροφύλλη
Η ανταλλαγή αερίων των προσκολλημένων φύλλων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή υπέρυθρων αερίων, Li-Cor-6400 (Li-Cor Inc., Lincoln, NE, USA), σε θερμοκρασία 25°C, σχετική υγρασία 85%, κυψελίδα ρυθμός ροής αέρα 500 ml min -1 και συγκέντρωση CO2 περιβάλλοντος 380 μmol mol -1 . Ένα PPFD 1000 μmol m -2 s -1 παρεχόταν από ένα μείγμα κόκκινων και μπλε LED.
Η χλωροφύλλη των φύλλων (chl a και chl b) εκχυλίστηκε σε 80% ακετόνη και προσδιορίστηκε η περιεκτικότητά τους σύμφωνα με τη μέθοδο του Arnon (1949).
Μέτρηση Κβαντικής Απόδοσης και Μεταφοράς Ηλεκτρονίων PSI και PSII
Η κβαντική απόδοση του PSI [Y(I)] και του PSII [Y(II)] των εμβολιασμένων φυτών μετρήθηκε ταυτόχρονα με σύστημα Dual-PAM-100 (Heinz Walz, Γερμανία) στον τρόπο μέτρησης Fluo P700 (Pfündel et al. ., 2008). Όλα τα σπορόφυτα προσαρμόστηκαν στο σκοτάδι για 30 λεπτά πριν από τη μέτρηση του F0, του ελάχιστου φθορισμού, με φως μέτρησης σε χαμηλή ένταση (lt;0,1 μmol m -2 s -1 ). Στη συνέχεια εφαρμόστηκε ένας παλμός κορεσμού (10.000 μmol φωτόνια m -2 s -1 ) για την ανίχνευση Fm (ο μέγιστος φθορισμός μετά την προσαρμογή στο σκοτάδι). Η μέγιστη μεταβολή του σήματος P700 (Pm) μετρήθηκε μέσω εφαρμογής ενός παλμού κορεσμού (10.000 μmol φωτόνια m -2 s -1) μετά από άναμμα μακρυά κόκκινου φωτός για 10 δευτερόλεπτα. Ένας παλμός κορεσμού με διάρκεια 300 ms εφαρμόστηκε κάθε 20 s μετά την έναρξη του ακτινικού φωτός για να προσδιοριστεί το μέγιστο σήμα φθορισμού (Fm′) και το μέγιστο σήμα P700 (Pm′) κάτω από το ακτινικό φως (27 μmol φωτόνια m -2 s -1 ). Η καμπύλη αργής επαγωγής καταγράφηκε για 300 δευτερόλεπτα για να επιτευχθεί η σταθερή κατάσταση της φωτοσυνθετικής συσκευής και στη συνέχεια το ακτινικό φως απενεργοποιήθηκε. Δεδομένα [Y(II), ETR(II), Y(NPQ), Y(NO), Y(I), ETR(I), Y(NA), Y(ND), qP] που προέρχονται από τον τελικό παλμό κορεσμού (Πίνακας 1), καταγράφηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση των δραστηριοτήτων των PSI και PSII. Σύμφωνα με τους Pfündel et al. (2008): Y(I) = (Pm′-P)/Pm, Y(NA) = (Pm-Pm′)/Pm, Y(ND) = (P-Po)/Pm, ETR(I) = 0,5×Y(I)×PAR×0,84μmol×m -2 ×s-1 . Σύμφωνα με τους Kramer et al. (2004): Y(II) = (Fm′-F)/Fm′, ETR(II) = 0,5×Y(II)×PAR×0,84 μmol×m -2 ×s -1, qP = ( Fm ′ / -F)/(Fm′-Fo′), qL = qP(Fo′/F′), NPQ = (Fm-Fm′)/Fm′, Y(NO) = 1/NPQ 1 qL ((Fm /Fo)-1), Y(NPQ) = 1-Y(II)-Y(NO).
ΠΙΝΑΚΑΣ 1. Περιεκτικότητα σε χλωροφύλλη και παράμετροι φθορισμού χλωροφύλλης σε φυτά αγγουριάς, όπως επηρεάζονται από το υποκείμενο και τη ζώνη της ρίζας ή/και την εναέρια θερμική καταπόνηση.
Κινητική φθορισμού χλωροφύλλης και Υπολογισμός παραμέτρων JIP-Test
Τα μεταβατικά φθορισμού Chl a μετρήθηκαν με σύστημα Dual-PAM-100 (Heinz Walz, Γερμανία). Όλα τα δείγματα προσαρμόστηκαν στο σκοτάδι για 15 λεπτά. Τα μεταβατικά στοιχεία φθορισμού χλωροφύλλης καταγράφηκαν έως και 1 δευτερόλεπτο σε λογαριθμική χρονική κλίμακα. Τα δεδομένα λαμβάνονταν κάθε 20 μs. Η κινητική επαγωγής πολυφασικού φθορισμού αναλύθηκε σύμφωνα με το τεστ JIP που αντανακλούσε πολύτιμες πληροφορίες για τη λειτουργία του φωτοσυστήματος II (PSII) (Strasser and Govinjee, 1992). Στην παρούσα μελέτη, τα ακόλουθα δεδομένα ελήφθησαν απευθείας από τις κινητικές καμπύλες ταχείας ανόδου: Η F0 (αρχικός φθορισμός) μετρήθηκε στα 20 μs, όταν όλα τα RC PSII είναι ανοιχτά. F300 μs είναι ο φθορισμός στα 300 μs. Τα Fj και Fi είναι η ένταση φθορισμού στο βήμα J (2 ms) και στο βήμα Ι (30 ms), αντίστοιχα. Fm (μέγιστος φθορισμός) είναι η κορυφή του φθορισμού στο βήμα P όταν όλα τα RC είναι κλειστά. Η περιοχή είναι η συνολική συμπληρωματική περιοχή μεταξύ της καμπύλης επαγωγής φθορισμού. Επιλεγμένες παράμετροι που ποσοτικοποιούν τη συμπεριφορά PSII υπολογίστηκαν από τα αρχικά δεδομένα ακολουθώντας τους τύπους όπως φαίνεται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1 (Strasser and Strasser, 1995; Strasser et al., 2004).
Προσδιορισμός δραστηριότητας Rubisco
Τα κατεψυγμένα δείγματα φύλλων ομογενοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας παγωμένο γουδοχέρι και γουδί με ψυχρό ρυθμιστικό εκχύλισης που περιέχει 50 mM Tris-HCl (ρΗ 7,5), 1 mM αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA), 1 mM MgCl2, 12,5% (v/v) γλυκερίνη, 10%. πολυβινυλοπυρρολιδόνη (PVP) και 10 mM β-μερκαπτοαιθανόλη. Τα ομογενοποιήματα φυγοκεντρήθηκαν στα 15.000 g για 15 λεπτά στους 4°C.
Η δραστηριότητα του Rubisco μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά με σύζευξη σχηματισμού 3-φωσφογλυκερικού οξέος με οξείδωση NADH στους 25°C σύμφωνα με τους Lilley και Walker (1974) με ορισμένες τροποποιήσεις. Η συνολική δραστικότητα προσδιορίστηκε μετά από ενεργοποίηση ενζύμου, η οποία επιτεύχθηκε με προεπώαση για 15 λεπτά σε μίγμα 0,1 ml που περιείχε 33 mM Tris-HCl (ρΗ 7,5), 0,67 mM EDTA, 33 mM MgCl2 και 10 mM NaHC03. Οι αρχικές και ολικές μετρήσεις δραστικότητας Rubisco στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν σε ένα μέσο αντίδρασης 0,1 ml που περιείχε 5 mM HEPES-NaOH (pH 8,0), 1 mM NaHC03, 2 mM MgCl2, 0,25 mM διθειοθρεϊτόλη (DTT), 0,1 mM EDTA, 1 Ucreatine φωσφοκινάση, 1 U 3-φωσφογλυκερική φωσφοκινάση, 1 U γλυκεραλδεΰδη 3-φωσφορική αφυδρογονάση, 0,5 mM ATP, 0,015 mM NADH2, 0,5 mM φωσφοκρεατίνη, 0,06 mM RuB0l εκχυλίσματος και.
Προσδιορισμός NADPH και NADP
Τα δείγματα φρέσκων φύλλων (0,3 g) ομογενοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας παγωμένο γουδοχέρι και γουδί με 3,0 ml 0,2 Μ HCI για προσδιορισμό NADPH ή 3,0 ml NaOH 0,2 Μ για προσδιορισμό NADP . Κάθε ομογενοποίηση θερμάνθηκε σε λουτρό ζέοντος νερού για 5 λεπτά, ψύχθηκε σε λουτρό πάγου και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 10.000 g στους 4°C για 10 λεπτά. Τα υπερκείμενα εξουδετερώθηκαν με αντίστοιχα 0,2 Μ NaOH ή HCI και φυγοκεντρήθηκαν στα 10.000 g στους 4°C για 10 λεπτά. Τα τελικά υπερκείμενα μεταφέρθηκαν σε χωριστούς σωλήνες και διατηρήθηκαν σε πάγο για ανάλυση συνενζύμου.
Δοκιμασίες ενζυμικού κύκλου του NADP(H) πραγματοποιήθηκαν σε χαμηλό φως με ΜΤΤ ως τερματικό δέκτη ηλεκτρονίων σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Zhao et al. (1987) με ορισμένες τροποποιήσεις. Εν συντομία, 50 μl διαλυμάτων NADPH 4 μΜ ή υπερκείμενων δειγμάτων προστέθηκαν σε μίγμα 500 μl που περιείχε 0,1 M ρυθμιστικό διάλυμα Tricine-NaOH (PH 8,0), 10 mM EDTA (άλας δινάτριου), 1 mM MTT, 2 mM φαιναζινοαιθοθειική (PES), . mM G6P και επωάστηκε για 5 λεπτά στους 37°C. Ο κύκλος των ενζύμων ξεκίνησε με την προσθήκη 2 U διαλύματος G6PDH και 40 λεπτά αργότερα διακόπηκε με την προσθήκη 500 μl NaCl 6 M. Με κάθε βιολογικό δείγμα, έγινε επίσης μια τυφλή μέτρηση προσθέτοντας 0,1 Μ ρυθμιστικό διάλυμα Tricine-NaOH αντί για ένζυμο. Μετά από φυγοκέντρηση στα 10.000 g στους 4°C για 5 λεπτά, τα υπερκείμενα αφαιρέθηκαν προσεκτικά και το ίζημα διαλυτοποιήθηκε σε 1 ml αιθανόλης 96%. Τελικά, προσδιορίστηκε η απορρόφηση στα 570 nm.
Μέτρηση ζωτικότητας ριζών και δυναμικού νερού στα φύλλα
Η ζωτικότητα της ρίζας προσδιορίστηκε με τη μέθοδο χλωριούχου τριφαινυλτετραζολίου (TTC) σύμφωνα με τον Clemensson-lindell (1994). Οι φρέσκες ρίζες κόπηκαν σε μικρά κομμάτια μήκους 1 έως 2 mm και 0,2 g από αυτά επωάστηκαν με 6 ml 0,6% (w/v) TTC σε 0,06 M Na2HPO4–KH2PO4 στους 37°C για 3 ώρες και 0,05 % (ν/ν) Προστέθηκαν Tween 20 και τα δείγματα διηθήθηκαν υπό κενό για 15 λεπτά. Μετά την επώαση, τα κομμάτια της ρίζας πλύθηκαν δύο φορές με 5 ml απεσταγμένου νερού. Στη συνέχεια, τα δείγματα εκχυλίστηκαν σε 95% (ο/ο) αιθανόλη στους 80°C για 15 λεπτά. Η απορρόφηση στα 520 nm μετρήθηκε με σύστημα Multimode Plate Reader Label-free System (PerkinElmer, ΜΑ, ΗΠΑ).
Το δυναμικό ύδατος φύλλων (Ψleaf) προσδιορίστηκε σε άθικτα αποκομμένα φύλλα από φυτά με μετρητή δυναμικού σημείου δρόσου (WP4-C, Decagon Devices, Inc., Pullman, WA, USA).
Ανίχνευση και δημιουργία H2O2
Η συσσώρευση απεικονίστηκε με χρώση με νιτρομπλε τετραζόλιο (ΝΒΤ). Δίσκοι φύλλων (διαμέτρου 1,5 cm) διηθήθηκαν απευθείας με 0,1 mg ml -1 ΝΒΤ σε ρυθμιστικό διάλυμα K-HEPES 25 mM (ρΗ7,8) και επωάστηκαν στους 25°C στο σκοτάδι για 4 ώρες. Στη συνέχεια, οι δίσκοι φύλλων ξεπλύθηκαν σε 95% (ο/ο) αιθανόλη για 10 λεπτά στους 95°C και φωτογραφήθηκαν με ψηφιακή κάμερα (Canon EOS 5D; Canon Inc., Τόκιο, Ιαπωνία).
Για την ιστοχημική χρώση του H2O2, τα φύλλα αποσπάστηκαν και τοποθετήθηκαν σε διάλυμα που περιείχε 1 mg ml -1 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB, pH 5,5) για 6 ώρες μετά από ελαφριά διήθηση υπό κενό. Οι δίσκοι φύλλων βράστηκαν σε αιθανόλη 95% (v/v) για 10 λεπτά, αποθηκεύτηκαν σε γλυκερίνη 50% και στη συνέχεια φωτογραφήθηκαν με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (Canon EOS 5D; Canon Inc., Τόκιο, Ιαπωνία) ή μικροσκόπιο μηχανοκίνητου συστήματος Olympus ( BX61, Olympus Co., Τόκιο, Ιαπωνία) σε 400 μεγεθύνσεις (Thordal-Christensen et al., 1997).
Δοκιμασία Γλουταθειόνης και Αντιοξειδωτικών Ενζύμων
Για τη μέτρηση των GSH και GSSG, ο ιστός των φύλλων φυτών (0,3 g) ομογενοποιήθηκε σε 2 mL μεταφωσφορικού οξέος 5% που περιέχει 2 mM EDTA και φυγοκεντρήθηκε στους 4°C για 15 λεπτά στα 12.000 g. Οι περιεκτικότητες GSH και οξειδωμένης γλουταθειόνης (GSSG) προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τους Rao et al. (1995) με μέθοδο ενζυματικής ανακύκλωσης.
Η δράση των αντιοξειδωτικών ενζύμων στα φύλλα προσδιορίστηκε με φασματοφωτομετρικές μεθόδους. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη προσδιορίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο Bradford and Williams (1976). Η δραστικότητα SOD προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Stewart and Bewley (1980) που βασίζεται στη φωτοχημική αναγωγή του NBT. Η δραστηριότητα CAT μετρήθηκε με παρακολούθηση του ρυθμού αποσύνθεσης H2O2 στο A240 σύμφωνα με τους Cakmak και Marschner (1992). Η δραστικότητα GR μετρήθηκε σύμφωνα με τους Foyer και Halliwell (1976) που βασίστηκε στον ρυθμό μείωσης της απορρόφησης του NADPH στα 340 nm. Η δραστικότητα υπεροξειδίου του ασκορβικού (APX) μετρήθηκε με παρακολούθηση του ρυθμού οξείδωσης ασκορβικού στα 290 nm σύμφωνα με τους Nakano και Asada (1981).
Western Blotting για HSP70
Η Heat Shock Protein 70 εκχυλίστηκε όπως περιγράφεται από τους Zhang και Klessig (1997). Εν συντομία, 0,3 g του κατεψυγμένου φύλλου αλέστηκαν σε υγρό άζωτο σε 0,6 mL ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης [100 mM HEPES, ρΗ 7,5, 5 mM EDTA, 5 mM αιθυλενογλυκόλη τετραοξικό οξύ (EGTA), 10 mM DTT, 10 mM Na3VO4, NaF, 50 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 1 mM φαινυλομεθυλσουλφονυλοφθορίδιο, 5 mg mL -1 αντιπόνο, 5 mg mL -1 απρωτινίνη, 5 mg mL -1λευπεπτίνη, 10% γλυκερίνη και 7,5% πολυβινυλοπολυπυρρολιδόνη (PVP)]. Μετά από φυγοκέντρηση στα 13.000 g για 20 λεπτά, τα υπερκείμενα μεταφέρθηκαν σε καθαρούς σωλήνες. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης των εκχυλισμάτων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης Bio-Rad χρησιμοποιώντας αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA) ως πρότυπο. Τα μετουσιωμένα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης 12,5% δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad) με ημίξηρο ηλεκτροστύπωμα. Η μεμβράνη αποκλείστηκε για 2 ώρες σε ρυθμιστικό TBS (20 mM Tris, ρΗ 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20, 0,1 mM Na3VO4) με 5% BSA σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάστηκε για 1 ώρα σε ρυθμιστικό TBS (με BSA ) που περιέχει το πολυκλωνικό αντίσωμα Rabbit HSP70 (Agrisera, vännäs, Σουηδία). Μετά από επώαση με αντίσωμα συνδεδεμένο με HRP (υπεροξειδάση χρένου) (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, ΗΠΑ), τα σύμπλοκα στο στύπωμα οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Perkin Elmer) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ποσοτικοποίηση του HSP70 πραγματοποιήθηκε από το ImageJ.
Εκχύλιση RNA και Ποσοτική Ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR).
Το ολικό RNA εκχυλίστηκε από εμβολιασμένα φύλλα αγγουριού χρησιμοποιώντας κιτ εκχύλισης RNA (Axgen, Union City, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή. Η μόλυνση του DNA απομακρύνθηκε χρησιμοποιώντας στήλη καθαρισμού. Ένα μικρογραμμάριο ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το κιτ ReverTra Ace qPCR RT (Toyobo, Osaka, Ιαπωνία) σύμφωνα με τις συστάσεις του προμηθευτή. Οι ειδικοί για το γονίδιο εκκινητές για qRT-PCR σχεδιάστηκαν με βάση τις αλληλουχίες cDNA τους, ως εξής: RBCL (F, 5′-ATTTGCGAATCCTACT-3′; R, 3′-AAACCGCTTACCATAA-5′), RBCS (F, 5′- ACCACAGGTACACCAGGAT-3′; R, 3′-GGGCTTGTAGGCGATG-5′), RCA (F, 5′-AAGTGAGAAAGTGGGCTGTA-3′; R, 3′-TTGTCATCTTCGGTTGGT-5′) και το γονίδιο ακτίνης′ (F, GATGTACT5 -3′; R, 3′-CAATGAGGGATGGCTGGAAAA-5′) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Οι δοκιμές qRT-PCR πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανίχνευσης PCR σε πραγματικό χρόνο iCycleriQTM (Bio-Rad, Hercules, CA, ΗΠΑ). Οι PCRs πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το SYBR Green PCR Master Mix (Takara, Τόκιο, Ιαπωνία). Οι συνθήκες PCR αποτελούνταν από μετουσίωση στους 95°C για 3 λεπτά, ακολουθούμενοι από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95°C για 30 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 58°C για 30 δευτερόλεπτα και επέκταση στους 72°C για 30 δευτερόλεπτα. Η ποσοτικοποίηση των επιπέδων mRNA βασίστηκε στη μέθοδο των Livak και Schmittgen (2001).
Στατιστική ανάλυση
Το πείραμα ήταν ένα πλήρως τυχαιοποιημένο σχέδιο με τέσσερις επαναλήψεις. Κάθε αντίγραφο περιείχε τουλάχιστον 10 φυτά. Η αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο της σημασίας και προσδιορίστηκαν σημαντικές διαφορές (Ρ lt; 0,05) μεταξύ των θεραπειών χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Tukey (Πίνακας 2).
ΠΙΝΑΚΑΣ 2. Στατιστικά στοιχεία με τις τιμές F και P των κύριων παραγόντων και αλληλεπιδράσεων.
Αποτελέσματα
Φωτοσυνθετικές αντιδράσεις εμβολιασμένων φυτών αγγουριού στο θερμικό στρες
Τα Asat και PIABS είναι χρήσιμοι δείκτες φωτοσυνθετικής απόδοσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, η θερμότητα της ζώνης ρίζας (25/40°C) και η εναέρια θερμότητα (40/25°C) μεμονωμένα και σε συνδυασμό (40/40°C, βλαστός/ρίζα) μείωσαν σημαντικά το Asat και το PIABS στον εαυτό τους. -μπολιασμένα (Cs/Cs) φυτά αγγουριού. Η πιο έντονη μείωση παρατηρήθηκε στη θεραπεία 40/40°C, ακολουθούμενη από 25/40°C και 40/25°C. Είναι σημαντικό ότι τα φύλλα των αμοιβαία εμβολιασμένων φυτών αγγουριού (Cs/Lc) όπου χρησιμοποιήθηκε η λούφα ως υποκείμενο έδειξαν πολύ υψηλότερες τιμές Asat και PIABS υπό θερμική καταπόνηση σε σύγκριση με τα φυτά Cs/Cs. Για παράδειγμα, η θερμική καταπόνηση μείωσε το Asat κατά 47,0, 33,4 και 90,9% και το PIABS κατά 66,9, 86,7 και 93,4% μετά την έκθεση των φυτών Cs/Cs σε 25/40, 40/25 και 40/40°C για 48 h, αντίστοιχα. Από την άλλη πλευρά, οι μειώσεις στις μονάδες Cs/Lc για το Asat ήταν μόνο 24,4%, 14.
ΣΧΗΜΑ 1. Αλλαγές στην απόδοση του Asat και της φωτοσυνθετικής (PIABS) σε φυτά αγγουριάς, όπως επηρεάζονται από το υποκείμενο και τη ζώνη ρίζας ή/και την εναέρια θερμική καταπόνηση. Όλα τα δεδομένα προσδιορίστηκαν στις 48 ώρες μετά τη θερμική επεξεργασία. Οι ράβδοι (μέσος όρος ± SD, n = 4) που επισημαίνονται με διαφορετικά γράμματα διαφέρουν σημαντικά σε P lt; 0,05 σύμφωνα με τη δοκιμή Tukey.
Αλλαγές στις φωτοχημικές αντιδράσεις που επηρεάζονται από τη θερμική καταπόνηση σε εμβολιασμένα φυτά
Για να διερευνήσουμε τον λόγο της δραστικής μείωσης των Asat και PIABS μετά από θερμική καταπόνηση, αναλύσαμε αρχικά την απορρόφηση της φωτεινής ενέργειας στα φυτά Cs/Cs και Cs/Lc. Σε αντίθεση με τα Asat και PIABS, οι περιεκτικότητες σε ABS/CSm και χλωροφύλλη στα φυτά Cs/Cs και Cs/Lc παρέμειναν σχεδόν αμετάβλητες μετά από καθεστώτα θερμοκρασίας 25/40°C, 40/25°C και 40/40°C (Πίνακας 1). Είναι γνωστό ότι μέρος της απορροφούμενης ενέργειας χρησιμοποιείται για την κίνηση της φωτοσύνθεσης (φωτοχημεία). Ωστόσο, η ροή που διοχετεύεται στο RC μειώνοντας το QA σε QA – (ονομάζεται «ροή παγίδευσης» TR) και η ροή που μεταφέρεται πέρα από το QA –το οποίο επαναοξειδώνεται σε QA (που ονομάζεται «ροή μεταφοράς ηλεκτρονίων» ET) μειώθηκαν σημαντικά από τη θερμική καταπόνηση της ριζικής ζώνης ή/και της εναέριας θερμότητας και στα δύο εμβολιασμένα φυτά, με αποτέλεσμα τη μείωση των φΡ0 και φΕ0. Χαμηλότερα TR/CSm, ET/CSm, φP0, φE0, Y(II), ETRII, Y(I) και ETR(I) παρατηρήθηκαν στα φυτά Cs/Cs μετά από έκθεση στην εναέρια θερμότητα από εκείνα στα φυτά Cs/Cs μετά έκθεση στη θερμότητα της ριζικής ζώνης. Το Lc ως υποκείμενο μετρίασε σημαντικά τις μειώσεις στις περισσότερες από αυτές τις παραμέτρους. Για παράδειγμα, μετά από θεραπείες 25/40°C, 40/25°C και 40/40°C, το ET/CSm και το Y(II) στα φυτά Cs/Cs μειώθηκαν κατά 33,3, 50,0, 63,0 και 25,6, 51,2%. 67,4, αντίστοιχα, ενώ αυτές στις μονάδες Cs/Lc μειώθηκαν κατά 22,8, 26,3, 43,9 και 18,2, 27,3, 50,0% αντίστοιχα.
Το Y(NPQ) στο PSII και το Y(ND) στο PSI αντιπροσωπεύουν την απαγωγή θερμότητας που σχετίζεται με την ικανότητα προστασίας από το φως των φυτών. Μετά και τις τρεις θερμικές επεξεργασίες, το Y(NPQ) και στα δύο εμβολιασμένα φυτά παρέμεινε σχεδόν αμετάβλητο, ενώ το Y(ND) αυξήθηκε σημαντικά και σχετικά μεγαλύτερη αύξηση παρατηρήθηκε στα φυτά Cs/Lc. Επιπλέον, το Y(NO) στο PSII και το Y(NA) στο PSI αντιπροσωπεύουν την έκταση της οπτικής βλάβης (Kramer et al., 2004). Τόσο το Υ(ΝΟ) όσο και το Υ(ΝΑ) στα φυτά Cs/Cs προκλήθηκαν σημαντικά από την εναέρια ή/και τη θερμότητα της ριζικής ζώνης [εκτός από το Υ(ΝΑ) από τη θερμότητα της ζώνης ρίζας]. Ωστόσο, η Lc ως υποκείμενο ανέστειλε τέτοιες αυξήσεις σε Υ(ΝΟ) και Υ(ΝΑ). Συνολικά, η θερμική καταπόνηση προκάλεσε μικρή ζημιά και κατά συνέπεια μικρότερη μείωση στη μεταφορά ηλεκτρονίων του PSI από εκείνες του PSII λόγω της υψηλότερης ικανότητας προστασίας από το φως του PSI σε κάποιο βαθμό (Πίνακας 1). Εξάλλου,
Απόκριση της πλευράς του δότη και του αποδέκτη στην αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων
Το σύμπλεγμα που εξελίσσεται οξυγόνο είναι ο κύριος δότης ηλεκτρονίων, το RC/CSm αντιπροσωπεύει το αντιδραστικό κέντρο ανά διατομή, το qP (φωτοχημικός παράγοντας απόσβεσης) είναι ένας αντιπρόσωπος για την οξειδοαναγωγική κατάσταση του QA που είναι ο κύριος δέκτης ηλεκτρονίων μετά το PSII, το Sm αντιπροσωπεύει το μέγεθος του PQ pools, και η οξειδωμένη αδενίνη αμιδίου της νικοτίνης (NADP ) είναι ο τερματικός δέκτης ηλεκτρονίων (Farquhar et al., 1980· Strasser et al., 2004). Όπως τα ET/CSm και Y(II), τα OEC, RC/CSm, qP και Sm στα φυτά Cs/Cs μειώθηκαν σημαντικά μετά τη θερμική καταπόνηση, ενώ η θερμότητα της ζώνης ρίζας προκάλεσε δραστικές μειώσεις από την εναέρια θερμότητα (Εικόνα 2Α). Ωστόσο, η Lc ως υποκείμενο άμβλυνε τη μείωση αυτών των παραμέτρων λόγω θερμότητας. NADP μειώθηκε σημαντικά στα φυτά Cs/Cs, ενώ η μειωμένη νικοτιναμιδική αδενίνη (NADPH) αυξήθηκε από τη θερμότητα της ζώνης ρίζας (Εικόνα 2Β). Ωστόσο, το άθροισμα των NADPH NADP δεν μεταβλήθηκε από τη ζώνη ρίζας ή/και τις εναέριες θερμικές επεξεργασίες. Αντίστοιχα, η αναλογία NADP /NADPH μειώθηκε σημαντικά στα φυτά Cs/Cs μετά από θερμική καταπόνηση στη ζώνη της ρίζας. Το Lc ως υποκείμενο ανέστρεψε τη μείωση της περιεκτικότητας NADP και της αναλογίας NADP /NADPH υπό θερμική καταπόνηση στη ζώνη ρίζας. Συγκεκριμένα, η περιεκτικότητα σε NADP ή/και NADPH και η αναλογία NADP /NADPH παρέμειναν σχεδόν αμετάβλητα μετά από θερμικές επεξεργασίες 40/25°C και 40/40°C και στις δύο μονάδες Cs/Cs και Cs/Lc.
ΣΧΗΜΑ 2. Αλλαγές στην περιεκτικότητα των συστατικών PSII (A) και NADP(H) και της κατάστασης οξειδοαναγωγής (B) σε φυτά αγγουριού, όπως επηρεάζονται από το υποκείμενο και τη ζώνη της ρίζας ή/και την εναέρια θερμική καταπόνηση. Τα δείγματα συλλέχθηκαν στις 48 ώρες μετά τη θερμική επεξεργασία. Οι ράβδοι (μέσος όρος ± SD, n = 4) που επισημαίνονται με διαφορετικά γράμματα διαφέρουν σημαντικά σε P lt; 0,05 σύμφωνα με τη δοκιμή Tukey.
Απόκριση της δραστηριότητας του Rubisco και της διακυτταρικής συγκέντρωσης CO2 στη θερμική καταπόνηση σε εμβολιασμένα φυτά
Ο ρυθμός αναγέννησης του NADP εξαρτάται εν μέρει από το ρυθμό του Κύκλου Calvin–Benson. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε τη δραστηριότητα και τα επίπεδα μεταγραφής του Rubisco, ενός βασικού ενζύμου περιορισμού του ρυθμού στον κύκλο Calvin-Benson. Στη βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης, δηλ. 25/25°C, το υποκείμενο luffa δεν επηρέασε σημαντικά την έκφραση των RBCL και RCA (Εικόνα 3). Ωστόσο, το θερμικό στρες ρύθμισε προς τα πάνω την έκφραση των RBCL, RBCS και RCA σε φυτά Cs/Lc, εκτός από τις θεραπείες RCBS στους 25/40°C και RCA στους 25/40°C και 40/40°C. Συγκεκριμένα, τα φυτά Cs/Lc έδειξαν σχετικά υψηλότερη αφθονία μεταγραφών RBCL, RBCS και RCA από τα φυτά Cs/Cs μετά από θερμικές επεξεργασίες 25/40°C, 40/25°C και 40/40°C για 48 ώρες. Οι συνολικές και αρχικές δραστηριότητες Rubisco και ο ρυθμός ενεργοποίησης του Rubisco στα φυτά Cs/Cs μειώθηκαν σημαντικά μετά την έκθεση σε θερμικό στρες. Ωστόσο, Το υποκείμενο luffa μείωσε τις προκαλούμενες από τη θερμική καταπόνηση μειώσεις των δραστηριοτήτων και του ρυθμού ενεργοποίησης του Rubisco. Τελικά, οι συνολικές και αρχικές δραστηριότητες του Rubisco και ο ρυθμός ενεργοποίησης του Rubisco στα φυτά Cs/Lc ήταν υψηλότεροι από εκείνους στα φυτά Cs/Cs μετά από έκθεση στη ριζική ζώνη ή/και στη θερμότητα του αέρα.
ΣΧΗΜΑ 3. Τα επίπεδα μεταγραφής σταθερής κατάστασης για RCBL , RCBS , RCA (A) και οι δραστηριότητες και ο ρυθμός ενεργοποίησης του Rubisco (Β) σε απόκριση στο υποκείμενο και στη ζώνη ρίζας ή/και στην εναέρια θερμική καταπόνηση. Τα δείγματα συλλέχθηκαν στις 48 ώρες μετά τη θερμική επεξεργασία. Οι ράβδοι (μέσος όρος ± SD, n = 4) που επισημαίνονται με διαφορετικά γράμματα διαφέρουν σημαντικά σε P lt; 0,05 σύμφωνα με τη δοκιμή Tukey.
Η διακυτταρική συγκέντρωση CO2 είναι ένας σημαντικός παράγοντας που επηρεάζει τη δραστηριότητα του Rubisco και τον φωτοσυνθετικό ρυθμό. Το Ci στα φυτά Cs/Cs δεν επηρεάστηκε από την εναέρια θερμότητα, αλλά μειώθηκε σημαντικά από τη θερμότητα της ζώνης ρίζας και τις συνδυασμένες θερμικές επεξεργασίες (Εικόνα 4). Το Ci εξαρτάται από την ισορροπία μεταξύ της αφομοίωσης του CO2 και της πρόσληψης CO2 μέσω των στομάτων. Ομοίως, το Gs μειώθηκε σημαντικά από τη ριζική ζώνη καθώς και από τη συνδυασμένη θερμότητα. Καθώς το κλείσιμο του στομίου συνδέεται στενά με το δυναμικό νερού των φύλλων (Ψleaf) το οποίο επηρεάζεται βασικά από την παροχή νερού από τη ρίζα, αναλύσαμε περαιτέρω τις αλλαγές στη ζωτικότητα του Ψ φύλλου και της ρίζας. Η ζωτικότητα των φύλλων και των ριζών εμφάνισε παρόμοιες τάσεις αλλαγής όπως οι Gs και Ci. Ωστόσο, οι μειώσεις που προκαλούνται από τη θερμότητα και τη συνδυασμένη θερμότητα στη ζωτικότητα Ci, Gs, Ψφύλλων και ρίζας στη ζώνη ρίζας μετριάστηκαν όταν το αγγούρι εμβολιάστηκε σε υποκείμενο Lc.
ΣΧΗΜΑ 4. Μεσοκυττάριο CO2, στοματική αγωγιμότητα ( Gs ) και υδάτινο δυναμικό του φύλλου ως απόκριση στο υποκείμενο και στη ζώνη ρίζας ή/και στην εναέρια θερμική καταπόνηση και στη ζωτικότητα των ριζών του υποκείμενου αγγουριού ή της λούφα, όπως επηρεάζεται από τη θερμική καταπόνηση της ζώνης της ρίζας ή/και του αέρα . Όλα τα δεδομένα προσδιορίστηκαν στις 48 ώρες μετά τη θερμική επεξεργασία. Οι ράβδοι (μέσος όρος ± SD, n = 4) που επισημαίνονται με διαφορετικά γράμματα διαφέρουν σημαντικά σε P lt; 0,05 σύμφωνα με τη δοκιμή Tukey.
Απόκριση της δημιουργίας ROS και της σάρωσης στη θερμική καταπόνηση σε εμβολιασμένα φυτά
Η αναστολή της φωτοσύνθεσης θα μπορούσε να προκαλέσει τη δημιουργία ROS όπως το υπεροξείδιο () και το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2). Μετά από in situ χρώση φύλλων με NBT και 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB), βρήκαμε εντατική συσσώρευση και H2O2 σε φυτά Cs/Cs μετά από θερμικές επεξεργασίες, όπου η υψηλότερη συσσώρευση ROS παρατηρήθηκε υπό συνδυασμένη θερμική επεξεργασία ακολουθούμενη από θερμότητα στη ζώνη ρίζας και εναέρια θερμότητα (Εικόνα 5Α, Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Ωστόσο, η Lc ως υποκείμενο μείωσε σημαντικά την προκαλούμενη από τη θερμότητα συσσώρευση και H2O2. Ομοίως, η σχετική ηλεκτρική αγωγιμότητα (REC) που αντικατόπτριζε τη βλάβη της κυτταρικής μεμβράνης αυξήθηκε προφανώς από τα προκαλούμενα από τη θερμότητα ROS στα φυτά Cs/Cs και αυτή η αύξηση μετριάστηκε από το υποκείμενο Lc.
ΣΧΗΜΑ 5. Συσσώρευση H2O2 (Α), αντιοξειδωτική ενζυμική δραστηριότητα, ομοιόσταση γλουταθειόνης και διαπερατότητα μεμβράνης που αντανακλώνται από τη σχετική ηλεκτρική αγωγιμότητα (REC) (Β) ως απόκριση στο υποκείμενο και στη ζώνη ρίζας ή/και στο εναέριο θερμικό στρες. Τα δείγματα συλλέχθηκαν στις 48 ώρες μετά τη θερμική επεξεργασία. Οι ράβδοι (μέσος όρος ± SD, n = 4) που επισημαίνονται με διαφορετικά γράμματα διαφέρουν σημαντικά σε P lt; 0,05 σύμφωνα με τη δοκιμή Tukey.
Μέσω της εξέλιξης, τα φυτά έχουν αναπτύξει ένα σύνολο αντιοξειδωτικών συστημάτων για την απομάκρυνση των υπερβολικών ROS που δημιουργούνται από περιβαλλοντικές πιέσεις. Οι δραστηριότητες των κύριων αντιοξειδωτικών ενζύμων όπως τα SOD, CAT, GR και APX σε φυτά Cs/Cs μειώθηκαν σημαντικά από τη συνολική θερμική καταπόνηση. Μόνο οι δραστηριότητες CAT και APX μειώθηκαν προφανώς από τη θερμότητα της ριζικής ζώνης, ενώ οι δραστηριότητες CAT και GR αυξήθηκαν με εναέρια θερμική επεξεργασία (Εικόνα 5Β). Ωστόσο, το υποκείμενο luffa μείωσε τις μειώσεις ή βελτίωσε τις αυξήσεις των περισσότερων ενζυμικών δραστηριοτήτων λόγω θερμικής καταπόνησης. Ως αποτέλεσμα, οι δραστηριότητες των περισσότερων από αυτά τα ένζυμα στα φυτά Cs/Lc ήταν σημαντικά υψηλότερες από εκείνες στα φυτά Cs/Cs μετά από διαφορετικές θερμικές επεξεργασίες. Η περιεκτικότητα σε GSH στα φυτά Cs/Cs αυξήθηκε από την εναέρια θερμότητα αλλά αμετάβλητη από τη ριζική ζώνη και τη συνολική θερμότητα, ενώ η περιεκτικότητα σε GSSG αυξήθηκε από τη συνολική θερμότητα αλλά αμετάβλητη από τη θερμότητα της ριζικής ζώνης ή της εναέριας θερμότητας. Τέλος, η αναλογία GSH/GSSG στα φυτά Cs/Cs αυξήθηκε από την εναέρια θερμότητα, μειώθηκε από τη συνολική θερμότητα, αλλά αμετάβλητη από τη θερμότητα της ζώνης ωοτοκίας. Με ελάχιστες εξαιρέσεις, η περιεκτικότητα σε GSH και GSSG στα φυτά Cs/Lc ήταν σημαντικά υψηλότερη και χαμηλότερη, αντίστοιχα, από εκείνα στα φυτά Cs/Cs, μετά από έκθεση σε θερμική επεξεργασία στη ζώνη ρίζας ή/και εναέρια. Έτσι, τα φυτά Cs/Lc είχαν υψηλότερη αναλογία GSH/GSSG από τα φυτά Cs/Cs μετά από θερμικές επεξεργασίες. μετά από έκθεση σε ριζική ή/και εναέρια θερμική επεξεργασία. Έτσι, τα φυτά Cs/Lc είχαν υψηλότερη αναλογία GSH/GSSG από τα φυτά Cs/Cs μετά από θερμικές επεξεργασίες. μετά από έκθεση σε ριζική ή/και εναέρια θερμική επεξεργασία. Έτσι, τα φυτά Cs/Lc είχαν υψηλότερη αναλογία GSH/GSSG από τα φυτά Cs/Cs μετά από θερμικές επεξεργασίες.
Ο ρόλος του HSP70 στην Προστασία της Φωτοσύνθεσης που προκαλείται από την Lc στο αγγούρι
Το HSP70, ένας σημαντικός μοριακός συνοδός στην οικογένεια πρωτεϊνών θερμικού σοκ, παίζει σημαντικό ρόλο στην προστασία των πρωτεϊνών από τη ζημιά που προκαλείται από τη θερμότητα (Boston et al., 1996). Η συσσώρευση πρωτεΐνης HSP70 στα φυτά Cs/Cs παρέμεινε σχεδόν αμετάβλητη κατά 25/40°C και 40/25°C, αλλά αυξήθηκε κατά 40/40°C. Το HSP70 σε εγκαταστάσεις Cs/Lc αυξήθηκε με όλες τις θερμικές επεξεργασίες σε υψηλότερο επίπεδο, σε σύγκριση με αυτό στις εγκαταστάσεις Cs/Cs (Εικόνα 6Α). Τέλος, τα επίπεδα της HSP70 στα φυτά Cs/Lc αυξήθηκαν κατά 1,27, 1,39 και 1,38 φορές σε σύγκριση με αυτά στον έλεγχο Cs/Cs, μετά από θερμότητα 25/40°C, 40/25°C και 40/40°C θεραπεία για 48 ώρες, αντίστοιχα. Ωστόσο, η προεπεξεργασία με Q και K που είναι αναστολείς της έκφρασης του HSP70, επιδείνωσε τις βλάβες που προκαλούνται από τη θερμότητα, όπως φαίνεται από τη δραστική μείωση των Fv/Fm και PSII σε Cs/Cs και Cs/Lc,
ΣΧΗΜΑ 6. Η συσσώρευση HSP70 και η απαίτησή της στη φωτοσυνθετική βελτίωση που προάγει το υποκείμενο luffa υπό θερμική καταπόνηση. (Α) Αλλαγές στο επίπεδο της πρωτεΐνης HSP70, όπως επηρεάζονται από το υποκείμενο και τη ριζική ζώνη ή/και το εναέριο θερμικό στρες. Τα δείγματα φύλλων συλλέχθηκαν στις 48 ώρες μετά τις θερμικές επεξεργασίες και αναλύθηκαν με στύπωμα western. Η πρωτεΐνη χρωματίστηκε με Coomassie Brilliant Blue ως έλεγχο φόρτωσης. Τα ίδια αποτελέσματα λήφθηκαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. (ΣΙ)Αλλαγές στο Fv/Fm και η κβαντική απόδοση του PSII (ΦPSII) σε φυτά αγγουριού με ρίζες αγγουριού ή λούφα ως υποκείμενο. Τα φυτά υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με 200 μM KNK437 (K) ή 200 μM Κερσετίνη (Q) για 12 ώρες και στη συνέχεια τα φυτά εκτέθηκαν σε θερμική καταπόνηση στους 40/40°C (HT) για 48 ώρες. Τα Fv/Fm και ΦPSII μετρήθηκαν στις 48 ώρες μετά τη θερμική καταπόνηση. Οι ράβδοι (μέσος όρος ± SD, n = 4) που επισημαίνονται με διαφορετικά γράμματα διαφέρουν σημαντικά σε P lt; 0,05 σύμφωνα με τη δοκιμή Tukey.
Συζήτηση
Η φωτοσύνθεση, μια σημαντική διαδικασία για την παραγωγή ενέργειας στα φυτά, είναι πολύ ευαίσθητη σε διάφορες περιβαλλοντικές πιέσεις όπως κρύο, ζέστη, ξηρασία, βαρέα μέταλλα και ούτω καθεξής (Takahashi and Murata, 2008). Ο εμβολιασμός με υποκείμενα ανθεκτικά στο στρες μπορεί να μετριάσει τη μείωση της φωτοσύνθεσης που προκαλείται από το στρες. Για παράδειγμα, ο εμβολιασμός αγγουριού σε κολοκύνθη και λούφα ανακουφίζει από την ψύξη και τη θερμότητα τη μείωση του φωτοσυνθετικού ρυθμού (Pn) αυξάνοντας τη δραστηριότητα του Rubisco και μειώνοντας το οξειδωτικό στρες (Zhou et al., 2007; Li et al., 2014b). Όταν η ντομάτα εμβολιάζεται σε υποκείμενο ανθεκτικό στη θερμότητα, η ευαισθησία της φωτοσύνθεσης σε υψηλή θερμοκρασία μειώνεται (Schwarz et al., 2010). Σύμφωνα με την προηγούμενη μελέτη μας (Li et al., 2014a), η απόδοση Asat και η φωτοσυνθετική απόδοση (PIABS) στα φυτά Cs/Cs μειώθηκαν σημαντικά από τη θερμότητα της ζώνης ρίζας (25/40°C), εναέρια θερμότητα (40/25°C) και συνδυασμένη θερμική επεξεργασία (40/40°C). Ωστόσο, η χρήση της luffa, ενός είδους ανθεκτικού στη θερμότητα, ως υποκείμενο μετριάστηκε αυτή η φωτοσυνθετική αναστολή (Εικόνα 1). Με συνέπεια, τα εμβολιασμένα φυτά ντομάτας με ανθεκτική στη θερμότητα ποικιλία ντομάτα ή μελιτζάνα ως υποκείμενο έδειξαν υψηλότερη φωτοσυνθετική απόδοση με βάση τις υψηλότερες τιμές φθορισμού χλωροφύλλης υπό συνθήκες θερμικής καταπόνησης (Abdelmageed and Gruda, 2009). Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώνουν περαιτέρω ότι ο εμβολιασμός είναι μια αποτελεσματική στρατηγική για τη βελτίωση της ανοχής στη θερμότητα στις κηπευτικές καλλιέργειες. Τα εμβολιασμένα φυτά ντομάτας με ανθεκτική στη θερμότητα ποικιλία ντομάτα ή μελιτζάνα ως υποκείμενο έδειξαν υψηλότερη φωτοσυνθετική απόδοση με βάση τις υψηλότερες τιμές φθορισμού χλωροφύλλης υπό συνθήκες θερμικής καταπόνησης (Abdelmageed and Gruda, 2009). Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώνουν περαιτέρω ότι ο εμβολιασμός είναι μια αποτελεσματική στρατηγική για τη βελτίωση της ανοχής στη θερμότητα στις κηπευτικές καλλιέργειες. Τα εμβολιασμένα φυτά ντομάτας με ανθεκτική στη θερμότητα ποικιλία ντομάτα ή μελιτζάνα ως υποκείμενο έδειξαν υψηλότερη φωτοσυνθετική απόδοση με βάση τις υψηλότερες τιμές φθορισμού χλωροφύλλης υπό συνθήκες θερμικής καταπόνησης (Abdelmageed and Gruda, 2009). Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώνουν περαιτέρω ότι ο εμβολιασμός είναι μια αποτελεσματική στρατηγική για τη βελτίωση της ανοχής στη θερμότητα στις κηπευτικές καλλιέργειες.
Η ροή φωτονίων απορροφάται από τις χρωστικές της κεραίας που διεγείρουν τη χλωροφύλλη και μέρος της ενέργειας διέγερσης (η άλλη διαχέεται ως εκπομπή θερμότητας και φθορισμού) μετατρέπεται σε ενέργεια οξειδοαναγωγής μέσω μεταφοράς ηλεκτρονίων και οδηγεί στην τελική δέσμευση CO2 (Strasser and Strasser, 1995). . Ένας αριθμός μελετών έχει προτείνει ότι η μεταφορά ηλεκτρονίων είναι πολύ ευαίσθητη στη θερμότητα και είναι ο κύριος λειτουργικός περιορισμός στη φωτοσύνθεση σε υψηλή θερμοκρασία (Wise et al., 2004; Hüve et al., 2006). Τόσο η συμπεριφορά του φωτοσυστήματος (PS) II όσο και του I σε υψηλή θερμοκρασία έχει μελετηθεί εκτενώς. Με συνέπεια, το PSII αποδείχτηκε πιο πιθανό να τραυματιστεί από υψηλή θερμοκρασία από το PSI (Sayed et al., 1989; Mihailova et al., 2011; Essemine et al., 2012; Yan et al., 2013). Στην παρούσα μελέτη, Τόσο η μεταφορά ηλεκτρονίων που οδηγείται από το PS II και το I περιορίστηκαν σημαντικά από τη θερμότητα της ριζικής ζώνης και την εναέρια θερμότητα, ειδικά από την προηγούμενη. Και σταθερά, μεγαλύτερη μείωση στο PS(II) και στο ETR(II) υποδηλώνει ότι το PSII ήταν πιο ευαίσθητο στο θερμικό στρες από το PSI. Η υψηλότερη ανοχή του PSI στη θερμότητα συνετέλεσε στην υψηλότερη ικανότητα προστασίας από το φως [Y(ND)] σε κάποιο βαθμό (Πίνακας 1).
Ο περιορισμός της μεταφοράς ηλεκτρονίων στο PS II μετά από εναέρια θερμική καταπόνηση αποδίδεται ίσως σε άμεσο τραυματισμό της φωτοσυνθετικής συσκευής. Η πλευρά του δότη PSII OEC αναγνωρίζεται συχνά ως το πιο ευαίσθητο στη θερμότητα συστατικό PSII (Allakhverdiev et al., 2008; Li et al., 2009). Η απενεργοποίηση του OEC από τη θερμική καταπόνηση έχει ως αποτέλεσμα δομικές αλλαγές της πρωτεΐνης D1 και D2 και στη συνέχεια επηρεάζει τη σταθεροποίηση του QA και τη σταθερότητα του PSII (Sinsawat et al., 2004; Camejo et al., 2005). Ωστόσο, σε σύγκριση με το OEC, οι αλλαγές σε φE0 και qP ήταν πιο ευαίσθητες στην εναέρια θερμική καταπόνηση όπως φαίνεται στα αποτελέσματά μας (Πίνακας 1, Εικόνα 2) και αυτές έδειξαν σοβαρή κατάπτωση στη μεταφορά ηλεκτρονίων πέρα από το QA. Έτσι, εκτός από την πλευρά του δότη PSII, η πλευρά του δέκτη μπορεί να είναι η κύρια θέση περιορισμού του συστήματος φωτοσύνθεσης από την εναέρια θερμική καταπόνηση. Ο υποκείμενος λόγος είναι ότι η εναέρια θερμική καταπόνηση πραγματοποιήθηκε κάτω από το φως ανάπτυξης και όχι στο σκοτάδι και το μπλοκ μεταφοράς ηλεκτρονίων από το PSII μπορεί να είναι ένας τρόπος αυτοπροστασίας μειώνοντας την πιθανότητα φωτοαναστολής PSI (Sonoike, 2011). Επιπλέον, η θερμότητα της ζώνης ρίζας σχεδόν ανεπηρέαστη τη δραστηριότητα του OEC, αλλά ανέστειλε τη δραστηριότητα της πλευράς αποδέκτη, όπως το QA και το PQ, υποδηλώνοντας ότι η πλευρά αποδέκτη του PSII ήταν πιο ευαίσθητη στη θερμότητα. Το πιο σημαντικό, το υποκείμενο Lc μείωσε τον περιορισμό που προκαλείται από τη θερμότητα στη ριζική ζώνη της πλευράς δέκτη και τον περιορισμό που προκαλείται από την εναέρια θερμότητα στις πλευρές δότη και δέκτη στο βλαστό αγγουριού. αλλά ανέστειλε τη δραστηριότητα της πλευράς αποδέκτη όπως το QA και το PQ, υποδηλώνοντας ότι η πλευρά αποδέκτη του PSII ήταν πιο ευαίσθητη στη θερμότητα. Το πιο σημαντικό, το υποκείμενο Lc μείωσε τον περιορισμό που προκαλείται από τη θερμότητα στη ριζική ζώνη της πλευράς δέκτη και τον περιορισμό που προκαλείται από την εναέρια θερμότητα στις πλευρές δότη και δέκτη στο βλαστό αγγουριού. αλλά ανέστειλε τη δραστηριότητα της πλευράς αποδέκτη όπως το QA και το PQ, υποδηλώνοντας ότι η πλευρά αποδέκτη του PSII ήταν πιο ευαίσθητη στη θερμότητα. Το πιο σημαντικό, το υποκείμενο Lc μείωσε τον περιορισμό που προκαλείται από τη θερμότητα στη ριζική ζώνη της πλευράς δέκτη και τον περιορισμό που προκαλείται από την εναέρια θερμότητα στις πλευρές δότη και δέκτη στο βλαστό αγγουριού.
Στο τέλος της γραμμικής αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων, το ηλεκτρόνιο μεταφέρεται στο NADP για να δημιουργήσει NADPH το οποίο μπορεί να καταναλωθεί σε δέσμευση CO2 που αναγεννά το NADP ξανά (Farquhar et al., 1980). Η αναλογία NADP /NADPH αυξήθηκε από την εναέρια θερμότητα που ανέστειλε τη μεταφορά ηλεκτρονίων στο PSII και στη συνέχεια μείωσε τον ρυθμό παραγωγής NADPH. Ωστόσο, η αναλογία NADP /NADPH μειώθηκε από τη θερμότητα της ριζικής ζώνης (Εικόνα 3), η οποία ανέστειλε την ικανότητα του κύκλου Calvin καταστέλλοντας την κατάσταση ενεργοποίησης και τη δραστηριότητα του Rubisco (ένα βασικό ένζυμο που εμπλέκεται στον κύκλο Calvin) και στη συνέχεια μείωσε τον ρυθμό NADP αναγέννηση. Έχει τεκμηριωθεί καλά ότι η κατάσταση ενεργοποίησης του Rubisco είναι ένας κρίσιμος περιοριστικός παράγοντας για τη φωτοσύνθεση και η ακτιβάση Rubisco είναι πολύ ευαίσθητη σε υψηλή θερμοκρασία (Salvucci and Crafts-Brandner, 2004, Scafaro et al., 2012). Η κατάσταση και η δραστηριότητα ενεργοποίησης του Rubisco σχετίζονται στενά με την παροχή συγκέντρωσης CO2 υποστρώματος σε χλωροπλάστες. Για παράδειγμα, το στρες στο νερό αναστέλλει σημαντικά τη δραστηριότητα του Rubisco μειώνοντας τα Gs (Flexas et al., 2006; Galmés et al., 2011). Ομοίως, η θερμική καταπόνηση στη ζώνη της ρίζας μείωσε το δυναμικό νερού των φύλλων και το Gs στα φυτά Cs/Cs μειώνοντας τη ζωτικότητα των ριζών, εμπόδισε την είσοδο CO2 και στη συνέχεια οδήγησε σε μειωμένη δραστηριότητα Rubisco (Εικόνες 4 και 5). Αξίζει να σημειωθεί ότι η περιορισμένη παροχή CO2 επιταχύνει τη φωτοζημία στο PSII μέσω της υπερβολικής μείωσης του QA (Melis, 1999; Εικόνα 2). αναστέλλει την επιδιόρθωση του φωτοκατεστραμμένου PSII (Takahashi and Murata, 2005) και τη σύνθεση της πρωτεΐνης D1 σε άθικτους χλωροπλάστες (Takahashi and Murata, 2006). Η μειωμένη ρύθμιση της δραστηριότητας του PSII οδηγεί σε ανισορροπία μεταξύ της παραγωγής και της χρήσης ηλεκτρονίων και της φωτοαναστολής. Για να διασκορπιστεί η περίσσεια φωτεινή ενέργεια, το υπερβολικό ηλεκτρόνιο μεταφέρεται στο μοριακό οξυγόνο, έναν ανταγωνιστή του NADP , δημιουργώντας έτσι ενεργά είδη οξυγόνου (, 1O2, H2O2, ⋅OH), που είναι δυνητικά επικίνδυνα για τα φυτά (Εικόνα 5). Τα υπερβολικά ROS μπλοκάρουν τη μεταφορά ηλεκτρονίων επηρεάζοντας τη διαδικασία επιδιόρθωσης του PSII και προκαλώντας συσσώρευση διάσπασης πρωτεϊνών RC, οι οποίες τελικά σχηματίζουν έναν φαύλο κύκλο (Allakhverdiev et al., 2008). Επιπλέον, τα ROS θα μπορούσαν να μετακινηθούν σε θυλακοειδή και κυτταρικές μεμβράνες, προκαλώντας έτσι αυξημένη υπεροξείδωση των λιπιδίων της μεμβράνης, μειωμένη σταθερότητα της μεμβράνης και αυξημένη διαπερατότητα της μεμβράνης (Sharma et al., 2012). Βρήκαμε συσσώρευση H2O2 που προκαλείται από θερμικό στρες και σε φυτά Cs/Cs και Cs/Lc (Εικόνα 5Α, Συμπληρωματικό Σχήμα S1) και η αύξηση του REC έδειξε ότι η υπερβολική ROS προκάλεσε βλάβη στη μεμβράνη (Εικόνα 5Β). Το αντιοξειδωτικό σύστημα συμπεριλαμβανομένων των αντιοξειδωτικών ενζύμων και των μη ενζυματικών αντιοξειδωτικών είναι υπεύθυνο για την απομάκρυνση των υπερβολικών ROS υπό μέτριο στρες και την καταστολή του κυτταρικού θανάτου υπό έντονο στρες (Ahmad et al., 2010). Προηγουμένως, έχουμε δείξει ότι ο εμβολιασμός σε ανεκτικό υποκείμενο θα μπορούσε να ανακουφίσει το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από το στρες ενισχύοντας το αντιοξειδωτικό σύστημα (Li et al., 2014b). Ομοίως, το υποκείμενο Lc βελτίωσε την αντιοξειδωτική ενζυμική δραστηριότητα και αύξησε την αναλογία GSH/GSSG και έτσι ελαχιστοποίησε τη συσσώρευση ROS υπό θερμική καταπόνηση.
Επιπλέον, το ανεκτικό στο στρες υποκείμενο θα μπορούσε να προκαλέσει τη γονιδιακή μεταγραφή και την έκφραση πρωτεϊνών που εμπλέκονται σε αποκρίσεις στρες, όπως η HSP70 στο γονίδιο μέσω ορισμένων σημάτων μεγάλων αποστάσεων (Li et al., 2014a). Ως τυπικός μοριακός συνοδός, εκτός από την προστασία των αντιοξειδωτικών ενζύμων από μετουσίωση ή αδρανοποίηση (Boston et al., 1996; Hu et al., 2010; Li et al., 2014b), το HSP70 παίζει επίσης ρόλο στη φωτοπροστασία και επιδιόρθωση του PSII κατά τη διάρκεια και μετά τη φωτοαναστολή που προκαλείται συχνά από διάφορες καταπονήσεις, συμπεριλαμβανομένης της θερμότητας (Murata et al., 2007; Takahashi and Murata, 2008). Η πρωτεΐνη HSP70 προκλήθηκε σημαντικά από το υποκείμενο Lc σε προγενέστερο στάδιο 12 ωρών των θερμικών επεξεργασιών (Li et al., 2014a) και αυτή η επαγωγή διατηρήθηκε μέχρι το επόμενο στάδιο (48 ώρες) (Εικόνα 6). Σύμφωνα με τα προηγούμενα αποτελέσματα μας, η επαγωγή του HSP70 από το υποκείμενο luffa σχετιζόταν στενά με την αύξηση της περιεκτικότητας σε ΑΒΑ που προκαλείται από το υποκείμενο luffa (Li et al., 2014a). Η κερκετίνη και η ΚΝΚ437 (Ν-φορμύ1-3,4-μεθυλενοδιοξυ-βενζυ-λιδεν-g-βουτυρολακτάμη) είναι αναστολείς της σύνθεσης HSP70 σε φυτικά και ζωικά κύτταρα (Manwell and Heikkila, 2007; Hu et al., 2010). Το πιο σημαντικό, η αναστολή του HSP70 από την κουερσετίνη ή το KNK437 εξασθένησε την ανοχή θερμότητας που προκαλείται από το υποκείμενο Lc στο PSII των φυτών Cs/Lc. Ως εκ τούτου, το HSP70 έπαιζε σταθερά σημαντικό ρόλο στο υποκείμενο Lc που διατήρησε τη δραστηριότητα του PSII και μείωσε το οξειδωτικό στρες υπό θερμική καταπόνηση. Το πιο σημαντικό, η αναστολή του HSP70 από την κουερσετίνη ή το KNK437 εξασθένησε την ανοχή θερμότητας που προκαλείται από το υποκείμενο Lc στο PSII των φυτών Cs/Lc. Ως εκ τούτου, το HSP70 έπαιζε σταθερά σημαντικό ρόλο στο υποκείμενο Lc που διατήρησε τη δραστηριότητα του PSII και μείωσε το οξειδωτικό στρες υπό θερμική καταπόνηση. Το πιο σημαντικό, η αναστολή του HSP70 από την κουερσετίνη ή το KNK437 εξασθένησε την ανοχή θερμότητας που προκαλείται από το υποκείμενο Lc στο PSII των φυτών Cs/Lc. Ως εκ τούτου, το HSP70 έπαιζε σταθερά σημαντικό ρόλο στο υποκείμενο Lc που διατήρησε τη δραστηριότητα του PSII και μείωσε το οξειδωτικό στρες υπό θερμική καταπόνηση.
συμπέρασμα
Το θερμικό στρες στη ζώνη ρίζας ανέστειλε τη φωτοσύνθεση κυρίως μέσω της μείωσης της δραστηριότητας του Rubisco, ενώ το εναέριο θερμικό στρες κυρίως μέσω της αναστολής της πλευράς δέκτη PSII στα φυτά αγγουριού. Ο περιορισμός της μεταφοράς ηλεκτρονίων είχε ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση ROS που προκάλεσε βλάβη στη φωτοσυνθετική συσκευή, σχηματίζοντας έναν φαύλο κύκλο. Σε συνθήκες πεδίου, η θερμοκρασία του αέρα κυμαίνεται συχνά, και επομένως η πλευρά του δέκτη PSII πρέπει να θεωρείται ως η κύρια περιοριστική θέση της φωτοσύνθεσης υπό θερμική καταπόνηση. Ο εμβολιασμός σε υποκείμενο Lc μείωσε τη φωτοσυνθετική αναστολή που προκαλείται από τη θερμότητα διατηρώντας υψηλότερη ζωτικότητα της ρίζας και προκαλώντας συσσώρευση HSP70. Το HSP70 συμμετείχε δυνητικά στη φωτοπροστασία και την επιδιόρθωση του PSII, καθώς και στην ενεργοποίηση αντιοξειδωτικών ενζύμων.
Συνεισφορές Συγγραφέων
HL και YZ σχεδίασαν την έρευνα. Οι HL, GA και GZ πραγματοποίησαν έρευνα. HL, XX, JZ, KS, JY και YZ αναλύθηκαν δεδομένα. Οι HL, GJ και YZ έγραψαν και αναθεώρησαν την εργασία.
Δήλωση Σύγκρουσης Συμφερόντων
Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη απουσία εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.
Ο κριτής AS-S και ο επεξεργαστής χειρισμού δήλωσαν την κοινή τους συνεργασία και ο συντάκτης χειρισμού δηλώνει ότι η διαδικασία, ωστόσο, πληρούσε τα πρότυπα μιας δίκαιης και αντικειμενικής αξιολόγησης.
Ευχαριστίες
Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (31171999, 31550110201), το Ειδικό Ταμείο για Αγρο-επιστημονική Έρευνα Δημοσίου Συμφέροντος (201203004) και το Ίδρυμα Μεταδιδακτορικών Επιστημών της Κίνας (2016M592843, 5171500-X).
Συμπληρωματικό υλικό
Το συμπληρωματικό υλικό για αυτό το άρθρο βρίσκεται στο διαδίκτυο στη διεύθυνση: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2016.00746
Συντομογραφίες
Asat, ρυθμός φωτοσύνθεσης κορεσμένου φωτός. ABS/CSm, ροή φωτονίων που απορροφάται από τις χρωστικές της κεραίας ανά διατομή. APX, ασκορβική υπεροξειδάση; CAT, καταλάση; Chl(a b), χλωροφύλλη a και b; Ci, μεσοκυττάριο CO2; Fv/Fm, η μέγιστη φωτοχημική απόδοση του PSII. GR, αναγωγάση γλουταθειόνης; Gs, στοματική αγωγιμότητα; GSH, μειωμένη γλουταθειόνη; GSSG, οξειδωμένη γλουταθειόνη; HSP70, πρωτεΐνη θερμικού σοκ 70; Κ, ΚΝΚ437; MDA, malondialdehye; OEC, σύμπλεγμα που αναπτύσσει οξυγόνο; PIABS, δείκτης φωτοσυνθετικής απόδοσης. PPDF, φωτοσυνθετική πυκνότητα ροής φωτονίων. Q, Κερσετίνη; qP, μια παράμετρος που εκτιμά το κλάσμα των ανοιχτών κέντρων PS II με βάση το μοντέλο apuddle. ROS, δραστικά είδη οξυγόνου. SOD, δισμουτάση υπεροξειδίου; Υ(Ι), αποτελεσματική κβαντική απόδοση του PSI. Υ(ΙΙ), αποτελεσματική κβαντική απόδοση του PSII. φE0, κβαντική απόδοση μεταφοράς ηλεκτρονίων πέρα από το QA. φP0,
αγγούρι, εμβολιασμός, θερμικό στρες, Hsp70, Luffa, οξειδωτικό στρες, φωτοσύνθεση