Ολοκληρωμένος σε πυρίτιο χαρακτηρισμός των πρωτεϊνών του παγκόσμιου στρες στο ρύζι (Oryza sativa L.) με τη γνώση της μεταγραφικής διαμόρφωσης που σχετίζεται με το στρες
- Εργαστήριο Αναπαραγωγής Φυτών και Βιοτεχνολογίας, Τμήμα Βοτανικής, Πανεπιστήμιο της Ντάκα, Ντάκα, Μπαγκλαντές
Σε έναν κόσμο όπου η κλιματική αλλαγή είναι πραγματική και οι συνέπειές της είναι άνευ προηγουμένου, η κατανόηση της ικανότητας προσαρμογής των φυτών και των εγγενών μηχανισμών που ανταποκρίνονται στο στρες είναι ζωτικής σημασίας. Τα τελευταία χρόνια, οι πρωτεΐνες του παγκόσμιου στρες (USPs) έχουν λάβει μεγάλη προσοχή στον τομέα της φυτοεπιστήμης λόγω της ειδικής μεταγραφικής τους ρύθμισης για το στρες. Αυτή η μελέτη εστιάζει στον εκτεταμένο χαρακτηρισμό των μελών της οικογένειας γονιδίων USP στο μονοκοτυλήδονο ρύζι (Oryza sativa L. var. japonica). Εδώ, αναφέρουμε συνολικά 44 γονίδια USP στο γονιδίωμα του ρυζιού. Ο in silico χαρακτηρισμός αυτών των γονιδίων έδειξε ότι η αρχιτεκτονική του τομέα έπαιξε σημαντικό ρόλο στη λειτουργική διαφοροποίηση της οικογένειας γονιδίων USP που ισχύει για όλα τα φυτικά USP. Επιπλέον, μια υψηλότερη διατήρηση των μελών OsUSP έχει εκτεθεί με ένα γονιδίωμα μονοκοτυλήδονας (Zea mays L. ) σε σύγκριση με ένα γονιδίωμα δικοτυλήδονας (Arabidopsis thaliana L.). Το προφίλ έκφρασης των ταυτοποιημένων γονιδίων οδήγησε στην ανακάλυψη πολλαπλών γονιδίων OsUSP που έδειξαν έντονη αλλοίωση μεταγραφής κάτω από διάφορες συνθήκες αβιοτικού στρες, υποδεικνύοντας τον πιθανό ρόλο τους ως πολυλειτουργικές ενότητες ειδικές για το στρες. Επιπλέον, η επικύρωση έκφρασης των γονιδίων OsUSP με χρήση qRT-PCR παρείχε ισχυρή απόδειξη για τη χρησιμότητα των γονιδίων OsUSP στην κατασκευή φυτών ανθεκτικών σε πολλές καταπονήσεις. Συνολικά, αυτή η μελέτη παρέχει οδηγούς σε κατάλληλους υποψήφιους USP που θα μπορούσαν να στοχευθούν σε πειράματα αναπαραγωγής φυτών και γενετικής μηχανικής για την ανάπτυξη ειδών καλλιεργειών ανθεκτικών στο στρες. Το προφίλ έκφρασης των ταυτοποιημένων γονιδίων οδήγησε στην ανακάλυψη πολλαπλών γονιδίων OsUSP που έδειξαν έντονη αλλοίωση μεταγραφής κάτω από διάφορες συνθήκες αβιοτικού στρες, υποδεικνύοντας τον πιθανό ρόλο τους ως πολυλειτουργικές ενότητες ειδικές για το στρες. Επιπλέον, η επικύρωση έκφρασης των γονιδίων OsUSP με χρήση qRT-PCR παρείχε ισχυρή απόδειξη για τη χρησιμότητα των γονιδίων OsUSP στην κατασκευή φυτών ανθεκτικών σε πολλές καταπονήσεις. Συνολικά, αυτή η μελέτη παρέχει οδηγούς σε κατάλληλους υποψήφιους USP που θα μπορούσαν να στοχευθούν σε πειράματα αναπαραγωγής φυτών και γενετικής μηχανικής για την ανάπτυξη ειδών καλλιεργειών ανθεκτικών στο στρες. Το προφίλ έκφρασης των ταυτοποιημένων γονιδίων οδήγησε στην ανακάλυψη πολλαπλών γονιδίων OsUSP που έδειξαν έντονη αλλοίωση μεταγραφής κάτω από διάφορες συνθήκες αβιοτικού στρες, υποδεικνύοντας τον πιθανό ρόλο τους ως πολυλειτουργικές ενότητες ειδικές για το στρες. Επιπλέον, η επικύρωση έκφρασης των γονιδίων OsUSP με χρήση qRT-PCR παρείχε ισχυρή απόδειξη για τη χρησιμότητα των γονιδίων OsUSP στην κατασκευή φυτών ανθεκτικών σε πολλές καταπονήσεις. Συνολικά, αυτή η μελέτη παρέχει οδηγούς σε κατάλληλους υποψήφιους USP που θα μπορούσαν να στοχευθούν σε πειράματα αναπαραγωγής φυτών και γενετικής μηχανικής για την ανάπτυξη ειδών καλλιεργειών ανθεκτικών στο στρες.
Εισαγωγή
Η αλλαγή του περιβάλλοντος ανάπτυξης από βέλτιστες σε αντίξοες συνθήκες είναι σύνηθες φαινόμενο στον κύκλο ζωής ενός φυτού. Όντας άμισχα, τα φυτά πρέπει να επιδεικνύουν μια δυναμική απόκριση για να αντιμετωπίσουν λεπτές έως δραστικές αλλαγές στα κοντινά τους καθεστώτα. Τέτοιες αλλαγές μπορεί να κυμαίνονται από ποικίλες οικολογικές παραμέτρους όπως θερμοκρασία, διαθεσιμότητα νερού και θρεπτικών ουσιών, περιεκτικότητα σε αλάτι κ.λπ. έως εγγενείς παράγοντες όπως η συσσώρευση ενεργών ειδών οξυγόνου (ROS). Κάτω από τέτοιες δυσμενείς συνθήκες, τα φυτά μπορεί να υποστούν πολλές επιπτώσεις, π.χ. διακοπή ανάπτυξης και ανάπτυξης, χαμηλότερη φωτοσυνθετική ικανότητα, ανωμαλίες στον χρόνο ανθοφορίας, μειωμένη γονιμότητα και ρυθμό βλάστησης, μειωμένη συνολική απόδοση κ.λπ. (Munns, 2002; Barnabás et al., 2008 ). Για να το ξεπεράσεις αυτό, Τα φυτά έχουν εξελιχθεί εξαιρετικά πολύπλοκες αλλά συντονισμένες αποκρίσεις μέσω της χρονικής και χωρικής ρύθμισης των γονιδίων που μπορούν να μετριάσουν τις ανεπιθύμητες επιπτώσεις που προκύπτουν από διάφορους αβιοτικούς στρεσογόνους παράγοντες. Γενικά, η αντίληψη των στρεσογόνων παραγόντων πυροδοτεί πολλούς καταρράκτες σηματοδότησης στα φυτικά κύτταρα, όπως πρωτεϊνικές κινάσες, φωσφατάσες, παράγοντες μεταγραφής, μοριακούς συνοδούς και πρωτεΐνες που σχετίζονται με την άμυνα που μεσολαβούν σε μια κατάλληλη απόκριση για τη διασφάλιση της επιβίωσης των φυτών (Jung et al., 2015). Ωστόσο, σε έναν κόσμο όπου η κλιματική αλλαγή βιώνει μια ταχεία έξαρση, οι μηχανισμοί που ανταποκρίνονται στο άγχος των φυτών δεν είναι σε θέση να προστατεύσουν το κυτταρικό σύστημα από βλάβες που προκαλούνται από το στρες (Lesk et al., 2016). Αυτές οι συνθήκες έχουν επιταχύνει την αναζήτηση γενετικών συστατικών που προκαλούνται από το στρες που έχουν την ικανότητα να προικίζουν τα φυτά με ενισχυμένη ανθεκτικότητα στο στρες μέσω σύγχρονων βιοτεχνολογικών εργαλείων. Από αυτή την άποψη, οι πιο κατάλληλοι υποψήφιοι περιλαμβάνουν εκείνα τα γονίδια που μπορούν να μεσολαβήσουν στην προστασία από πολλαπλούς στρεσογόνους παράγοντες ταυτόχρονα. Μια τέτοια ομάδα πρωτεϊνών που έχουν έρθει πρόσφατα στο προσκήνιο για τους ρόλους τους που σχετίζονται με το στρες στα φυτά, είναι η οικογένεια των πρωτεϊνών του παγκόσμιου στρες (USP) (Chi et al., 2019).
Η πρώτη USP αναφέρθηκε στο E. coli όπου η υποψήφια πρωτεΐνη ανταποκρίθηκε σε ένα πλήθος περιβαλλοντικών διαταραχών, συμπεριλαμβανομένης της πείνας από θρεπτικά συστατικά, του θερμοκρασιακού σοκ, του οξειδωτικού και οσμωτικού στρες, της τοξικότητας των βαρέων μετάλλων, των αντιβιοτικών κ.λπ. (Nyström and Neidhardt, 1992, Zarembinski et al. ., 1998· Sousa και McKay, 2001). Αργότερα, USPs έχουν αναφερθεί σε πολλούς άλλους οργανισμούς, συμπεριλαμβανομένων άλλων βακτηρίων, αρχαίων, μυκήτων, ακόμη και φυτών (Vollmer and Bark, 2018). Αν και τα USP E. coli κατά δομή περιέχουν μόνο τον τομέα USP, τα φυτικά USP έχουν διαφοροποιηθεί σε μεγάλο βαθμό στη λειτουργία συσσωρεύοντας πρόσθετους βοηθητικούς τομείς που τους επιτρέπουν να συμμετέχουν σε πολλές διαφορετικές λειτουργίες (Chi et al., 2019). Κατά συνέπεια, η πολυλειτουργική φύση των USP προέρχεται από τη δομική τους ποικιλομορφία. Οι πληροφορίες για την εξέλιξη και τη λειτουργία των ΦΠΠΥ των φυτών είναι πολύ περιορισμένες μέχρι σήμερα. Μερικά γονίδια έχουν μελετηθεί στο ρύζι, το Arabidopsis, το βαμβάκι κ.λπ., τα οποία διαπιστώθηκε ότι παίζουν βασικό ρόλο στη ρύθμιση του στρες (Sauter, 2002· Merkouropoulos and Tsaftaris, 2013· Jung et al., 2015). Ωστόσο, αυτές οι μελέτες υποδηλώνουν έντονα τη σημασία των ΦΠΚΥ των φυτών για περαιτέρω μελέτες. Το OsUSP1 από το ρύζι ήταν το πρώτο γονίδιο USP που εντοπίστηκε στο φυτικό βασίλειο που έχει εμπλακεί στην ενεργοποίηση του καταρράκτη σηματοδότησης ως απόκριση στο αιθυλένιο κατά τη διάρκεια της υποξίας (Sauter, 2002). Αναφέρθηκε ότι το κλείσιμο των στομικών ενισχύεται από το SpUSP κατά τη διάρκεια του στρες ξηρασίας για να περιοριστεί η ζημία στις ντομάτες (Loukehaich et al., 2012). Δύο ισομορφές Arabidopsis thaliana USP (At3g62550 και At3g53990) αναφέρθηκαν ότι έδειξαν ενισχυμένη έκφραση υπό ξηρασία (Shinozaki και Yamaguchi-Shinozaki, 2007). Πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης τονίσει τον ρόλο των USPs στην παροχή οφελών κατά τη διάρκεια άλλων αβιοτικών στρες (Udawat et al., 2016). Για παράδειγμα, το γονίδιο AtUSP (At3g53390) επάγεται σημαντικά από το αλάτι, το οσμωτικό στρες και τον τραυματισμό (Isokpehi et al., 2011). Η υπερέκφραση AtUSP (At3g53990) προσέφερε ανοχή έναντι οξειδωτικών και θερμικών καταπονήσεων, ενώ η ευαισθησία σε αυτούς τους στρεσογόνους παράγοντες παρατηρήθηκε σε μεταλλαγμένες σειρές atusp (SALK_146059) (Jung et al., 2015). Το AtUSP βρέθηκε επίσης να εμπλέκεται στο ψυχρό στρες (Melencion et al., 2017). Εκτός από αυτό, το USP ρυθμίζει τη σηματοδότηση με τη μεσολάβηση αιθυλενίου και ως εκ τούτου ρυθμίζει την ωρίμανση των καρπών (Isokpehi et al., 2011). Μια πρωτεΐνη USP ντομάτας, η SlRd2 αλληλεπιδρά με την αλληλεπιδρώσα πρωτεΐνη κινάση τύπου καλσινευρίνης Β (SlCipk6) και εμπλέκεται στη ρύθμιση της παραγωγής ROS (Gutiérrez-Beltrán et al., 2017). Βαμβακερός, Δύο στενά συνδεδεμένα γονίδια GhUSP1 και GhUSP2, εντός της οικογένειας USP αναφέρθηκαν ότι ανταποκρίνονται στην ξηρασία (Maqbool et al., 2009). Επιπλέον, ο προαγωγέας AtUSP έχει δείξει ότι ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση GUS ως απόκριση στο αψισικό οξύ (ABA), το 1-αμινοκυκλοπροπανο-1-καρβοξυλικό οξύ (ACC), την αφυδάτωση, τη ζέστη, το κρύο, το αλάτι και το οσμωτικό στρες (Bhuria et al., 2016) . Αυτή είναι μια σαφής ένδειξη της λειτουργικής ικανότητας των ΦΠΚΥ των εγκαταστάσεων υπό συνθήκες πολλαπλών τάσεων. Σύμφωνα με αυτή τη σημασία, σαράντα ένα γονίδια USP ταυτοποιήθηκαν στο μοντέλο φυτού Arabidopsis thaliana (Bhuria et al., 2019). Από αυτά, τα AtUSP9 και AtUSP12 αναγνωρίστηκαν ως πολλαπλά ανταποκρινόμενα στο στρες. Ο υποκινητής AtUSP έχει δείξει ότι ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση του GUS ως απόκριση στο αψισικό οξύ (ABA), το 1-αμινοκυκλοπροπανο-1-καρβοξυλικό οξύ (ACC), την αφυδάτωση, τη ζέστη, το κρύο, το αλάτι και το οσμωτικό στρες (Bhuria et al., 2016). Αυτή είναι μια σαφής ένδειξη της λειτουργικής ικανότητας των ΦΠΚΥ των εγκαταστάσεων υπό συνθήκες πολλαπλών τάσεων. Σύμφωνα με αυτή τη σημασία, σαράντα ένα γονίδια USP ταυτοποιήθηκαν στο μοντέλο φυτού Arabidopsis thaliana (Bhuria et al., 2019). Από αυτά, τα AtUSP9 και AtUSP12 αναγνωρίστηκαν ως πολλαπλά ανταποκρινόμενα στο στρες. Ο υποκινητής AtUSP έχει δείξει ότι ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση του GUS ως απόκριση στο αψισικό οξύ (ABA), το 1-αμινοκυκλοπροπανο-1-καρβοξυλικό οξύ (ACC), την αφυδάτωση, τη ζέστη, το κρύο, το αλάτι και το οσμωτικό στρες (Bhuria et al., 2016). Αυτή είναι μια σαφής ένδειξη της λειτουργικής ικανότητας των ΦΠΚΥ των εγκαταστάσεων υπό συνθήκες πολλαπλών τάσεων. Σύμφωνα με αυτή τη σημασία, σαράντα ένα γονίδια USP ταυτοποιήθηκαν στο μοντέλο φυτού Arabidopsis thaliana (Bhuria et al., 2019). Από αυτά, τα AtUSP9 και AtUSP12 αναγνωρίστηκαν ως πολλαπλά ανταποκρινόμενα στο στρες. σαράντα ένα γονίδια USP ταυτοποιήθηκαν στο μοντέλο φυτού Arabidopsis thaliana (Bhuria et al., 2019). Από αυτά, τα AtUSP9 και AtUSP12 αναγνωρίστηκαν ως πολλαπλά ανταποκρινόμενα στο στρες. σαράντα ένα γονίδια USP ταυτοποιήθηκαν στο μοντέλο φυτού Arabidopsis thaliana (Bhuria et al., 2019). Από αυτά, τα AtUSP9 και AtUSP12 αναγνωρίστηκαν ως πολλαπλά ανταποκρινόμενα στο στρες.
Το ρύζι είναι μια σημαντική καλλιέργεια και ένα ιδανικό μοντέλο για τη συγκριτική μελέτη των γονιδιακών λειτουργιών λόγω της υψηλής αποτελεσματικότητας του γενετικού μετασχηματισμού και της ευκολίας καλλιέργειας και πολλαπλασιασμού (Basso et al., 2020). Με την απελευθέρωση ολόκληρης της αλληλουχίας του γονιδιώματος του ρυζιού (Song et al., 2019), είναι πολύ βολικό να αναλυθεί διεξοδικά μια ολόκληρη οικογένεια γονιδίων. Πρόσφατα, αναφέρθηκαν 38 γονίδια USP στο ρύζι (ποικιλία Japonica) (Chi et al., 2019). Ωστόσο, δεν υπάρχει ακόμη λεπτομερής ανάλυση του λειτουργικού σχολιασμού και του τρόπου ρύθμισης αυτών των γονιδίων. Λόγω της φύσης των ΦΠΚΥ των φυτών που ανταποκρίνονται σε πολλές καταπονήσεις, είναι επιτακτική ανάγκη να αναζητηθούν οι κατάλληλοι υποψήφιοι που θα μπορούσαν να στοχευθούν για τη βελτίωση της ανθεκτικότητας των καλλιεργειών κάτω από πολλαπλές περιβαλλοντικές αντιξοότητες. Εδώ, Λαμβάνοντας υπόψη τον σημαντικό ρόλο των πρωτεϊνών USP στη ρύθμιση του στρες των φυτών και την έλλειψη πληροφοριών σχετικά με αυτήν την οικογένεια γονιδίων σε ένα είδος καλλιέργειας, η μελέτη μας είχε ως στόχο να εξετάσει την οικογένεια γονιδίων USP στο ρύζι. Αυτή η μελέτη παρέχει έναν σε βάθος βιοπληροφορικό χαρακτηρισμό των αναγνωρισμένων γονιδίων USP μαζί με την αναπτυξιακή και ειδική μεταγραφική τους ρύθμιση για το στρες. Συνολικά, αυτή η μελέτη παρέχει κατάλληλα γονίδια USP για μελλοντικές βιοτεχνολογικές εφαρμογές με στόχο τη δημιουργία γεωργικών καλλιεργειών ανθεκτικών σε πολλές καταπονήσεις και χρησιμεύει ως πλαίσιο για τη διερεύνηση της οικογένειας γονιδίων USP σε άλλα σημαντικά φυτικά είδη. Αυτή η μελέτη παρέχει έναν σε βάθος βιοπληροφορικό χαρακτηρισμό των αναγνωρισμένων γονιδίων USP μαζί με την αναπτυξιακή και ειδική μεταγραφική τους ρύθμιση για το στρες. Συνολικά, αυτή η μελέτη παρέχει κατάλληλα γονίδια USP για μελλοντικές βιοτεχνολογικές εφαρμογές με στόχο τη δημιουργία γεωργικών καλλιεργειών ανθεκτικών σε πολλές καταπονήσεις και χρησιμεύει ως πλαίσιο για τη διερεύνηση της οικογένειας γονιδίων USP σε άλλα σημαντικά φυτικά είδη. Αυτή η μελέτη παρέχει έναν σε βάθος βιοπληροφορικό χαρακτηρισμό των αναγνωρισμένων γονιδίων USP μαζί με την αναπτυξιακή και ειδική μεταγραφική τους ρύθμιση για το στρες. Συνολικά, αυτή η μελέτη παρέχει κατάλληλα γονίδια USP για μελλοντικές βιοτεχνολογικές εφαρμογές με στόχο τη δημιουργία γεωργικών καλλιεργειών ανθεκτικών σε πολλές καταπονήσεις και χρησιμεύει ως πλαίσιο για τη διερεύνηση της οικογένειας γονιδίων USP σε άλλα σημαντικά φυτικά είδη.
Υλικά και μέθοδοι
Ταυτοποίηση, Ονοματολογία γονιδίων και ανάλυση σε πυρίτιο των γονιδίων USP στο ρύζι
Για τον εντοπισμό των γονιδίων USP στο ρύζι, είχε γίνει αναζήτηση blastp και Hidden Markov Model (HMM). Ρύζι [Oryza sativa Japonica Group (Ιαπωνικό ρύζι) cv. Nipponbare] Οι αλληλουχίες πρωτεΐνης USP ανακτήθηκαν από τη δημόσια διαθέσιμη βάση δεδομένων γονιδιώματος στη βάση δεδομένων Rice Annotation Project Database (RAP-DB 1 ) (Sakai et al., 2013) χρησιμοποιώντας Arabidopsis USP (At1g68300) ως αλληλουχία ερωτήματος. Στη συνέχεια, καθεμία από τις πρόσφατα ταυτοποιημένες ακολουθίες χρησιμοποιήθηκε ως ακολουθία ερωτημάτων για την εύρεση των άλλων νέων μελών. Για να επιβεβαιωθεί το αποτέλεσμα από την αναζήτηση HMM και blastp, οι πιθανές ακολουθίες USP αναλύθηκαν επίσης σε σχέση με τη βάση δεδομένων Pfam 2(Mistry et al., 2020). Η ονοματολογία των USPs ρυζιού δόθηκε σύμφωνα με τη χρωμοσωμική θέση σε φθίνουσα σειρά (Hasan et al., 2021). Πληροφορίες σχετικά με το ID του γονιδίου, το μέγεθος πρωτεΐνης και το πλήρους μήκους cDNA, το μοριακό βάρος, το θεωρητικό pI, τον αριθμό των αμινοξέων ελήφθησαν από τη βάση δεδομένων RAP-DB. Ο υποκυτταρικός εντοπισμός των πρωτεϊνών προβλέφθηκε χρησιμοποιώντας το CELLO v.2.5: subCELLular LOcalization predictor 3 (Yu et al., 2006) και το λογισμικό WoLF pSORT 4 (Horton et al., 2007). Το ChloroP 5 (Emanuelsson et al., 1999) χρησιμοποιήθηκε για την επαλήθευση του εντοπισμού του χλωροπλάστη.
Κατανομή Exon-Intron των γονιδίων OsUSP, Αναγνώριση διατηρημένων μοτίβων και περιεκτικότητας σε αμινοξέα στις πρωτεΐνες OsUSP
Το αρχείο σχολιασμού GFF3 για το γονιδίωμα του ρυζιού λήφθηκε από το Ensembl Plants 6 (Howe et al., 2020). Από αυτό το αρχείο εξήχθησαν πληροφορίες σχετικά με τη θέση των περιοχών εξονίων-ιντρονίων και UTR των γονιδίων USP του ρυζιού. Για την αναγνώριση των συντηρημένων μοτίβων, χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό MEME SUITE (v.5.3.3) (Bailey et al., 2009) με όλες τις παραμέτρους να διατηρούνται στις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις εκτός από τον αριθμό των μοτίβων που πρέπει να βρεθούν ορίστηκε σε 10. Το «Γονίδιο Η επιλογή Structure View» του TBtools (v.1.092) (Chen et al., 2020) χρησιμοποιήθηκε για την απεικόνιση της κατανομής εξονίου-ιντρονίου και των διατηρημένων μοτίβων των μελών USP του ρυζιού. Τόσο το τροποποιημένο αρχείο GFF3 όσο και το αρχείο εξόδου MEME SUITE XML χρησιμοποιήθηκαν για αυτήν την εργασία. Η περιεκτικότητα σε αμινοξέα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη συσκευασία Biopython (v.1.78).
Χρωμοσωμικός εντοπισμός των γονιδίων OsUSP και η ανάλυση της σύνθεσής τους με Arabidopsis και γονιδίωμα καλαμποκιού
Η χρωμοσωμική κατανομή κάθε γονιδίου OsUSP ανακτήθηκε από τη βάση δεδομένων Oryzabase για το ρύζι 7 . Για τη μελέτη διπλασιασμού εντός του γονιδιώματος του ρυζιού, δεδομένα που περιλαμβάνουν τις τιμές του συνωνύμου ρυθμού (Ks) και του μη συνωνύμου ρυθμού (Ka) ανακτήθηκαν από τη βάση δεδομένων διπλασιασμού του γονιδιώματος φυτού 8 (Lee et al., 2012). Ο τύπος διπλασιασμού και η πίεση επιλογής υπολογίστηκαν σύμφωνα με τους Hasan et al. (2021). Η εκτιμώμενη ημερομηνία (Mya, εκατομμύρια χρόνια πριν) κάθε συμβάντος διπλασιασμού υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας T = Ks/2λ όπου T είναι χρόνος απόκλισης, Ks είναι ο αριθμός συνώνυμων αντικαταστάσεων ανά τοποθεσία και λ είναι ο σταθερός ρυθμός υποκατάστασης 6,5 × 10 –9μεταλλάξεις ανά συνώνυμη θέση ανά έτος σε χόρτα (Gaut et al., 1996). Οι συνθετικές σχέσεις μεταξύ των γονιδίων USP ρυζιού, Arabidopsis και αραβοσίτου κατασκευάστηκαν και οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας MCScanX (Wang et al., 2012) και TBtools (v.1.092) (Chen et al., 2020), αντίστοιχα. Στα TBtools, η επιλογή “Advanced Circos” χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση των συνθετικών μπλοκ.
Φυλογενετική σχέση μεταξύ των πρωτεϊνών USP ρυζιού, Arabidopsis και E. coli μαζί με την αρχιτεκτονική του τομέα τους
Για να πάρουμε μια ιδέα σχετικά με την εξελικτική ιστορία της οικογένειας γονιδίων USP ρυζιού, πραγματοποιήσαμε μια φυλογενετική ανάλυση χρησιμοποιώντας τις αλληλουχίες πρωτεΐνης USP του ρυζιού, του Arabidopsis και του E. coli. Οι αλληλουχίες πρωτεΐνης Arabidopsis και E. coli USP ανακτήθηκαν από τις βάσεις δεδομένων TAIR (Berardini et al., 2015) και UniProt (UniProt Consortium, 2021), αντίστοιχα. Οι αλληλουχίες πρωτεΐνης ευθυγραμμίστηκαν χρησιμοποιώντας την ηλεκτρονική έκδοση του εργαλείου MAFFT v.7 (Katoh et al., 2019) με προεπιλεγμένες παραμέτρους. Στη συνέχεια, τα κενά στις ευθυγραμμισμένες περιοχές περικόπηκαν χρησιμοποιώντας το εργαλείο Phyutility (v.2.7.1) (Smith and Dunn, 2008) για να διατηρηθεί το 75% της συναινετικής ευθυγράμμισης. Με το περικομμένο αρχείο ευθυγράμμισης πολλαπλών ακολουθιών, κατασκευάστηκε ένα φυλογενετικό δέντρο χρησιμοποιώντας το IQ-Tree v.2.1.2 (Minh et al., 2020) με 1000 αντίγραφα εξαιρετικά γρήγορου bootstrap. Τέλος, το δέντρο οπτικοποιήθηκε και επεξεργάστηκε χρησιμοποιώντας iTOL (v. 6) (Letunic και Bork, 2019). Οι δυνατότητες τομέα μεταφορτώθηκαν ως πρόσθετο σύνολο δεδομένων στην απαιτούμενη μορφή (λεπτομέρειες στη σελίδα βοήθειας iTOL). Οι πληροφορίες τομέα για κάθε πρωτεΐνη USP λήφθηκαν από την Pfam (Finn et al., 2014).
Προσδιορισμός μικροδορυφορικών δεικτών, θέσεων γλυκοζυλίωσης και φωσφορυλίωσης σε OsUSPs
Για την αναγνώριση των δεικτών SSR σε μέλη OsUSP, χρησιμοποιήθηκε ένα εργαλείο αναγνώρισης μικροδορυφόρου (MISA 9 ) (Beier et al., 2017). Η ελάχιστη μονάδα επανάληψης ορίστηκε ως 10 μονάδες για επαναλήψεις μονονουκλεοτιδίου και 5 μονάδες για επαναλήψεις δινουκλεοτιδίου, τρινουκλεοτιδίου, τετρανουκλεοτιδίου, πεντανουκλεοτιδίου και εξανουκλεοτιδίου. Το μέγιστο μήκος αλληλουχίας μεταξύ δύο δεικτών ορίστηκε σε 100 μονάδες. Ο αριθμός των θέσεων γλυκοζυλίωσης στις πρωτεΐνες OsUSP προβλέφθηκε χρησιμοποιώντας τον διακομιστή 10 NetNGlyc 1.0 (Gupta and Brunak, 2002) με όριο 0,5. Οι προβλεπόμενες θέσεις φωσφορυλίωσης όλων των μελών OsUSP αναγνωρίστηκαν χρησιμοποιώντας NetPhos3.1 11(Blom et al., 1999, 2004) με το όριο 0,75. Πραγματοποιήθηκαν προβλέψεις και με τα τρία υπολείμματα (Tyr, Thr, Ser) τόσο για γενική όσο και για ειδική για κινάση φωσφορυλίωση.
Ανάλυση έκφρασης γονιδίων OsUSP σε διαφορετικούς ιστούς, αναπτυξιακά στάδια και συνθήκες πίεσης χρησιμοποιώντας δημόσια διαθέσιμα δεδομένα mRNA-Seq
Τα χρονικά και χωρικά προφίλ έκφρασης των γονιδίων OsUSP ανακτήθηκαν από το Genevestigator 12 (Hruz et al., 2008) για διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια, ανατομικούς ιστούς και ως απόκριση σε συνθήκες στρες (Συμπληρωματικοί Πίνακες 1-3). Δημιουργήθηκαν χάρτες θερμότητας για κάθε τύπο δεδομένων έκφρασης χρησιμοποιώντας την επιλογή “Heatmap Illustrator” στο TBtools v.1.092 (Chen et al., 2020). Οι χάρτες θερμότητας τόσο των προτύπων έκφρασης ιστού όσο και των αναπτυξιακών μοτίβων δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας τις μέσες τιμές έκφρασης μετασχηματισμένες log10. Όσον αφορά την έκφραση υπό συνθήκες πίεσης, η αλλαγή στο log2 φορές στα δεδομένα έκφρασης χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία του Heatmap.
Ανάλυση Cis-Ρυθμιστικών Στοιχείων και GO Εμπλουτισμός Γονιδίων OsUSP
Για την ταυτοποίηση των cis-ρυθμιστικών στοιχείων που υπάρχουν στην υποτιθέμενη περιοχή προαγωγέα, χρησιμοποιήθηκε 1 kb ανοδική αλληλουχία κάθε γονιδίου OsUSP. Στη συνέχεια, οι αλληλουχίες φορτώθηκαν στη βάση δεδομένων PlantCARE 13 (Lescot, 2002) για να ανιχνευθεί η παρουσία διαφόρων cis-στοιχείων. Αργότερα, η παρουσία αυτών των ρυθμιστικών στοιχείων cis οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια γραφική παράσταση στοιβαγμένης ράβδου. Η ανάλυση εμπλουτισμού οντολογίας γονιδίων των γονιδίων OsUSP πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια της βάσης δεδομένων agriGO v.2 (Tian et al., 2017). Τα αποτελέσματα απεικονίστηκαν στην πλατφόρμα προγραμματισμού R.
Θεραπείες ανάπτυξης φυτών και στρες
Για τη διαμόρφωση του προφίλ έκφρασης, ομοιόμορφα αναπτυγμένοι σπόροι ρυζιού της ποικιλίας BRRI-53 τοποθετήθηκαν σε θερμοκήπιο (φωτοπερίοδος 16 ωρών, θερμοκρασία 28 ± 2°C) (Islam et al., 2015). Τα σπορόφυτα ηλικίας 15 ημερών ελήφθησαν στη συνέχεια για διάφορες πειραματικές κατεργασίες όπως αλάτι (200 mM), ξηρασία (μαννιτόλη, 150 mM), οξειδωτικό (30% H2O2), κρύο (4°C), θερμότητα (42°C) και αφυδάτωση (αποξηραμένο στον αέρα), ΑΒΑ (10 mM), γιββερελικό οξύ (GA3, 1 mM), σαλικυλικό οξύ (SA, 2 mM) (Islam et al., 2015). Τα μη επεξεργασμένα σπορόφυτα θεωρήθηκαν ως έλεγχος για τα επεξεργασμένα φυτά. Μετά από 16 ώρες επεξεργασίας, τα φύλλα συλλέχθηκαν (τρία βιολογικά αντίγραφα), καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80°C.
Απομόνωση RNA και Ανάλυση RT-PCR
Σπόροι ρυζιού της ποικιλίας BRRI-53 αναπτύχθηκαν σε ελεγχόμενη περιβαλλοντική κατάσταση θερμοκρασίας 28 ± 2°C και φωτοπεριόδου 16 ωρών σε θάλαμο ανάπτυξης. Σπορόφυτα ηλικίας δεκαπέντε ημερών χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για διάφορες κατεργασίες αβιοτικού στρες όπως αλάτι (200 mM NaCl), ξηρασία (150 mM μαννιτόλη), οξειδωτικό (30% H2O2), κρύο (4°C), θερμότητα (42°C), αφυδάτωση (αποξηραμένη στον αέρα) και ορμονική θεραπεία όπως ABA, GA3 και SA (Islam et al., 2015), για 16 ώρες. Τα μη επεξεργασμένα σπορόφυτα θεωρήθηκαν ως έλεγχος σε όλες αυτές τις καταπονήσεις. Οι ιστοί συλλέχθηκαν και το συνολικό φυτικό RNA απομονώθηκε από βλαστούς ρυζιού χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIZol (Invitrogen, Ηνωμένες Πολιτείες) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Συμπληρωματικό Σχήμα 1).
Ο πρώτος κλώνος cDNA συντέθηκε με ανάστροφη μεταγραφάση (Thermo Fisher Scientific, Ηνωμένες Πολιτείες) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ένα μίγμα αντίδρασης (12 μl) παρασκευάστηκε σε σωληνάριο PCR που περιείχε 10 μl RNA επεξεργασμένου με DNase, 1 μl DEPC-H2O και 1 μl ολίγο dT εκκινητή. Το μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε στους 65°C για 5 λεπτά και ψύχθηκε σε πάγο αμέσως για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, ένα κύριο μείγμα 4 μl που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης 5Χ, 1 μl αναστολέα RNAse Riboblock, 1 μl Revertaid και 2 μl μίγματος 10 mM dNTPs προστέθηκε στους σωλήνες. Το μίγμα επωάστηκε στους 42°C για 60 λεπτά. Μετά τη σύνθεση του πρώτου κλώνου, η αντίδραση τερματίστηκε με θερμική απενεργοποίηση στους 70°C για 5 λεπτά. Η έκφραση μεμονωμένων γονιδίων μετρήθηκε με ειδικούς για το γονίδιο εκκινητές με ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο με κυκλοποιητή Applied biosystem 7500 και μείγμα SYBR Green (Bio-Rad, Ηνωμένες Πολιτείες) (Συμπληρωματικός Πίνακας 4). Η σχετική έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων ποσοτικοποιήθηκε με τη μέθοδο υπολογισμού 2-ΔΔCt (Livak and Schmittgen, 2001), όπου ΔΔCt ήταν η διαφορά στους κύκλους κατωφλίου και το γονίδιο αναφοράς, που ήταν το eEF1 του ρυζιού για τις αναλύσεις έκφρασης (Islam et al. , 2015). Οι αλληλουχίες των ειδικών για το γονίδιο εκκινητών παρέχονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 5.
Στατιστική ανάλυση
Διεξήχθη στατιστική ανάλυση για τα σχετικά κανονικοποιημένα δεδομένα έκφρασης από τρία βιολογικά αντίγραφα κάτω από κάθε επεξεργασία (n = 3). Το τεστ t-ζευγών σπουδαστών διεξήχθη για κάθε θεραπεία έναντι των αντίστοιχων μαρτύρων για να προσδιοριστεί το επίπεδο σημαντικότητας που σημειώθηκε με ∗ , ∗∗ , ∗∗∗ στην περίπτωση τιμής P lt; 0,05, lt;0,01 και lt;0,001. αντίστοιχα.
Μελέτη μοντελοποίησης με βάση την ομολογία και μελέτη μοριακής σύνδεσης
Τρισδιάστατες δομές εννέα USPs δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το εργαλείο MODELLER του MPI bioinformatics toolkit 14(Zimmermann et al., 2018; Gabler et al., 2020) με βάση τα πρότυπα που προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το εργαλείο HHpred. Κρυσταλλική δομή της πρωτεΐνης Usp των μυκοβακτηρίων (PDB-5AHW_F), υποθετική πρωτεΐνη MJ0577 (PDB-1MJH_B), UspA από Lactobacillus plantarum (PDB-3S3F_A), USP από A. thaliana (PDB-3GM3_E-somonasP), USP από 3TNJ_A), USP από Burkholderia pseudomallei (PDB-4WNY_A), Ανθρώπινος Τομέας Κινάσης Cdkl5 (PDB-4BGQ_A), Ψευδοκινάση MLKL από Mus musculus (PDB-4BTF_A) και υποθετική πρωτεΐνη PH0823_χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο PDBUSP (PDBUSP) , OsUSP6, OsUSP14, OsUSP22, OsUSP32, OsUSP33 και OsUSP36, αντίστοιχα. Όλες αυτές οι δομές οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το BIOVIA Discovery Studio v.21.1.0.20298 (BIOVIA, 2021) (Συμπληρωματικό Σχήμα 2).
Η τρισδιάστατη δομή των παραπάνω εννέα πρωτεϊνών OsUSP χρησιμοποιήθηκε ως υποδοχέας για να διαπιστωθεί η συγγένεια δέσμευσης με τρεις καλά εδραιωμένους αναστολείς του E. coli UspA – ZINC000104153710, ZINC000004268284, ZINC0000008020173. Τέσσερις αναστολείς κινάσης – φισετίνη, λουτεολίνη, μυρικετίνη, κερκετίνη (Cassidy and Setzer, 2010) χρησιμοποιήθηκαν για να ελεγχθεί η συγγένεια δέσμευσής τους προς τα OsUSPs που περιέχουν την περιοχή κινάσης. Η τρισδιάστατη χημική δομή αυτών των προσδεμάτων λήφθηκε από τη βάση δεδομένων ένωσης PubChem 15(Kim et al., 2021) ως αρχείο SDF. Η συνολική διαδικασία σύνδεσης έγινε χρησιμοποιώντας το λογισμικό PyRx Virtual Screening (Dallakyan and Olson, 2015) το οποίο χρησιμοποιεί Open Babel (O’Boyle et al., 2011) για εισαγωγή αρχείων SDF, αφαίρεση αλάτων και ελαχιστοποίηση ενέργειας, χρησιμοποιεί εργαλεία AutoDock (Morris et al. ., 2009) για την προετοιμασία της πρωτεΐνης και τη δημιουργία αρχείων εισόδου και το AutoDock Vina (Trott and Olson, 2010) ως οδηγός σύνδεσης. Οι παράμετροι του κιβωτίου πλέγματος ορίστηκαν για να εκτελέσουν μια τυφλή σύνδεση (Hetényi και van der Spoel, 2002) των αναστολέων στις στοχευόμενες πρωτεΐνες. Η αλληλεπίδραση 2-D και 3-D του συμπλέγματος πρωτεΐνης-προσδέματος έχει παρατηρηθεί χρησιμοποιώντας το BIOVIA Discovery Studio v.21.1.0.20298 (BIOVIA, 2021). Συνολικά, ένα στρατηγικό πλαίσιο της παρούσας μελέτης συνοψίζεται στο Σχήμα 1.
Εικόνα 1. Στρατηγικό πλαίσιο της παρούσας μελέτης.
Αποτελέσματα
Ταυτοποίηση γονιδίων USP στο ρύζι
Με βάση την έρευνα blastp και HMM, εντοπίστηκαν συνολικά 44 υποψήφια γονίδια USP στο ρύζι (Oryza sativa L.). Σχετικές λεπτομέρειες σχετικά με αυτά τα γονίδια παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Αυτά τα αναγνωρισμένα γονίδια USP ονομάστηκαν από OsUSP1 σε OsUSP44 με τη σειρά της χρωμοσωμικής τους θέσης. Μεταξύ αυτών, δύο παραλλαγές ματίσματος παρατηρήθηκαν για τα γονίδια OsUSP1, OsUSP2, OsUSP11, OsUSP16, OsUSP20, OsUSP22, OsUSP25, OsUSP27, OsUSP30, OsUSP31 και OsUSP35. ενώ το OsUSP12 είχε τρεις παραλλαγές ματίσματος. Το μήκος της συναγόμενης συμπληρωματικής αλληλουχίας DNA (CDS) των OsUSPs κυμαινόταν από 222 bp (OsUSP31) έως 2817 bp (OsUSP20). Συνολικά, τα σαράντα τέσσερα γονίδια OsUSP κωδικοποιούσαν συνολικά 57 πρωτεΐνες. Το μήκος της πρωτεΐνης κυμαινόταν από 74 aa (OsUSP31) έως 939 aa (OsUSP20). Εν τω μεταξύ, το βάρος της πρωτεΐνης διέφερε πολύ από το χαμηλότερο των 17,22 kDa (OsUSP13) έως το υψηλότερο των 120. 81 kDa (OsUSP41) και το προβλεπόμενο ισοηλεκτρικό σημείο κυμαίνεται από 4,74 (OsUSP30) έως 10,39 (OsUSP37). Η πρόβλεψη του υποκυτταρικού εντοπισμού στο silico έδειξε ότι τα OsUSPs εντοπίστηκαν στο κυτταρόπλασμα, τα μιτοχόνδρια, τον πυρήνα και τον χλωροπλάστη (Πίνακας 1).
Πίνακας 1. Κατάλογος ταυτοποιημένων γονιδίων OsUSP μαζί με τα μοριακά τους χαρακτηριστικά.
Ανάλυση γονιδιακής δομής OsUSP, διατηρημένων μοτίβων και περιεχομένου αμινοξέων
Για την καλύτερη κατανόηση της ανάπτυξης της οικογένειας γονιδίων OsUSP, αναλύθηκε η κατανομή εξονίου-ιντρονίου των γονιδίων OsUSP. Γενικά, ο αριθμός των εξονίων και των ιντρονίων στα γονίδια OsUSP έδειξε μέτρια διακύμανση (Εικόνα 2Α). Στην περίπτωση των εσωνίων, οι αριθμοί κυμαίνονταν από το μηδέν έως το δέκα, με το OsUSP32 να έχει τον υψηλότερο και το OsUSP23 τον μικρότερο αριθμό εσωνίων (10 και 0, αντίστοιχα). Κατά μέσο όρο, τα γονίδια OsUSP που περιείχαν τομείς USP και κινάσης είχαν μεγαλύτερο αριθμό ιντρονίων σε σύγκριση με εκείνα με μόνο τομέα USP. Αυτό δείχνει μια ομοιότητα στην αρχιτεκτονική εξονίου-ιντρονίου μεταξύ γονιδίων που ήταν πιο παρόμοια σε επίπεδο πρωτεΐνης. Ομοίως, ο αριθμός των εξονίων κυμαινόταν από ένα έως έντεκα, με το OsUSP32 να έχει τον μεγαλύτερο αριθμό εξονίων. Μόνο ένα εξόνιο βρέθηκε σε τέσσερα γονίδια, συγκεκριμένα – OsUSP19, OsUSP23, OsUSP26 και OsUSP30. Αρκετά γονίδια OsUSP όπως τα OsUSP1, OsUSP12, OsUSP25, OsUSP31 περιέχουν πολλαπλές περιοχές 3′-UTR. Αυτό πιθανότατα αντανακλά τη δυνατότητα εναλλακτικού ματίσματος σε αυτά τα γονίδια.
Εικόνα 2. Επισκόπηση της δομής του γονιδίου, των διατηρημένων μοτίβων και της σύνθεσης αμινοξέων των μελών OsUSP. (Α) Κατανομή εξονίου-ιντρονίου όλων των αναγνωρισμένων γονιδίων OsUSP. Το κίτρινο και το πράσινο πλαίσιο υποδεικνύουν τις περιοχές εξωνίου και UTR, αντίστοιχα, ενώ οι μαύρες γραμμές υποδεικνύουν τη θέση των εσωνίων. (Β) Η θέση των συντηρημένων μοτίβων στα OsUSP. Κάθε έγχρωμο πλαίσιο υποδεικνύει ένα μοναδικό μοτίβο (οι μύθοι παρέχονται στο σχήμα). Οι δύο κλίμακες στο κάτω μέρος δείχνουν το μήκος γονιδίου (αριστερά) και πρωτεΐνης (δεξιά). Ένα δέντρο μέγιστης πιθανότητας με 1000 αντίγραφα εξαιρετικά γρήγορου bootstrap κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το IQ-Tree. Οι τιμές του bootstrap δίνονται ως αριθμοί στους εσωτερικούς κόμβους. (ΝΤΟ)Η σύνθεση αμινοξέων (aa) των OsUSPs φαίνεται σε ένα διάγραμμα στοιβαγμένων ράβδων. Η εκατοστιαία περιεκτικότητα κάθε αμινοξέος υποδεικνύεται με διαφορετικό χρώμα (δείτε την εικόνα για λεπτομέρειες).
Η αποσαφήνιση των διατηρημένων μοτίβων χρησιμοποιώντας λογισμικό MEME αποκάλυψε συνολικά 10 διατηρημένα μοτίβα μεταξύ των πρωτεϊνών USP ρυζιού (Εικόνα 2Β). Όπως αναμενόταν, υπήρχε αρκετή διαφοροποίηση όσον αφορά τον αριθμό των μοτίβων σε κάθε πρωτεΐνη. Γενικά, οι περισσότερες πρωτεΐνες περιείχαν είτε τρία, εννέα είτε και τα 10 από τα διατηρημένα μοτίβα. Αυτή η παρατήρηση συνέπεσε τέλεια με την παρουσία και των τριών τομέων – USP, Kinase και U-Box. δύο τομείς – USP και Kinase. ή απλώς ένα μοναδικό πεδίο USP στην πρωτεΐνη. Στην πρώτη περίπτωση, βρέθηκαν 10 μοτίβα στις πρωτεΐνες, ενώ για εκείνες με μόνο τον τομέα USP, ο αριθμός των διατηρημένων μοτίβων ήταν μεταξύ ενός και τριών. Από αυτή την παρατήρηση, θα μπορούσε να συναχθεί ότι τα μοτίβα 3, 4 και 7 σχετίζονται με τον τομέα USP. Τα μοτίβα 1, 2, 5, 6, 8 και 9 συνδέονται με την περιοχή κινάσης και το μοτίβο 10 αντιστοιχεί στην περιοχή U-box. Επιπλέον, η σύνθεση αμινοξέων (aa) των OsUSPs (Εικόνα 2C) έδειξε ότι τα OsUSPs με την ίδια περιοχή(ες) εμφανίζουν μεγαλύτερη ομοιότητα στο πρότυπο aa τους σε σύγκριση με εκείνα με ελαφρώς διαφορετικά χαρακτηριστικά περιοχής. Αυτό μπορεί να επεξηγηθεί εξετάζοντας τη σύνθεση aa του USP 32-39 (Εικόνα 2C). Εδώ, το USP 32-35 και το 38-39 έχουν και ένα USP και ένα πεδίο κινάσης και είναι σχετικά όμοια στη σύνθεσή τους αα. Ωστόσο, οι USP36 και USP35 στερούνται πεδίου κινάσης και είναι ευδιάκριτο ότι η σύνθεσή τους αα είναι πιο διαφορετική από την USP 32-35 και 38-39. Φαίνεται ότι υπάρχει μια συνέπεια στη δομή των γονιδίων, τη διατήρηση του μοτίβου και τη σύνθεση ΑΑ με τον τύπο του τομέα που περιέχει ένα δεδομένο OsUSP. η σύνθεση αμινοξέων (aa) των OsUSPs (Εικόνα 2C) έδειξε ότι τα OsUSPs με την ίδια περιοχή(ες) παρουσιάζουν μεγαλύτερη ομοιότητα στο πρότυπο αα τους σε σύγκριση με εκείνα με ελαφρώς διαφορετικά χαρακτηριστικά τομέα. Αυτό μπορεί να επεξηγηθεί εξετάζοντας τη σύνθεση aa του USP 32-39 (Εικόνα 2C). Εδώ, το USP 32-35 και το 38-39 έχουν και ένα USP και ένα πεδίο κινάσης και είναι σχετικά όμοια στη σύνθεσή τους αα. Ωστόσο, οι USP36 και USP35 στερούνται πεδίου κινάσης και είναι ευδιάκριτο ότι η σύνθεσή τους αα είναι πιο διαφορετική από την USP 32-35 και 38-39. Φαίνεται ότι υπάρχει μια συνέπεια στη δομή των γονιδίων, τη διατήρηση του μοτίβου και τη σύνθεση ΑΑ με τον τύπο του τομέα που περιέχει ένα δεδομένο OsUSP. η σύνθεση αμινοξέων (aa) των OsUSPs (Εικόνα 2C) έδειξε ότι τα OsUSPs με την ίδια περιοχή(ες) παρουσιάζουν μεγαλύτερη ομοιότητα στο πρότυπο αα τους σε σύγκριση με εκείνα με ελαφρώς διαφορετικά χαρακτηριστικά τομέα. Αυτό μπορεί να επεξηγηθεί εξετάζοντας τη σύνθεση aa του USP 32-39 (Εικόνα 2C). Εδώ, το USP 32-35 και το 38-39 έχουν και ένα USP και ένα πεδίο κινάσης και είναι σχετικά όμοια στη σύνθεσή τους αα. Ωστόσο, οι USP36 και USP35 στερούνται πεδίου κινάσης και είναι ευδιάκριτο ότι η σύνθεσή τους αα είναι πιο διαφορετική από την USP 32-35 και 38-39. Φαίνεται ότι υπάρχει μια συνέπεια στη δομή των γονιδίων, τη διατήρηση του μοτίβου και τη σύνθεση ΑΑ με τον τύπο του τομέα που περιέχει ένα δεδομένο OsUSP. Το USP 32-35 και το 38-39 έχουν και ένα USP και ένα πεδίο κινάσης και είναι σχετικά όμοια στη σύνθεσή τους αα. Ωστόσο, οι USP36 και USP35 στερούνται πεδίου κινάσης και είναι ευδιάκριτο ότι η σύνθεσή τους αα είναι πιο διαφορετική από την USP 32-35 και 38-39. Φαίνεται ότι υπάρχει μια συνέπεια στη δομή των γονιδίων, τη διατήρηση του μοτίβου και τη σύνθεση ΑΑ με τον τύπο του τομέα που περιέχει ένα δεδομένο OsUSP. Το USP 32-35 και το 38-39 έχουν και ένα USP και ένα πεδίο κινάσης και είναι σχετικά όμοια στη σύνθεσή τους αα. Ωστόσο, οι USP36 και USP35 στερούνται πεδίου κινάσης και είναι ευδιάκριτο ότι η σύνθεσή τους αα είναι πιο διαφορετική από την USP 32-35 και 38-39. Φαίνεται ότι υπάρχει μια συνέπεια στη δομή των γονιδίων, τη διατήρηση του μοτίβου και τη σύνθεση ΑΑ με τον τύπο του τομέα που περιέχει ένα δεδομένο OsUSP.
Χρωμοσωμική Κατανομή και Ανάλυση Σύνθετης
Τα ταυτοποιημένα γονίδια OsUSP κατανεμήθηκαν σε 11 από τα 12 χρωμοσώματα ρυζιού (Εικόνα 3Α). Ο ακριβής αριθμός των γονιδίων OsUSP ανά χρωμόσωμα διέφερε ευρέως. Το χρωμόσωμα 2 περιείχε τον μεγαλύτερο αριθμό οκτώ γονιδίων USP, ακολουθούμενο από το χρωμόσωμα 1 με επτά γονίδια. Ένας σχετικά μέτριος αριθμός γονιδίων USP βρέθηκε στα χρωμοσώματα 5 και 12, όπου ο αριθμός έφτασε στα έξι και πέντε, αντίστοιχα. Και τα δύο χρωμοσώματα 3 και 10 περιείχαν τέσσερα μέλη. Όσο για άλλα χρωμοσώματα, ο αριθμός των μελών της οικογένειας γονιδίων USP κυμαινόταν από ένα έως τρία, με το χρωμόσωμα 4 να είναι η μόνη εξαίρεση, το οποίο δεν περιείχε κανένα γονίδιο USP.
Εικόνα 3. Χρωμοσωμικός εντοπισμός και συνθετική σχέση γονιδίων USP ρυζιού. (Α) Κατανομή 44 γονιδίων OsUSP σε 11 χρωμοσώματα ρυζιού. Κάθε γονίδιο OsUSP έδειξε την ακριβή θέση ενός συγκεκριμένου χρωμοσώματος που μπορούσε να υπολογιστεί χρησιμοποιώντας την κλίμακα που παρέχεται στα αριστερά. Κάθε αριθμός χρωμοσώματος υποδεικνύεται στην κορυφή κάθε ράβδου χρωμοσώματος. Το μέγιστο οκτώ γονίδια συγκεντρώθηκαν στο χρωμόσωμα 2, ενώ τουλάχιστον ένα γονίδιο υπήρχε στο χρωμόσωμα αρ. 8 και 11. Η αριστερή ράβδος αντιπροσωπεύει κλίμακα σε Megabase (Mb). (ΣΙ)Ανάλυση synteny του γονιδιώματος του ρυζιού με τον εαυτό του, με Arabidopsis thaliana και με γονιδιώματα αραβοσίτου. Τα μπλοκ Synteny που αντιστοιχούν στα γονίδια OsUSP υποδεικνύονταν με διαφορετικά χρώματα. Οι μπλε γραμμές υποδεικνύουν synteny μεταξύ των γονιδίων OsUSP, η κόκκινη γραμμή υποδηλώνει συντεινότητα μεταξύ των γονιδίων OsUSP και των ορθολόγων τους στο Arabidopsis thaliana και οι πράσινες γραμμές υποδεικνύουν συντεινότητα μεταξύ των γονιδίων OsUSP και των ορθολόγων τους στον αραβόσιτο. Τα χρωμοσώματα των τριών ειδών εμφανίστηκαν σε διαφορετικά χρώματα – το κόκκινο, το ροζ και το πράσινο αντιπροσωπεύουν το ρύζι, το Arabidopsis thaliana και τα χρωμοσώματα αραβοσίτου, αντίστοιχα. Υποδείχθηκαν επίσης θέσεις όλων των γονιδίων OsUSP (μπλε) και των ομολόγων τους σε δύο άλλα είδη (μαύρο).
Τα γεγονότα διπλασιασμού γονιδίων μεταξύ των γονιδίων OsUSP διερευνήθηκαν για να αξιολογηθεί η επέκταση των μελών της οικογένειας αυτού του γονιδίου. Συνολικά 11 ζεύγη γονιδίων OsUSP βρέθηκαν να διπλασιάζονται- OsUSP1 και OsUSP22, OsUSP2 και OsUSP23, OsUSP2 και OsUSP17, OsUSP4 και OsUSP29, OsUSP5 και OsUSP26, OsUSP6 και OsUSP25, OsUSP4 και OsUSP25, OsUSP4 και OsUSP29, OsUSP2 και OsUSP29 και OsUSP31, και OsUSP2 και OsUSP23 (Συμπληρωματικός Πίνακας 6). Όλα διαθέτουν τμηματικό τύπο διπλασιασμού, εκτός από ένα με διαδοχικό τύπο. Παρατηρήθηκε αρνητική επιλογή για όλα τα διπλά ζεύγη εκτός από ένα με αναλογία μη συνωνύμων (Ka) προς συνώνυμες (Ks) τιμές περισσότερες από μία. Ο υπολογισμένος χρόνος απόκλισης του διπλασιασμού κυμαινόταν από 28 έως 150 Mya (Συμπληρωματικός Πίνακας 6).
Διεξήχθη ανάλυση χρωμοσωμικής συντενίας για την κατανόηση της επέκτασης και της διαφοροποίησης των γονιδίων USP εντός του γονιδιώματος του ρυζιού και για σύγκριση με άλλους μονοκοτυλήδονους (αραβόσιτος) και δικοτυλήδονους (Arabidopsis) οργανισμούς (Εικόνα 3Β). Τόσο ο τμηματικός όσο και ο διαδοχικός διπλασιασμός ήταν ορατοί για τα γονίδια USP εντός του γονιδιώματος του ρυζιού, με το πρώτο να κυριαρχεί στο δεύτερο. Συνολικά δεκαέξι παράλογα γονίδια USP αναγνωρίστηκαν στο γονιδίωμα του ρυζιού που εντοπίστηκαν στα χρωμοσώματα 1, 2, 5, 6, 11 και 12. Ενώ, ανιχνεύθηκε ένας μεμονωμένος διπλός διπλασιασμός στο χρωμόσωμα 12 μεταξύ OsUSP43 και OsUSP44. Ενδιαφέρουσες παρατηρήσεις ήρθαν στο φως κατά τη συνθετική σύγκριση των γονιδίων OsUSP με το Arabidopsis και τον αραβόσιτο. Ξεκινώντας με το γονιδίωμα δικοτυλήδονων, μόνο τέσσερις ορθολόγοι OsUSP ανιχνεύθηκαν στο γονιδίωμα Arabidopsis και περιορίστηκαν στα χρωμοσώματα AtChr3 και AtChr5 (Εικόνα 3Β). Σε αντίθεση με αυτό, ένας σχετικά μεγάλος αριθμός ορθολόγων OsUSP ανιχνεύθηκε στο μονοκοτυλήδονο καλαμπόκι. Συνολικά, 37 ορθολογικά γονίδια διασκορπίστηκαν σε όλα τα χρωμοσώματα αραβοσίτου (Εικόνα 3Β). Αυτό πιθανώς υποδεικνύει ότι τα γονίδια OsUSP έχουν αποκλίνει περισσότερο από τα αντίστοιχα τους στο γονιδίωμα Arabidopsis σε σύγκριση με την πιο στενά συγγενή μονοκοτυλήδονα, τον αραβόσιτο. Συνολικά, αυτό δείχνει ότι τόσο ο διπλασιασμός όσο και η έντονη διαφοροποίηση έχουν παίξει έναν χαρακτηριστικό ρόλο στην εξέλιξη της οικογένειας γονιδίων OsUSP. αραβόσιτος. Συνολικά, αυτό δείχνει ότι τόσο ο διπλασιασμός όσο και η έντονη διαφοροποίηση έχουν παίξει έναν χαρακτηριστικό ρόλο στην εξέλιξη της οικογένειας γονιδίων OsUSP. αραβόσιτος. Συνολικά, αυτό δείχνει ότι τόσο ο διπλασιασμός όσο και η έντονη διαφοροποίηση έχουν παίξει έναν χαρακτηριστικό ρόλο στην εξέλιξη της οικογένειας γονιδίων OsUSP.
Φυλογένεση ΦΠΚΥ από τρία είδη και η αρχιτεκτονική του τομέα τους
Για να διερευνήσουμε το εξελικτικό πρότυπο των πρωτεϊνών USP σε τρία είδη – ρύζι, Arabidopsis και E. coli, πραγματοποιήσαμε μια φυλογενετική ανάλυση χρησιμοποιώντας όλα τα μέλη USP τους (Εικόνα 4). Η προσθήκη της αρχιτεκτονικής τομέα αυτών των πρωτεϊνών στο δέντρο έδειξε δύο σαφείς συστάδες – το ένα με μέλη που περιέχουν μόνο έναν τομέα USP (Εικόνα 4, πράσινο σύμπλεγμα) και το άλλο με μέλη που περιέχουν ως επί το πλείστον έναν επιπλέον τομέα κινάσης πάνω από τον τομέα USP (Εικόνα 4, κίτρινο σύμπλεγμα). Συνολικά, ο αριθμός των πρωτεϊνών με μόνο έναν τομέα USP ήταν υψηλότερος από τον άλλο τύπο με μεγαλύτερη δομική ποικιλομορφία όσον αφορά την αρχιτεκτονική του τομέα τους. Εστιάζοντας στο κίτρινο σύμπλεγμα, τα περισσότερα μέλη είχαν μια περιοχή κινάσης επιπλέον της χαρακτηριστικής περιοχής USP. Για ορισμένα μέλη, μπορεί επίσης να φανεί η παρουσία ενός τομέα U-box. Με ενδιαφέρο, Δύο USPs ρυζιού που δεν έχουν περιοχή κινάσης (OsUSP10 και 41) βρέθηκαν επίσης να ομαδοποιούνται σε αυτό το σύμπλεγμα. Όσον αφορά τη σύγκριση της εξέλιξης των USP μεταξύ των ειδών, όλα τα USP E. coli ομαδοποιήθηκαν στην πρώτη συστάδα (πράσινο). Μια πιο προσεκτική επιθεώρηση του δέντρου έδειξε ότι τα USP συνήθως συγκεντρώνονταν πιο κοντά σε έναν παράλογο από το ίδιο είδος και όχι στον ορθολογικό του από άλλο είδος. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι μόνο σε έναν σχετικά μικρό αριθμό περιπτώσεων μπορούν να εντοπιστούν καθαροί ορθόλογοι μεταξύ των δύο ειδών στο δέντρο της Εικόνας 4. Για παράδειγμα, σαφείς ορθολογίες στο Arabidopsis μπορούσαν να διακριθούν μόνο για USPs ρυζιού – 9, 11, 14, 17, 25 και 37. Μια πιο προσεκτική επιθεώρηση του δέντρου έδειξε ότι τα USP συνήθως συγκεντρώνονταν πιο κοντά σε έναν παράλογο από το ίδιο είδος και όχι στον ορθολογικό του από άλλο είδος. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι μόνο σε έναν σχετικά μικρό αριθμό περιπτώσεων μπορούν να εντοπιστούν καθαροί ορθόλογοι μεταξύ των δύο ειδών στο δέντρο της Εικόνας 4. Για παράδειγμα, σαφείς ορθολογίες στο Arabidopsis μπορούσαν να διακριθούν μόνο για USPs ρυζιού – 9, 11, 14, 17, 25 και 37. Μια πιο προσεκτική επιθεώρηση του δέντρου έδειξε ότι τα USP συνήθως συγκεντρώνονταν πιο κοντά σε έναν παράλογο από το ίδιο είδος και όχι στον ορθολογικό του από άλλο είδος. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι μόνο σε έναν σχετικά μικρό αριθμό περιπτώσεων μπορούν να εντοπιστούν καθαροί ορθόλογοι μεταξύ των δύο ειδών στο δέντρο της Εικόνας 4. Για παράδειγμα, σαφείς ορθολογίες στο Arabidopsis μπορούσαν να διακριθούν μόνο για USPs ρυζιού – 9, 11, 14, 17, 25 και 37.
Εικόνα 4.Φυλογενετική σχέση μεταξύ ρυζιού, Arabidopsis thaliana και E. coli USPs. Ένα δέντρο μέγιστης πιθανότητας με 1000 αντίγραφα εξαιρετικά γρήγορου bootstrap δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας το IQ-Tree. Το τελικό δέντρο οπτικοποιήθηκε και επεξεργάστηκε στο iTOL. Τα μέλη USP από τα τρία διαφορετικά είδη καθορίζονται χρησιμοποιώντας διαφορετικά χρωματιστά σχήματα – μπλε ορθογώνια, κόκκινοι κύκλοι και πράσινα αστέρια προσδιορίζουν διαδοχικά τα USP Arabidopsis thaliana, Oryza sativa και E. coli. Συνολικά, οι USPs υποομαδοποιήθηκαν σε δύο ομάδες – πράσινο και κίτρινο με βάση την αρχιτεκτονική του τομέα κάθε πρωτεΐνης. Οι πράσινες συστάδες περιέχουν αποκλειστικά πρωτεΐνη που φιλοξενεί μόνο έναν τομέα USP. Όσον αφορά το κίτρινο σύμπλεγμα, σχεδόν όλα τα μέλη διαθέτουν μια επιπλέον περιοχή κινάσης ή U-Box ή και τα δύο (εκτός από μερικά).
In silico Αναγνώριση SSR και Πρόβλεψη θέσεων γλυκοζυλίωσης και φωσφορυλίωσης
Οι μοριακοί δείκτες επιτρέπουν την ταυτοποίηση των γονιδίων που ενδιαφέρουν σε μια συγκεκριμένη τοποθεσία. Ένα κύριο μέλημα της ανάλυσης του γονιδιώματος είναι η διερεύνηση μοριακών δεικτών που σχετίζονται με γενετικούς παράγοντες που υποκρύπτουν παρατηρήσιμα χαρακτηριστικά. Σαράντα τέσσερα γονίδια OsUSP με όλες τις παραλλαγές ματίσματος αναλύθηκαν για δείκτες SSR. Από τις 61 αλληλουχίες, 19 δείκτες SSR κατανεμήθηκαν σε 15 αλληλουχίες. Οι πιο άφθονες ήταν οι επαναλήψεις τρινουκλεοτιδίων που αντιστοιχούσαν στο 89,47% (17 εμφανίσεις), ακολουθούμενες από τις μονονουκλεοτιδικές και τις δινουκλεοτιδικές επαναλήψεις και οι δύο με μία εμφάνιση να αντιπροσωπεύει το 5,26% όλων των SSR, δεν βρέθηκαν επαναλήψεις τετρα, πεντα ή εξανουκλεοτιδίου. Το κυρίαρχο μοτίβο SSR ήταν το GCG με συχνότητα 47,36 με εννέα εμφανίσεις ακολουθούμενες από άλλες μονο, δι και τρινουκλεοτιδικές επαναλήψεις (Συμπληρωματικός Πίνακας 7). Μεγαλύτεροι αριθμοί επαναλήψεων παρατηρήθηκαν σε τρινουκλεοτιδικά SSR. Πολλές αλληλουχίες που διαθέτουν περισσότερους από έναν δείκτες SSR βρέθηκαν τρεις. Επιπλέον, η γλυκοζυλίωση παίζει βασικό ρόλο στη δευτερογενή επεξεργασία πρωτεΐνης για τη λειτουργία της πρωτεΐνης μέσα στα κύτταρα και στον προσδιορισμό της δομής, της λειτουργίας και της σταθερότητας της πρωτεΐνης. Σε αυτή τη μελέτη, 25 από τα 44 OsUSPs έχουν δείξει μία έως πολλές προβλεπόμενες θέσεις γλυκοζυλίωσης με το όριο 0,5. Συνολικά 68 θέσεις γλυκοζυλίωσης έχουν προβλεφθεί σε 25 πρωτεΐνες OsUSP. Ο μεγαλύτερος αριθμός θέσεων γλυκοζυλίωσης βρέθηκε στο OsUSP8 με εννέα θέσεις ακολουθούμενες από τις OsUSP10, OsUSP32, OsUSP35 (πέντε θέσεις) και OsUSP27, OsUSP33, OsUSP38 με τέσσερις θέσεις. Η βαθμολογία Ν-γλυκοζυλίωσης είναι μεγαλύτερη από 0,5 και η συμφωνία της κριτικής επιτροπής 9/9 ή δυνητικό gt;0,75 υποδηλώνει υψηλή ειδικότητα της θέσης γλυκοζυλίωσης. Μεταξύ των 68 προβλεπόμενων τοποθεσιών, 19 θέσεις σε 13 πρωτεΐνες OsUSP έχουν τη δυνητική βαθμολογία μεγαλύτερη από 0,5 και τη συμφωνία της κριτικής επιτροπής 9/9, και επομένως, έχουν την υψηλότερη πιθανότητα σχηματισμού σταθερής δομής με μεσολάβηση γλυκοζυλίωσης (Συμπληρωματικός Πίνακας 8). Η πρωτεϊνική φωσφορυλίωση είναι ο άλλος πιο σημαντικός τύπος μετα-μεταφραστικής τροποποίησης κυττάρων όπου οι πρωτεϊνικές κινάσες φωσφορυλιώνουν ένα υπόλειμμα αμινοξέος, κυρίως Tyr, Thr, Ser στην περίπτωση των ευκαρυωτών με την προσθήκη ομοιοπολικά συνδεδεμένων φωσφορικών ομάδων. Ένας σημαντικός αριθμός θέσεων φωσφορυλίωσης προβλέφθηκε σε όλα τα μέλη του OsUSP (Συμπληρωματικός Πίνακας 9). Ο υψηλότερος αριθμός θέσεων φωσφορυλίωσης προβλέφθηκε στο OsUSP20, ακολουθούμενο από το OsUSP29, το OsUSP27 και το OsUSP39. Τα προβλεπόμενα αποτελέσματα έδειξαν επίσης ότι οι θέσεις σερίνης (S) ήταν περισσότερο φωσφορυλιωμένες από τις θέσεις θρεονίνης (Τ) και τυροσίνης (Υ). Όσον αφορά τα είδη των κινασών,
Ανάλυση του προτύπου έκφρασης των γονιδίων OsUSP κατά τη διάρκεια των αναπτυξιακών σταδίων και σε διάφορους ιστούς ρυζιού
Για να λάβουμε μια ιδέα σχετικά με το μέγεθος της έκφρασης των γονιδίων OsUSP, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση έκφρασης χρησιμοποιώντας προηγουμένως δημιουργημένα μεταγραφικά δεδομένα για γονίδια OsUSP κατά τη διάρκεια διαφορετικών αναπτυξιακών σταδίων (Εικόνα 5Α) και ανατομικών ιστών (Εικόνα 5Β). Τα περισσότερα από τα γονίδια OsUSP εμφανίζουν σταθερά υψηλά επίπεδα έκφρασης σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια (Εικόνα 5Α) εκτός από τα OsUSP18, OsUSP40, OsUSP41 και OsUSP42. Αυτά τα γονίδια δείχνουν σχετικά χαμηλά επίπεδα έκφρασης σε όλα σχεδόν τα στάδια. Ωστόσο, ορισμένοι ενδιαφέροντες υποψήφιοι εμφανίζουν κατά προτίμηση υψηλή έκφραση σε ορισμένα στάδια. Για παράδειγμα, το OsUSP15 εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό κατά το στάδιο της ανθοφορίας και της κλάσης, αλλά λιγότερο εμφανές κατά τη διάρκεια της βλάστησης, της φύτευσης, της καλλιέργειας και του ώριμου κόκκου. Μια παρόμοια παρατήρηση ισχύει για τα OsUSP8 και OsUSP37 με το τελευταίο να δείχνει ισχυρότερη αντίθεση στην έκφραση.
Εικόνα 5. Επισκόπηση του αναπτυξιακού σταδίου και του ειδικού για ιστό προφίλ έκφρασης των γονιδίων OsUSP. (Α) Πρότυπο έκφρασης κάθε γονιδίου OsUSP κατά τη διάρκεια πολλαπλών αναπτυξιακών σταδίων φυτών ρυζιού. (Β) Πρότυπο έκφρασης των γονιδίων OsUSP σε διαφορετικούς ιστούς φυτών ρυζιού. Το αναπτυξιακό στάδιο και τα δεδομένα έκφρασης ειδικά για τον ιστό λήφθηκαν από το Genevestigator χρησιμοποιώντας τα αντίστοιχα γονιδιακά ID των USPs ρυζιού. Τα επίπεδα ακατέργαστης έκφρασης μετασχηματίστηκαν log10 και οπτικοποιήθηκαν με την επιλογή “Heatmap Illustrator” στο TBtools (v.1.092). Η κλίμακα υποδεικνύει το μέγεθος της γονιδιακής έκφρασης. Το φυλογενετικό δέντρο είναι το ίδιο με αυτό που φαίνεται στο Σχήμα 2.
Προχωρώντας στα προφίλ έκφρασης στους ιστούς, παρατηρήθηκε ένα παρόμοιο μοτίβο όπου τα περισσότερα γονίδια OsUSP εμφάνισαν μέτρια έως υψηλά επίπεδα έκφρασης σε όλους τους ιστούς (Εικόνα 5Β), με εξαίρεση τα OsUSP4, OsUSP8, OsUSP15, OsUSP18, OsUSP28, OsUSP37, OsUSP40, OsUSP41, και OsUSP42. Ορισμένα γονίδια παρουσίασαν μικτό σχέδιο, ενώ ορισμένοι ιστοί εμφανίζουν υψηλότερη έκφραση για λίγα γονίδια από άλλους. Το OsUSP4 έδειξε πολύ υψηλή έκφραση σε ιστούς ταξιανθίας αλλά μέτριο έως χαμηλό επίπεδο έκφρασης σε άλλους. Συγκριτικά, το OsUSP37 είχε πολύ χαμηλή έκφραση στις ρίζες, τους βλαστούς, τα φύλλα και τα σπορόφυτα αλλά υψηλή έκφραση στους ιστούς ταξιανθίας. Συνολικά, τα περισσότερα γονίδια OsUSP έδειξαν ένα αξιόλογο επίπεδο έκφρασης τόσο κατά τη διάρκεια διαφορετικών αναπτυξιακών σταδίων και ιστών του φυτού.
Ανάλυση του ειδικού για το στρες μοτίβο έκφρασης των γονιδίων OsUSP και των Cis-ρυθμιστικών στοιχείων τους
Για να αξιολογηθεί ο ρόλος των OsUSPs σε συνθήκες στρες, διεξήχθη ανάλυση των δεδομένων έκφρασης όλων των αναγνωρισμένων γονιδίων OsUSP υπό πολλαπλές συνθήκες στρες, συμπεριλαμβανομένων – θερμότητας, αλατιού, ξηρασίας, αφυδάτωσης και βύθισης (Εικόνα 6Α). Αναμενόμενα, τα περισσότερα γονίδια OsUSP έδειξαν ισχυρή ρύθμιση προς τα πάνω ή προς τα κάτω ως απόκριση σε αυτές τις αντιξοότητες. Ωστόσο, ο αριθμός των γονιδίων που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω ήταν ελαφρώς υψηλότερος από εκείνους που ρυθμίστηκαν προς τα κάτω. Ορισμένα γονίδια USP, συμπεριλαμβανομένων των OsUSP2, OsUSP17, OsUSP22, OsUSP23, OsUSP26, OsUSP31 και OsUSP36 ρυθμίστηκαν έντονα (ακόμα και υψηλότερα από 6 φορές) υπό συνθήκες βύθισης. Όλα τα γονίδια (εκτός από το OsUSP26) έδειξαν ισχυρή ανοδική ρύθμιση από την πρώιμη έναρξη της βύθισης. Μερικά γονίδια όπως τα OsUSP1, OsUSP10, OsUSP16, OsUSP20, OsUSP28, OsUSP42 παρουσίασαν επίσης μείωση. Ωστόσο, το μέγεθος της υπορρύθμισης δεν ήταν τόσο ισχυρό για εκείνα που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω. Στην περίπτωση του θερμικού στρες, η έκφραση των γονιδίων OsUSP διέφερε αρκετά. Η ισχυρότερη ανοδική ρύθμιση ανιχνεύθηκε για το OsUSP14, ενώ ορισμένα γονίδια εμφάνισαν τόσο ανοδική ρύθμιση όσο και μείωση με χρονικά διαχωρισμένο τρόπο όπως τα OsUSP15, OsUSP22, OsUSP30 κ.λπ. Προχωρώντας στην αφυδάτωση και το στρες ξηρασίας, η ανοδική ρύθμιση πολλών γονιδίων USP ήταν πιο εμφανής στην πρώιμη έναρξη της εφαρμογής στρες. Για παράδειγμα, τα γονίδια OsUSP3, OsUSP5, OsUSP11, OsUSP14, OsUSP19, OsUSP22, OsUSP23, OsUSP26 και OsUSP36 έδειξαν σημαντική ανοδική ρύθμιση στα προηγούμενα στάδια του στρες ξηρασίας, αλλά η έκφρασή τους διέφερε στα μεταγενέστερα χρονικά σημεία. Μερικά από αυτά τα γονίδια, όπως το OsUSP5 και το OsUSP14, παρουσίασαν ανοδική ρύθμιση και στις δύο συνθήκες και σε όλα τα χρονικά σημεία. Υπήρχε επίσης μια μικτή απόκριση των γονιδίων OsUSP ως απόκριση στο αλάτι, με μερικά να ρυθμίζονται προς τα πάνω και άλλα να ρυθμίζονται προς τα κάτω. Το μέγεθος της ανοδικής ρύθμισης ήταν ισχυρότερο κυρίως στη μεγαλύτερη περίοδο εφαρμογής αλατιού (24 ώρες). Όσον αφορά τη συνέπεια σε όλες τις συνθήκες πίεσης, το προφίλ έκφρασης των OsUSP2, OsUSP3, OsUSP22, OsUSP32, OsUSP33, OsUSP39 και OsUSP44 ήταν πολύ ενδιαφέρον. Γενικά, τα OsUSP3, OsUSP22, OsUSP39 και OsUSP44 ρυθμίστηκαν ως επί το πλείστον προς τα πάνω και τα OsUSP2, OsUSP32 και OsUSP33 ήταν ως επί το πλείστον προς τα κάτω σε όλες τις συνθήκες (Εικόνα 6Α). Τα OsUSP33, OsUSP39 και OsUSP44 ήταν πολύ ενδιαφέροντα. Γενικά, τα OsUSP3, OsUSP22, OsUSP39 και OsUSP44 ρυθμίστηκαν ως επί το πλείστον προς τα πάνω και τα OsUSP2, OsUSP32 και OsUSP33 ήταν ως επί το πλείστον προς τα κάτω σε όλες τις συνθήκες (Εικόνα 6Α). Τα OsUSP33, OsUSP39 και OsUSP44 ήταν πολύ ενδιαφέροντα. Γενικά, τα OsUSP3, OsUSP22, OsUSP39 και OsUSP44 ρυθμίστηκαν ως επί το πλείστον προς τα πάνω και τα OsUSP2, OsUSP32 και OsUSP33 ήταν ως επί το πλείστον προς τα κάτω σε όλες τις συνθήκες (Εικόνα 6Α).
Εικόνα 6. Επισκόπηση του προφίλ έκφρασης του ειδικού στρες των γονιδίων OsUSP, της σύνθεσης των περιοχών προαγωγέα τους και του λειτουργικού σχολιασμού. (ΕΝΑ)Τροποποίηση της έκφρασης του γονιδίου OsUSP κάτω από διάφορες συνθήκες αβιοτικού στρες – βύθιση, ζέστη, αφυδάτωση, ξηρασία και στρες αλατιού. Τα δεδομένα έκφρασης των γονιδίων USP του ρυζιού υπό πολλαπλές αβιοτικές καταπονήσεις λήφθηκαν από το Genevestigator χρησιμοποιώντας τα αντίστοιχα γονιδιακά ID. Η αλλαγή στο μοτίβο έκφρασης υπολογίστηκε με βάση την αλλαγή log2 φορές. Η κλίμακα στα δεξιά δείχνει το μέγεθος της ανόδου ή της μείωσης. Για ορισμένα γονίδια, το ποσό της αλλαγής πτυχής ήταν υψηλότερο (ή χαμηλότερο) από αυτό που υποδεικνύεται από την κλίμακα. Ωστόσο, για να διατηρηθεί η ομοιομορφία στα χρώματα των κουτιών, η κλίμακα περιορίστηκε στο 6 και στο –8 χειροκίνητα. Το φυλογενετικό δέντρο είναι παρόμοιο με αυτό που φαίνεται στο Σχήμα 2. (Β)Η παρουσία διαφορετικών ρυθμιστικών στοιχείων cis στην περιοχή των 1000 bp – ανάντη των γονιδίων OsUSP φαίνεται χρησιμοποιώντας μια γραφική παράσταση στοιβαγμένης ράβδου. Κάθε χρώμα υποδεικνύει ένα διαφορετικό ρυθμιστικό στοιχείο cis (δείτε την εικόνα για θρύλους) και το μήκος της ράβδου υποδηλώνει τον αριθμό των στοιχείων. Αρκετά ρυθμιστικά στοιχεία cis που ανταποκρίνονται στο στρες ήταν ορατά όπως – ABRE, ARE, MBS, LTR, HSE, P-box, κ.λπ. (C) Η ανάλυση εμπλουτισμού GO στα γονίδια OsUSP έδειξε εμπλουτισμό για απόκριση στρες σε περισσότερα από 40 γονίδια USP. Το μέγεθος των κύκλων υποδεικνύει τον αριθμό του γονιδίου και το χρώμα αντιστοιχεί στις τιμές –Log10(FDR).
Επιπλέον, ελέγξαμε τη σύνθεση της υποτιθέμενης περιοχής προαγωγέα των γονιδίων OsUSP σχετικά με την παρουσία διαφορετικών ρυθμιστικών στοιχείων cis. Μετά από έρευνα της αλληλουχίας των 1000 bp προς τα πάνω κάθε γονιδίου, οι περισσότεροι προαγωγείς USP ρυζιού είχαν πολυάριθμα ρυθμιστικά στοιχεία cis τα οποία είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στη ρύθμιση γονιδίου που προκαλείται από το στρες (Εικόνα 6Β). Τα μοτίβα που βρέθηκαν πιο συχνά στις περιοχές υποκινητή OsUSP ήταν – ABRE, ARE, LTR, MBS και πλούσιες σε TC επαναλήψεις, τα οποία αναγνωρίζονται για την προσέλκυση μεταγραφικών παραγόντων που σχετίζονται με το στρες (TFs). Για να προστεθεί σε αυτή τη σειρά αποδείξεων, πραγματοποιήθηκε ανάλυση εμπλουτισμού GO σε όλα τα γονίδια OsUSP (Εικόνα 6Γ). Αυτό έδειξε ότι από τα 44 γονίδια που εντοπίστηκαν, 41 γονίδια OsUSP σχολιάστηκαν ότι εμπλέκονται στην απόκριση στο στρες (GO:0006950). Εν ολίγοις, οι ειδικές για το στρες τροποποιήσεις των γονιδίων USP του ρυζιού είναι σαφείς.
Επικύρωση προφίλ γονιδιακής έκφρασης εννέα επιλεγμένων γονιδίων OsUSP ως απόκριση στο αβιοτικό στρες
Καθώς ένα προφίλ έκφρασης γονιδίων υπό συνθήκες στρες είναι σημαντικό για την κατανόηση της λειτουργίας τους, είναι σημαντικό να αξιολογηθούν πειραματικά τα πρότυπα έκφρασης mRNA-seq για να διασφαλιστεί η συνέπεια. Έτσι, πραγματοποιήσαμε ποσοτική ανάλυση RT-PCR εννέα επιλεγμένων γονιδίων OsUSP στον ιστό των φύλλων μετά από 16 ώρες θεραπειών αβιοτικού στρες, όπως αλάτι, ξηρασία, κρύο, ζέστη, αφυδάτωση, H2O2 και ορμονική επεξεργασία – ABA, SA και GA3. Το προφίλ έκφρασης PCR σε πραγματικό χρόνο των επιλεγμένων γονιδίων (Εικόνα 7) αποκαλύπτει μια καλή συσχέτιση με τα δεδομένα mRNA-seq (Εικόνα 6Α). Μεταξύ εννέα γονιδίων, τα OsUSP2, OsUSP3, OsUSP6, OsUSP12, OsUSP14, OsUSP32, OsUSP33 έδειξαν σημαντική ανοδική ρύθμιση στο θερμικό στρες ενώ τα OsUSP22 και OsUSP36 παρουσίασαν μείωση. Σε συμφωνία με τα δεδομένα έκφρασης mRNA-seq, τα γονίδια OsUSP14 και OsUSP22 έδειξαν παρόμοιο πρότυπο έκφρασης υπό θερμική καταπόνηση. Υπό στρες αλατότητας, τα OsUSP2, OsUSP3, OsUSP6, OsUSP12, OsUSP14 και OsUSP32 εμφάνισαν χαμηλή έως μέτρια ανοδική ρύθμιση ενώ τα OsUSP22, OsUSP33 και OsUSP36 παρουσίασαν μείωση στα φύλλα ρυζιού. Ορισμένα γονίδια όπως τα OsUSP2, OsUSP22 και OsUSP32 έδειξαν διαφορικά πρότυπα έκφρασης στο στρες άλατος που είναι διαφορετικό από τα δεδομένα mRNA-seq. Ωστόσο, το επίπεδο έκφρασης των OsUSP3 και OsUSP33 ήταν συνεπές με τα δεδομένα mRNA-seq του μοτίβου έκφρασης. Επιπλέον, τα αποτελέσματα qRT-PCR αποκάλυψαν ότι το επίπεδο έκφρασης των OsUSP2, OsUSP3, OsUSP12, OsUSP14, OsUSP32, OsUSP33 ρυθμίστηκε προς τα πάνω κάτω από το στρες ξηρασίας. Εκτός από αυτό, το OsUSP6 δεν παρουσίασε καμία αλλαγή πτυχής, σε σύγκριση με τον έλεγχο υπό συνθήκες ξηρασίας. Σε κατάσταση αφυδάτωσης, μόνο τα OsUSP2, OsUSP12 και OsUSP33 εμφάνισαν εύλογη ρύθμιση προς τα πάνω, ενώ το OsUSP14 έδειξε προς τα κάτω ρύθμιση.
Εικόνα 7. Λειτουργική επικύρωση της εκλεκτικής έκφρασης γονιδίων OsUSP σε απόκριση σε διάφορες αβιοτικές καταπονήσεις και ορμονικές θεραπείες με qRT-PCR. Τα προφίλ έκφρασης εννέα γονιδίων OsUSP πραγματοποιήθηκαν ως απόκριση σε αλατότητα, ξηρασία, κρύο, ζέστη, αφυδάτωση και οξειδωτικές καταπονήσεις και επεξεργασίες ABA, SA και GA3 στην ποικιλία ρυζιού BRRI-53. Μια κλίμακα που δείχνει Log2-πλάσια αλλαγή κάθε γονιδίου κάτω από κάθε συνθήκη παρουσιάστηκε στα αριστερά. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύτηκαν από τη μέση τιμή αλλαγής πτυχής ± τυπική απόκλιση χρησιμοποιώντας το γονίδιο eEF1 ρυζιού ως αναφορά. Η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το τεστ t Student με δύο ουρές και αντιπροσωπεύονται με ∗ , ∗∗ , ∗∗∗ για τιμή P lt; 0,05, lt;0,01 και lt;0,001. αντίστοιχα.
Η ανάλυση έκφρασης εννέα επιλεγμένων γονιδίων OsUSP διεξήχθη περαιτέρω σε άλλες αβιοτικές θεραπείες όπως το κρύο, το οξειδωτικό και το ορμονικό στρες. Στην ψυχρή επεξεργασία, τα γονίδια OsUSP έδειξαν χαμηλή έως μέτρια ανοδική ρύθμιση σε δείγματα φύλλων. Το OsSUP6 δεν παρουσιάζει καμία έκφραση στο στρες ξηρασίας, αλλά εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στο ψυχρό στρες, ενώ το OsUSP33 έδειξε αμελητέα ανοδική ρύθμιση που είναι κοντά στον έλεγχο. Τα OsUSP14, OsUSP32, OsUSP36 παρουσίασαν αυξημένη ρύθμιση υπό ψυχρό στρες. Ωστόσο, παρατηρήσαμε ότι τα άλλα γονίδια USP όπως τα OsUSP2, OsUSP3, OsUSP12, OsUSP22 και OsUSP36 υπορυθμίστηκαν στο κρύο. Τα OsUSPs παρουσίασαν μείωση του οξειδωτικού στρες εκτός από τα OsUSP3 και OsUSP12, τα οποία πρέπει να διερευνηθούν περαιτέρω. Επιπλέον, το OsUSP έδειξε μια διαφορική ρύθμιση στον ιστό των φύλλων ρυζιού υπό ορμονικές επιδράσεις όπως τα ABA, SA και GA3 (Εικόνα 7). Τα αποτελέσματα qRT-PCR έδειξαν ότι τα περισσότερα από τα γονίδια USP όπως τα OsUSP2, OsUSP3, OsUSP6, OSUSP14 και OsUSP32 ρυθμίστηκαν προς τα πάνω σε όλα τα ορμονικά στρες. Εκτός από αυτό, τα OsUSP12 και OsUSP33 παρουσίασαν ανοδική ρύθμιση αλλά μειώθηκαν στο στρες ABA. Οι ποικίλες αποκρίσεις των OsUSPs θα μπορούσαν επομένως να αποδοθούν σε διαφορετικά αβιοτικά και ορμονικά στρες.
Ανάλυση Molecular Docking Selected OsUSPs
Μεταξύ 44 πρωτεϊνών OsUSP, 9 OsUSP έδειξαν σημαντική ρύθμιση προς τα πάνω και προς τα κάτω σε διάφορες τάσεις και επιλέχθηκαν ως υποδοχείς για μελέτη σύνδεσης για να ελεγχθεί η συγγένειά τους με διάφορους αναστολείς (Πίνακας 2). Από αυτά τα 9, μόνο δύο (OsUSP32, OsUSP33) έχουν τόσο USP όσο και τομέα κινάσης, συνδεδεμένες έναντι αναστολέων UspA και PKC. Τα υπόλοιπα επτά περιέχουν μόνο τον τομέα USP, επομένως, ήταν συνδεδεμένοι μόνο έναντι αναστολέων UspA. Όλες αυτές οι επιλεγμένες εννέα πρωτεΐνες έδειξαν σημαντική συγγένεια προς τους αναστολείς UspA (ZINC000104153710, ZINC000004268284, ZINC000000217308) και τόσο το OsUSP32 όσο και το OsUSP33 έδειξαν συγγένεια προς τις δυνάμενες να ανταποκρίνονται στις τεσσάρων μπιτοσιτοριτασών (MyinitorFi) της QuininceT, τεσσάρων κινολετοριτασών. Μεταξύ των τριών αναστολέων USP η υψηλότερη συγγένεια βρέθηκε για τον ψευδάργυρο000104153710 και στην περίπτωση των τεσσάρων αναστολέων κινάσης, η λουτεολίνη έδειξε την υψηλότερη συγγένεια. Μεταξύ και των εννέα επιλεγμένων πρωτεϊνών, το OsUSP32 έδειξε την υψηλότερη συγγένεια προς τον αναστολέα UspA Zinc000104153710 και τον αναστολέα PKC λουτεολίνη με ενέργεια δέσμευσης −9,6 kcal/mol και −9,2 kcal/mol, αντίστοιχα, ακολουθούμενη από την OsUSP-2,8 kol.8. kcal/mol, αντίστοιχα). Η αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-προσδέματος των συνδεδεμένων συμπλεγμάτων οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Discovery Studio (Εικόνες 8Α-Δ). Η πρωτεΐνη OsUSP32 με την καλύτερη βαθμολογία με την υψηλότερη συγγένεια δέσμευσης προς τον ψευδάργυρο000104153710 σχημάτισε έναν δεσμό υδρογόνου με το Asp443 να έχει απόσταση 2,21 Å, δύο δεσμούς pi-sigma με Val324 (3,93 Å), Leu432 (3,88 Ål) Ala359 (5,44 Α) και πέντε αλκυλικοί δεσμοί με Ala306 (5,49 Α), Tyr311 (4,01 Α), Val314 (5,50 Α), Ala326 (4,62 Α, 5,06 Α) για σταθεροποίηση εντός του θύλακα σύνδεσης (Εικόνα ).
Πίνακας 2. Προβλεπόμενη συγγένεια δέσμευσης (kcal/mol) επιλεγμένων πρωτεϊνών OsUSP έναντι γνωστών αναστολέων USP και κινάσης.
Σχήμα 8. Μοντελοποίηση ομολογίας και μοριακή πρόσδεση δύο πρωτεϊνών OsUSP (OsUSP32, OsUSP33) που έχουν και το πεδίο USP και Pkinase. Η πρώτη στήλη αντιπροσωπεύει την προβλεπόμενη τρισδιάστατη δομή, η δεύτερη και η τρίτη στήλη αντιπροσωπεύουν την αλληλεπίδραση 2-Δ κάθε πρωτεΐνης με τη λουτεολίνη (A,C) και τον ZINC000104153710 (B,D) αντίστοιχα. Το πράσινο, ανοιχτό πράσινο, ροζ, βιολετί, μοβ αντιπροσωπεύουν υπολείμματα που εμπλέκονται στις υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, αλληλεπιδράσεις δεσμού άνθρακα-υδρογόνου, σχήματος Pi-Pi-T, Pi-Sigma και Pi-Alkyl αλληλεπιδράσεις, αντίστοιχα.
Συζήτηση
Οι πρωτεΐνες του γενικού στρες έχει αποδειχθεί ότι προκαλούνται υπό διάφορες αβιοτικές καταπονήσεις. Μέχρι σήμερα, ένας ποικίλος αριθμός οικογένειας γονιδίων USP έχει εντοπιστεί από διαφορετικά είδη φυτών, συμπεριλαμβανομένων των Arabidopsis (Bhuria et al., 2019), Brassica napus, Triticum aestivum, Brassica rapa, Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum, Oryza sativa japonica, Vitis , Zea mays (Chi et al., 2019), Malus sieversii (Ledeb.) (Yang et al., 2019), Barley (Li et al., 2010), Pigeon pea (Sinha et al., 2016) κ.λπ. Συνήθως , τα φυτικά γονιδιώματα φιλοξενούν περίπου είκοσι έως πενήντα γονίδια (Gou et al., 2020). Ωστόσο, περισσότερα από εκατό μέλη έχουν αναφερθεί στο γονιδίωμα των Brassica napus και Triticum aestivum (Li et al., 2010; Chi et al., 2019). Στην παρούσα μελέτη, ταυτοποιήθηκαν συνολικά 44 γονίδια OsUSP (Πίνακας 1) στο γονιδίωμα του ρυζιού.
Τα αναγνωρισμένα γονίδια USP κατανέμονται σε 11 από τα 12 χρωμοσώματα ρυζιού (Εικόνα 3Α). Ο αριθμός των γονιδίων είναι ελαφρώς υψηλότερος από ό,τι είχε αναφερθεί προηγουμένως (Bhowmick, 2019; Chi et al., 2019). Η διερεύνηση των δομικών ιδιοτήτων των ταυτοποιημένων γονιδίων και της αντίστοιχης πρωτεΐνης τους έδειξε ότι η αρχιτεκτονική του τομέα έπαιξε σημαντικό ρόλο σε αυτό. Η ανάλυση του synteny μεταξύ των γονιδίων USP του ρυζιού έδειξε ότι 16 από τα 44 γονίδια είχαν ίχνη τμηματικού διπλασιασμού ενώ δύο γονίδια στο χρωμόσωμα 12 πιθανότατα προήλθαν από ένα συμβάν διαδοχικής διπλασιασμού (Εικόνα 3Β). Έτσι, φαίνεται ότι τόσο ο τμηματικός όσο και ο διαδοχικός διπλασιασμός έπαιξαν ρόλο στην επέκταση της οικογένειας γονιδίων USP στο ρύζι. Περαιτέρω έρευνα στη συνθετική σχέση μεταξύ των γονιδίων USP του ρυζιού και του γονιδιώματος των Arabidopsis thaliana και Zea mays (αραβόσιτος) αποκάλυψε την παρουσία υψηλότερου αριθμού ορθολόγων στο γονιδίωμα του μονοκοτυλήκου αραβοσίτου σε σύγκριση με το δίκοτυλο Arabidopsis thaliana (Εικόνα 3Β). Αυτό υποδηλώνει μεγαλύτερη διαφοροποίηση των γονιδίων USP μεταξύ των δύο σειρών αγγειόσπερμων – μονοκοτυλήδονων και δικοτυλήδονων σε σύγκριση με την απόκλιση σε κάθε γραμμή. Από αυτή την άποψη, η μελέτη μας υποδηλώνει ότι τόσο ο διπλασιασμός όσο και η διαφοροποίηση έχουν παίξει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της οικογένειας γονιδίων USP στα φυτά.
Οι αναλύσεις της φυλογένεσης των OsUSPs αποκάλυψαν δύο ομάδες που συμπίπτουν πολύ με την αρχιτεκτονική του τομέα των πρωτεϊνών. Το σύμπλεγμα (πράσινο) που ομάδες με E. coli USP πιθανότατα αντιπροσωπεύει εκείνα τα μέλη που προήλθαν νωρίτερα στην εξελικτική ιστορία της οικογένειας γονιδίων USP. Αντίθετα, μέλη από το άλλο σύμπλεγμα (κίτρινο) έδειξαν μεγαλύτερα μήκη πεπτιδίου και παρουσία λειτουργικής περιοχής κινάσης. Ωστόσο, υπήρχαν μερικές εξαιρέσεις εδώ, όπως το OsUSP10 και το OsUSP41. Δύο γονίδια USP θα μπορούσαν να έχουν υποστεί μεταλλάξεις που έχουν καταστήσει μια υπάρχουσα περιοχή κινάσης μη λειτουργική ή θα μπορούσαν να βρίσκονται στα πρόθυρα ανάπτυξης μιας περιοχής κινάσης. Η τελευταία περίπτωση είναι λιγότερο πιθανή, καθώς αυτοί οι δύο USP δεν ομαδοποιούνται πιο κοντά στο πράσινο σύμπλεγμα που υποτίθεται ότι προήλθε πρώτο. Η ύπαρξη διαφορετικών περιοχών στα μέλη USP στο κίτρινο σύμπλεγμα υποδηλώνει τη λειτουργική ποικιλομορφία των μελών USP στα φυτά. Αυτές οι πρωτεΐνες μπορεί να έχουν εξελιχθεί για να εξυπηρετούν ποικίλες λειτουργίες στην προστασία του φυτού από διάφορους στρεσογόνους παράγοντες. Επομένως, είναι επιτακτική ανάγκη να εντοπιστεί με ακρίβεια και να διερευνηθεί περαιτέρω η ποικιλομορφία αυτών των γονιδίων.
Οι μοριακοί δείκτες μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως εργαλείο επιλογής για τη διερεύνηση της γενετικής ποικιλότητας, τη δυνατότητα μεταφοράς γονιδίων για σκοπούς επεξεργασίας γονιδιώματος. Στη μελέτη μας, εντοπίσαμε 19 δείκτες SSR με βάση την υψηλή αναπαραγωγιμότητα, τις πολυμορφικές γενετικές πληροφορίες και την υπερμεταβλητή φύση τους. Καθώς παράγουν υψηλές αλληλικές παραλλαγές μεταξύ πολύ στενά συγγενών ποικιλιών, αυτοί οι δείκτες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ταυτοποίηση συγκεκριμένων μελών USP στο μέλλον. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες στο Viridiplantae, βρήκαμε επίσης τον τύπο τρινουκλεοτιδίου ως το κυρίαρχο μοτίβο (Isokpehi et al., 2011).
Εξετάζοντας το μοτίβο έκφρασης των γονιδίων OsUSP βρήκαμε ότι αρκετά μέλη παρουσίασαν διαμόρφωση υπό διαφορετικές συνθήκες αβιοτικού στρες (Εικόνα 6Α). Ορισμένα από αυτά τα γονίδια παρουσίασαν ισχυρή ανοδική ρύθμιση όταν εκτέθηκαν σε αυτούς τους στρεσογόνους παράγοντες. Αυτά τα ευρήματα ταιριάζουν καλά με προηγούμενες αναφορές για την ειδική ρύθμιση του στρες των γονιδίων USP (Loukehaich et al., 2012; Jung et al., 2015; Melencion et al., 2017). Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι η υπερέκφραση ορισμένων γονιδίων USP οδηγεί σε ενισχυμένη ανοχή στη θερμότητα και το οσμωτικό στρες. Σε σχέση με αυτό, τα υποψήφια γονίδια OsUSP μπορεί επίσης να έχουν παρόμοιους λειτουργικούς ρόλους στην ανοχή στο στρες. Επιπλέον, βρήκαμε την παρουσία πολλαπλών ρυθμιστικών στοιχείων που ανταποκρίνονται στο στρες ανάντη των γονιδίων OsUSP. Αυτά περιλαμβάνουν – ABRE (απόκριση ABA), ARE (ανοξία), LTR (χαμηλή θερμοκρασία), MBS (ξηρασία), Επαναλήψεις πλούσιες σε TC (στρές και άμυνα), HSE (θερμικό σοκ) κ.λπ. Μια προηγούμενη αναφορά από τους Bhuria et al. (2016) έδειξε ότι ο υποκινητής AtUSP είναι εξαιρετικά επαγόμενος από πολλαπλούς αβιοτικούς στρεσογόνους παράγοντες και ήταν σε θέση να παράγει ανοχή σε πολλαπλές στρες. Σε μια άλλη μελέτη σε φυτά βαμβακιού, ο υποκινητής ενός γονιδίου USP βρέθηκε να ανταποκρίνεται στην αφυδάτωση, το ABA, το αλάτι, τα βαρέα μέταλλα και το γιβερελικό οξύ (Zahur et al., 2009). Επιπλέον, τα γονίδια USP της άγριας ντομάτας προκλήθηκαν υπό ABA, αιθυλένιο, ξηρασία, αλάτι, θερμότητα, τραυματισμό, οξειδωτικό και ψυχρό στρες (Loukehaich et al., 2012). Ομοίως, το γονίδιο SbUSP από το Salicornia brachiata έδειξε επίσης έκφραση κάτω από αλάτι, ξηρασία, κρύο και θερμικό στρες (Udawat et al., 2014). Συνολικά,
Σε συνοχή με αυτό, κατά τη διάρκεια του προφίλ έκφρασης σε silico των γονιδίων OsUSP, βρήκαμε επίσης ότι η έκφραση των περισσότερων γονιδίων USP ρυζιού συνδέθηκε στενά με τη θερμότητα, την αλατότητα, την ξηρασία, την αφυδάτωση και τη βύθιση. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε qRT-PCR για να συσχετίσουμε την ειδική για το στρες λειτουργία των επιλεγμένων γονιδίων USP κάτω από πολλαπλές αβιοτικές τάσεις. Αυτά οδήγησαν στην επιβεβαίωση της διαμόρφωσης αυτών των γονιδίων USP ρυζιού κάτω από ποικίλους περιβαλλοντικούς στρεσογόνους παράγοντες. Για παράδειγμα, το OsUSP3 έδειξε ανοδική ρύθμιση κάτω από όλες τις συνθήκες καταπόνησης εκτός από το κρύο που το καθιστά πολύ κατάλληλο για επικύρωση κατάντη υγρού εργαστηρίου (Εικόνα 7). Αντίθετα, το OsUSP22 ήταν ως επί το πλείστον προς τα κάτω στους αβιοτικούς στρεσογόνους παράγοντες εκτός από τα ABA και SA, υποδεικνύοντας μια ισχυρή διαμόρφωση υπό πίεση. Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήσαμε ότι μόνο τα OsUSP3 και OsUSP12 έχουν αυξημένη έκφραση υπό οξειδωτικό στρες. Επιπλέον, η απόκριση κάθε USP στην ποικιλία των στρεσογόνων παραγόντων διέφερε ευρέως, υποδεικνύοντας τη δυνατότητα διαφορετικών τρόπων μεταγραφικής ρύθμισης για τα μέλη αυτής της οικογένειας γονιδίων στο ρύζι. Η αποκάλυψη αυτών των ακριβών φύσεων τέτοιων ρυθμιστικών ενοτήτων και των λειτουργικών τους συνεπειών μπορεί να είναι μεγάλης σημασίας για την έρευνα με γνώμονα το άγχος των φυτών.
Για να ενισχύσουμε περαιτέρω την κατανόησή μας για την οικογένεια γονιδίων USP του ρυζιού, επικεντρωθήκαμε στην ανάλυση των πρωτεϊνικών προϊόντων αυτών των γονιδίων. Η σωστή λειτουργία των πρωτεϊνών εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τις μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις (PTMs) των πρωτεϊνών, με τις δύο κύριες να είναι η γλυκοζυλίωση και η φωσφορυλίωση. Από αυτή την άποψη, η διαδικασία γλυκοζυλίωσης παίζει σημαντικό ρόλο στην αναδίπλωση της πρωτεΐνης, τη σταθερότητα και τη μεταγωγή σήματος (Arey, 2012), ενώ η φωσφορυλίωση παίζει κρίσιμο ρόλο στην ενεργοποίηση ή απενεργοποίηση των πρωτεϊνών αλλάζοντας τη δομική διαμόρφωση (Cohen, 2002) και παίζει σημαντικό ρόλο στα μονοπάτια σηματοδότησης (Cutillas, 2017), στον μεταβολισμό και στην καταπολέμηση διαφόρων καταστάσεων στρες (Zhang et al., 2020). Ως απόκριση στις αβιοτικές καταπονήσεις στα φυτά, Οι PTM πρωτεϊνών έχουν αναφερθεί ως απόκριση σε αβιοτικές πιέσεις σε φυτά και προτείνεται ότι εμπλέκονται σε διάφορες βιολογικές διεργασίες υπό φυσικές συνθήκες (Wu et al., 2016). Προηγούμενες μελέτες για την πρωτεΐνη PTM στη σόγια και το ρύζι υπό συνθήκες στρες έδειξαν ότι η γλυκοζυλίωση συμβαίνει ως απόκριση στην πλημμύρα και το κρύο (Wu et al., 2016). Εδώ, εντοπίσαμε 68 προβλεπόμενες θέσεις γλυκοζυλίωσης, μεταξύ των οποίων 19 θέσεις έδειξαν την υψηλότερη πιθανότητα γλυκοζυλίωσης. Αυτό επιβεβαιώνει την ικανότητα των μελών του OsUSP να πραγματοποιούν δευτερογενή τροποποίηση δομής με τη μεσολάβηση γλυκοζυλίωσης που μπορεί να ρυθμίζει τις πρωτεϊνικές λειτουργίες σε συνθήκες στρες. Επιπλέον, διάφορες μελέτες πρότειναν ότι διαφορετικές κινάσες ενεργοποιούνται μετά από φωσφορυλιώσεις των υπολειμμάτων βρόχου ενεργοποίησής τους (Ravala et al., 2015) και αυτοφωσφορυλίωση της πρωτεΐνης UspA του E. coli εμφανίζονται επίσης ως απόκριση στη στάση (Freestone et al., 1997). Επιπλέον, το PTM που προκαλείται από φωσφορυλίωση βρέθηκε εξέχουσα θέση στην καταπολέμηση πολλαπλών αβιοτικών στρεσογόνων παραγόντων στο ρύζι, τον αραβόσιτο, το σιτάρι και τα ρεβίθια (Wu et al., 2016). Έτσι, οι προβλεπόμενες θέσεις φωσφορυλίωσης με θέση και ειδικές κινάσες από την παρούσα εργασία θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για περαιτέρω επιβεβαίωση του ρόλου της φωσφορυλίωσης στη λειτουργία διαφορετικών OsUSPs χρησιμοποιώντας διάφορες in vitro τεχνικές.
Επιπλέον, απαιτείται βαθιά κατανόηση της συγγένειας δέσμευσης και των υπολειμμάτων θέσεων δέσμευσης των αναστολέων στα OsUSPs για τη βελτίωση των αβιοτικών καλλιεργειών ανθεκτικών στο στρες. Σε αυτήν την παρούσα μελέτη, πραγματοποιήσαμε μέθοδο τυφλής σύνδεσης (Hetényi and van der Spoel, 2002) για τη διερεύνηση πιθανών θέσεων δέσμευσης και συγγένειας δέσμευσης των πρωτεϊνών μας και προς ορισμένους γνωστούς αναστολείς USP και κινάσης. Σε συμφωνία με την προηγούμενη μελέτη για τον αναστολέα UspA στο E. coli (Bandyopadhyay et al., 2021), το ZINC000104153710 έδειξε το καλύτερο αποτέλεσμα σύνδεσης, υποδηλώνοντας έτσι ανασταλτική επίδραση στη δραστηριότητα του OsUSP. Επιπλέον, μελέτες έχουν βρει ότι τα φλαβονοειδή δρουν ως αναστολέας των κινασών (Cassidy και Setzer, 2010). Εδώ, το Luteolin έδειξε το καλύτερο αποτέλεσμα όταν προσαρτήθηκε έναντι του τομέα κινάσης που περιέχει OsUSPs. Αυτό υποδηλώνει έντονα ότι η λουτεολίνη μπορεί να εμποδίσει τη δραστηριότητα της κινάσης κατά τη δέσμευση. Αυτό θα διευκολύνει την περαιτέρω προσομοίωση, τη διερεύνηση σχετικά με την αλληλεπίδραση άλλων αναστολέων σε αυτές τις θέσεις δέσμευσης και την ταυτοποίηση ορισμένων νέων αναστολέων που μπορεί να αναστείλουν τη δραστηριότητα των πρωτεϊνών USP.
συμπέρασμα
Συνολικά, αυτή η μελέτη καλύπτει μια ολοκληρωμένη έρευνα σε κλίμακα γονιδιώματος των μελών της οικογένειας γονιδίων USP σε μια βασική καλλιέργεια, το ρύζι. Συνολικά, μπορέσαμε να αναγνωρίσουμε 44 γονίδια USP στο γονιδίωμα της μονοκοτυλήδονας, αριθμός ελαφρώς υψηλότερος από τις προηγούμενες αναφορές. Ο βασικός στόχος αυτής της έρευνας ήταν να πραγματοποιήσει μια σε βάθος διερεύνηση των δομικών και λειτουργικών ιδιοτήτων των αναγνωρισμένων γονιδίων. Αυτό μας οδήγησε να ανακαλύψουμε τη λειτουργική ποικιλομορφία των γονιδίων USP του ρυζιού και τη ρυθμιστική τους φύση πολλαπλών στρες. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας το qRT-PCR, μπορέσαμε να επικυρώσουμε αυτήν την ανταποκρινόμενη σε πολλές στρες φύση των πολλά υποσχόμενων γονιδίων OsUSP. Ωστόσο, απαιτείται περαιτέρω έρευνα για τον προσδιορισμό της λειτουργικής συνεισφοράς αυτών των γονιδίων με τη δημιουργία υπερεκφραζόμενων ή νοκ-άουτ γραμμών γονιδίων USP μόνα τους ή σε συνδυασμό. Με τη βοήθεια σύγχρονων βιοτεχνολογικών εργαλείων,
Δήλωση διαθεσιμότητας δεδομένων
Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα που υποστηρίζουν τα συμπεράσματα αυτού του άρθρου θα διατεθούν από τους συγγραφείς, χωρίς αδικαιολόγητες επιφυλάξεις.
Συνεισφορές Συγγραφέων
Η TI συνέλαβε την ιδέα και σχεδίασε και επέβλεψε τα πειράματα. Οι SAr, AS και SAk πραγματοποίησαν όλα τα πειράματα και έγραψαν το χειρόγραφο. Η TI και η AS βοήθησαν στην ανάλυση δεδομένων. Ο RS εξέτασε κριτικά το χειρόγραφο. Όλοι οι συγγραφείς διάβασαν το χειρόγραφο και ενέκριναν την τελική έκδοση.
Σύγκρουση συμφερόντων
Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη απουσία εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.
Σημείωση εκδότη
Όλοι οι ισχυρισμοί που εκφράζονται σε αυτό το άρθρο είναι αποκλειστικά εκείνοι των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραιτήτως αυτούς των συνδεδεμένων οργανισμών τους ή του εκδότη, των εκδοτών και των κριτικών. Οποιοδήποτε προϊόν μπορεί να αξιολογηθεί σε αυτό το άρθρο ή ισχυρισμός που μπορεί να προβληθεί από τον κατασκευαστή του, δεν είναι εγγυημένο ή εγκεκριμένο από τον εκδότη.
Ευχαριστίες
Οι συγγραφείς αναγνωρίζουν με ευγνωμοσύνη μερική επιχορήγηση από το Υπουργείο Τεχνολογίας Πληροφοριών και Επικοινωνιών (ΤΠΕ), Κυβέρνηση της Λαϊκής Δημοκρατίας του Μπαγκλαντές για τη συνέχιση της μελέτης. Οι συγγραφείς αναγνωρίζουν δεόντως το Πανεπιστήμιο της Ντάκα για την παροχή μερικής αμοιβής δημοσίευσης. Οι συγγραφείς αναγνωρίζουν το Εργαστήριο Αναπαραγωγής Φυτών και Βιοτεχνολογίας, Τμήμα Βοτανικής, Πανεπιστήμιο της Ντάκα για την υλικοτεχνική υποστήριξη και τις εργαστηριακές εγκαταστάσεις.
Συμπληρωματικό υλικό
Το συμπληρωματικό υλικό για αυτό το άρθρο βρίσκεται στο διαδίκτυο στη διεύθυνση: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2021.712607/full#supplementary-material
Συμπληρωματικό Σχήμα 1 | Ποιότητα και ποσοτικοποίηση απομονωμένου RNA.
Συμπληρωματικό Σχήμα 2 | Μοντελοποίηση ομολογίας επτά πρωτεϊνών OsUSP που έχουν μόνο USP τομέα.
Καθολικές πρωτεΐνες στρες, ρύζι, αλλοίωση μεταγραφής, αβιοτικό στρες, Λειτουργική επικύρωση