Οργάνωση και ρύθμιση του κυτταροσκελετού της ακτίνης στο σωλήνα γύρης
- 1 Κέντρο Βιολογίας Φυτών, Σχολή Επιστημών Ζωής, Πανεπιστήμιο Tsinghua, Πεκίνο, Κίνα
- 2 Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Ινστιτούτο Βοτανικής – Κινεζική Ακαδημία Επιστημών, Πεκίνο, Κίνα
Η σωστή οργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη του σωλήνα γύρης. Ωστόσο, οι ακριβείς μηχανισμοί με τους οποίους ο κυτταροσκελετός ακτίνης ρυθμίζει την ανάπτυξη του σωλήνα γύρης πρέπει να διευκρινιστούν περαιτέρω. Οι λειτουργίες του κυτταροσκελετού της ακτίνης υπαγορεύονται από τη χωρική οργάνωση και τη δυναμική του. Ωστόσο, οι πρώιμες παρατηρήσεις της κατανομής των νημάτων ακτίνης στην κορυφή του σωλήνα γύρης ήταν αρκετά περίπλοκες, με αποτέλεσμα δεκαετίες αμφιλεγόμενων συζητήσεων. Ευτυχώς, λόγω βελτιώσεων στα σχήματα στερέωσης για τη χρώση νημάτων ακτίνης σε σταθερούς σωλήνες γύρης, καθώς και της υιοθέτησης κατάλληλων δεικτών για την οπτικοποίηση των νημάτων ακτίνης σε ζωντανούς σωλήνες γύρης, αυτό το ζήτημα έχει επιλυθεί και έχει οδηγήσει στη συναίνεση της χωρικής κατανομή των νημάτων ακτίνης σε ολόκληρο το σωλήνα γύρης. Σημαντικό, Οι πρόσφατες περιγραφές της δυναμικής των μεμονωμένων νημάτων ακτίνης στην κορυφαία περιοχή έχουν διευρύνει την κατανόησή μας για τη λειτουργία της ακτίνης στη ρύθμιση της ανάπτυξης του σωλήνα γύρης. Επιπλέον, η προσεκτική τεκμηρίωση της λειτουργίας και του τρόπου δράσης αρκετών πρωτεϊνών που δεσμεύουν την ακτίνη που εκφράζονται στη γύρη έχουν προσφέρει νέες ιδέες για τη ρύθμιση της χωρικής κατανομής και της δυναμικής της ακτίνης. Στην τρέχουσα ανασκόπηση, συνοψίζουμε την κατανόησή μας για την οργάνωση, τη δυναμική και τη ρύθμιση του κυτταροσκελετού της ακτίνης στον σωλήνα γύρης. Η προσεκτική τεκμηρίωση της λειτουργίας και του τρόπου δράσης πολλών πρωτεϊνών που δεσμεύουν την ακτίνη που εκφράζονται στη γύρη έχουν παράσχει νέες ιδέες για τη ρύθμιση της χωρικής κατανομής και της δυναμικής της ακτίνης. Στην τρέχουσα ανασκόπηση, συνοψίζουμε την κατανόησή μας για την οργάνωση, τη δυναμική και τη ρύθμιση του κυτταροσκελετού της ακτίνης στον σωλήνα γύρης. Η προσεκτική τεκμηρίωση της λειτουργίας και του τρόπου δράσης πολλών πρωτεϊνών που δεσμεύουν την ακτίνη που εκφράζονται στη γύρη έχουν παράσχει νέες ιδέες για τη ρύθμιση της χωρικής κατανομής και της δυναμικής της ακτίνης. Στην τρέχουσα ανασκόπηση, συνοψίζουμε την κατανόησή μας για την οργάνωση, τη δυναμική και τη ρύθμιση του κυτταροσκελετού της ακτίνης στον σωλήνα γύρης.
Εισαγωγή
Η γύρη αντιπροσωπεύει ένα κρίσιμο στάδιο του κύκλου ζωής των φυτών και είναι απαραίτητη για την παραγωγή σπόρων σε ανθοφόρα φυτά (McCormick, 2013). Κατά την προσγείωση στην επιφάνεια του στίγματος, η γύρη αρχίζει να ενυδατώνεται και να βλασταίνει, προεξέχοντας την έκφυση για να σχηματίσει μια σωληνοειδή δομή που εκτείνεται γρήγορα σε στυλ. Αυτή η δομή παρέχει τη δίοδο για δύο μη κινητικά σπερματοζωάρια που πρέπει να παραδοθούν στο θηλυκό γαμετόφυτο και τελικά να πραγματοποιήσουν τη διπλή γονιμοποίηση (Hepler et al., 2001· Lord and Russell, 2002· Cheung and Wu, 2008). Η ανάπτυξη του σωλήνα γύρης είναι πολύ γρήγορη. ο ρυθμός ανάπτυξης για τους σωλήνες γύρης αραβοσίτου στο στυλ μπορεί να φτάσει έως και 1 cm/h (Bedinger, 1992). Κατά τη διάρκεια του ταξιδιού της γονιμοποίησης, ο σωλήνας γύρης συνήθως διανύει μια απόσταση 1000s φορές μεγαλύτερη από τη διάμετρο του κόκκου του. Ωστόσο, η ανάπτυξη του σωλήνα γύρης περιορίζεται στην περιοχή της κορυφής, που ονομάζεται επομένως «ανάπτυξη άκρης». Αυτός ο τύπος ανάπτυξης κορυφής που βρίσκεται στον σωλήνα γύρης μοιράζεται με πολλούς άλλους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των τριχών των ριζών στα φυτά, των πρωτονεμικών κυττάρων στα βρύα, των υφών στους μύκητες και των νευριτών στα ζώα (Cheung and Wu, 2008; Rounds and Bezanilla, 2013). . Μεταξύ αυτών των συστημάτων, η ανάπτυξη σωλήνων γύρης είναι ιδιαίτερα ανάλογη με την ανάπτυξη νευρίτη. Παραδόξως, ωστόσο, παρά το άκαμπτο κυτταρικό του τοίχωμα, ο σωλήνας γύρης εκτείνεται πολύ γρήγορα, π.χ. οι σωλήνες γύρης του κρίνου αναπτύσσονται ακόμη και κατά μία τάξη μεγέθους ταχύτερα από τον νευρίτη (Hepler et al., 2001). Η ταχύτητα της ανάπτυξης συνεπάγεται ότι οι υποκείμενες κυτταρικές δραστηριότητες μπορούν να ενισχυθούν στον σωλήνα γύρης. Η γύρη είναι ένα εξαιρετικό κυτταρικό μοντέλο για τη μελέτη της ανάπτυξης της κορυφής, καθώς είναι εύκολο να καλλιεργηθεί και τα περισσότερα από τα χαρακτηριστικά που σχετίζονται με την in vivo ανάπτυξη των σωλήνων γύρης παρατηρούνται επίσης in vitro. Επιπλέον, οι βασικές μεταλλάξεις που σχετίζονται με τη λειτουργία της γύρης μπορούν να διατηρηθούν σε ετερόζυγη κατάσταση, γεγονός που καθιστά τον σωλήνα γύρης ένα πολύ ωραίο γενετικό σύστημα για τη μελέτη της πολωμένης κυτταρικής ανάπτυξης. Για αυτούς τους λόγους, τις τελευταίες δεκαετίες, ο σωλήνας γύρης έχει χρησιμεύσει σε ένα πολύ σημαντικό μοντέλο κυτταρικού συστήματος για εντατική μελέτη των μηχανισμών που κρύβουν την πολωμένη κυτταρική ανάπτυξη.
Ο κυτταροσκελετός της ακτίνης έχει αποδειχθεί ότι είναι κρίσιμος για την ανάπτυξη του σωλήνα γύρης (Taylor and Hepler, 1997; Gibbon et al., 1999; Hepler et al., 2001; Vidali et al., 2001; Smith and Oppenheimer, 2005; Hussey ., 2006· Chen et al., 2009· Fu, 2010· Staiger et al., 2010). Ωστόσο, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν τη λειτουργία του κυτταροσκελετού της ακτίνης στο σωλήνα γύρης παραμένουν ελάχιστα κατανοητοί. Έχουν προταθεί διαφορετικά μοντέλα σχετικά με τη λειτουργία του κυτταροσκελετού της ακτίνης κατά την ανάπτυξη του σωλήνα γύρης. Μία από τις πιο κοινές ιδέες είναι ότι ο κυτταροσκελετός ακτίνης οδηγεί το σύστημα ενδοκυτταρικής μεταφοράς που φέρει κυστίδια που προέρχονται από το Golgi που περιέχουν τα υλικά που είναι απαραίτητα για τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος και τη σύντηξη της μεμβράνης στο άκρο (Pierson and Cresti, 1992; Hepler et al., 2001; Vidali και Hepler, 2001). Ο κυτταροσκελετός ακτίνης έχει επίσης θεωρηθεί ως δομικό στοιχείο που υποστηρίζει την πίεση στροβιλισμού που απαιτείται για να οδηγήσει και να διατηρήσει την ταχεία ανάπτυξη του σωλήνα γύρης (Picton and Steer, 1982· Steer and Steer, 1989· Derksen et al., 1995). Επιπλέον, ο ίδιος ο πολυμερισμός της ακτίνης έχει επίσης αποδειχθεί ότι είναι σημαντικός για την ανάπτυξη του σωλήνα γύρης (Gibbon et al., 1999· Vidali et al., 2001). Ανεξάρτητα από τον συγκεκριμένο μηχανισμό που βρίσκεται κάτω από τη λειτουργία του κυτταροσκελετού της ακτίνης στην πολωμένη ανάπτυξη, είναι σημαντικό να περιγραφεί με ακρίβεια η χωρική κατανομή και η δυναμική του στον σωλήνα γύρης. Δεδομένου ότι η χωρική κατανομή και η δυναμική του κυτταροσκελετού της ακτίνης τροποποιούνται από την παρουσία διαφόρων πρωτεϊνών που δεσμεύουν την ακτίνη (ABPs) στα κύτταρα (Staiger et al., 2010; Huang et al., 2014), είναι επίσης σημαντικό να χαρακτηριστεί η λειτουργία και τρόπος δράσης αυτών των ABP. Πράγματι, ο πρόσφατος χαρακτηρισμός του τρόπου δράσης πολλών ABP που εκφράζονται με γύρη έχει παράσχει εξαιρετικές γνώσεις σχετικά με τη ρύθμιση της οργάνωσης και της δυναμικής της ακτίνης στο σωλήνα γύρης. Έτσι, ο σκοπός αυτής της ανασκόπησης είναι να συνοψίσει την τρέχουσα κατανόησή μας για την οργάνωση και τη δυναμική του κυτταροσκελετού της ακτίνης, καθώς και τη ρύθμισή του, στον σωλήνα γύρης.
Χωρική κατανομή νηματίων ακτίνης στον σωλήνα γύρης
Οι κατανομές του κυτταροσκελετού ακτίνης σε σταθερούς σωλήνες γύρης από διαφορετικά είδη έχουν χαρακτηριστεί χρησιμοποιώντας ανοσοχρώση με αντισώματα κατά της ακτίνης και χρώση με φθορίζουσα φαλλοιδίνη (Tang et al., 1989; Rutten and Derksen, 1990; Gibbon et al., Geitmann 1999 et al., 2000· Li et al., 2001· Ye et al., 2009). Ιστορικά, η επίτευξη συναίνεσης σχετικά με την κατανομή των νημάτων ακτίνης στις κορυφαίες και υποακρορριζικές περιοχές ήταν αρκετά προβληματική. Έχουν αναφερθεί διαφορετικά αποτελέσματα σχετικά με την κατανομή των νημάτων ακτίνης στις κορυφαίες και υποακρορριζικές περιοχές (Derksen et al., 1995· Miller et al., 1996). Η παραλλαγή μπορεί να οφείλεται σε διαφορές μεταξύ των ειδών ή λόγω της χρήσης διαφορετικών μεθόδων χρώσης. Η διακύμανση στις δομές ακτίνης στην κορυφαία περιοχή των σωλήνων γύρης που χρωματίζονται με χρήση διαφορετικών μεθόδων είναι πιθανότατα αποτέλεσμα αλλαγών στο στάδιο στερέωσης, στο οποίο τα κορυφαία νημάτια ακτίνης μπορεί να μην είναι καλά διατηρημένα. Αυτό το πρόβλημα πιθανώς οφείλεται σε δύο παράγοντες: ο ένας είναι ότι ο σωλήνας γύρης αναπτύσσεται πολύ γρήγορα και δεν μπορεί να στερεωθεί αμέσως, και ένας άλλος είναι ότι τα κορυφαία νημάτια ακτίνης είναι εξαιρετικά δυναμικά και εύθραυστα. Οι αρχικές παρατηρήσεις από πειράματα που χρησιμοποιούν συμβατικές διαδικασίες στερέωσης έδειξαν ότι υπάρχουν πυκνά νημάτια ακτίνης στο άκρο (Tiwari and Polito, 1988· Tang et al., 1989· Derksen et al., 1995). Ωστόσο, η έγχυση ροδαμίνης φαλλοιδίνης σε σωλήνες γύρης απέτυχε να επισημάνει τα νήματα ακτίνης στην ακραία κορυφή (Miller et al., 1996). και αρκετές άλλες μελέτες έδειξαν ότι η ακραία κορυφή έχει εξαντληθεί από νήματα ακτίνης σε σταθερούς σωλήνες γύρης (Li et al., 2001; Raudaskoski et al., 2001; Vidali et al., 2001). Αργότερα, χρησιμοποιώντας βελτιωμένα σχήματα στερέωσης που είναι πιο πιθανό να διατηρήσουν καλύτερα τις κυτταρικές δομές, όπως η ταχεία σταθεροποίηση κατάψυξης, η κατανομή του κυτταροσκελετού της ακτίνης στην κορυφαία περιοχή αποκαλύφθηκε αναπαραγώγιμα στον σωλήνα γύρης (Lovy-Wheeler et al., 2005). Αυτό το πρότυπο κατανομής ακτίνης επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από τα αποτελέσματα της επισήμανσης νήματος ακτίνης χρησιμοποιώντας δείκτες ακτίνης ζωντανών κυττάρων (Kost et al., 1998; Fu et al., 2001; Qu et al., 2013, βλέπε επίσης την περιγραφή παρακάτω). όπως η ταχεία σταθεροποίηση κατάψυξης, η κατανομή του κυτταροσκελετού της ακτίνης στην κορυφαία περιοχή αποκαλύφθηκε με δυνατότητα αναπαραγωγής στον σωλήνα γύρης (Lovy-Wheeler et al., 2005). Αυτό το πρότυπο κατανομής ακτίνης επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από τα αποτελέσματα της επισήμανσης νήματος ακτίνης χρησιμοποιώντας δείκτες ακτίνης ζωντανών κυττάρων (Kost et al., 1998; Fu et al., 2001; Qu et al., 2013, βλέπε επίσης την περιγραφή παρακάτω). όπως η ταχεία σταθεροποίηση κατάψυξης, η κατανομή του κυτταροσκελετού της ακτίνης στην κορυφαία περιοχή αποκαλύφθηκε με δυνατότητα αναπαραγωγής στον σωλήνα γύρης (Lovy-Wheeler et al., 2005). Αυτό το πρότυπο κατανομής ακτίνης επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από τα αποτελέσματα της επισήμανσης νήματος ακτίνης χρησιμοποιώντας δείκτες ακτίνης ζωντανών κυττάρων (Kost et al., 1998; Fu et al., 2001; Qu et al., 2013, βλέπε επίσης την περιγραφή παρακάτω).
Έτσι, η τρέχουσα συναινετική άποψη της χωρικής κατανομής των νηματίων ακτίνης είναι ότι είναι διατεταγμένα σε τουλάχιστον τρεις διακριτές δομές στον σωλήνα γύρης, σύμφωνα με τη ζωνοποίηση του κυτταροπλάσματος (Εικόνα 1Α; Lovy-Wheeler et al., 2005; Ren και Xiang, 2007· Chen et al., 2009· Staiger et al., 2010). Στο στέλεχος, τα νημάτια ακτίνης διατάσσονται αξονικά σε δέσμες με ομοιόμορφη πολικότητα, η οποία επιτρέπει τη μεταφορά οργανιδίων ή κυστιδίων από τη βάση στην άκρη κατά μήκος του κυτταρικού φλοιού. Στην υποκορυφή, τα νημάτια ακτίνης σχηματίζουν κανονικές δομές που αναφέρονται ως κολάρο (Gibbon et al., 1999; Fu et al., 2001), κρόσσι (Lovy-Wheeler et al., 2005), πλέγμα (Geitmann et al., 2000 Chen et al., 2002) ή χωνί (Vidali et al., 2001) σε σωλήνες γύρης από διαφορετικά είδη. Σε αυτή την περιοχή, Η κυτταροπλασματική ροή αντιστρέφει την κατεύθυνση και γυρίζει πίσω προς τη βάση κατά μήκος των αξονικών καλωδίων ακτίνης στο κέντρο του σωλήνα, προκαλώντας το μοτίβο κυτταροπλασματικής ροής αντίστροφης πηγής (Hepler et al., 2001; Ye et al., 2009). Αν και μεγάλα οργανίδια δεν εισέρχονται στην κορυφαία περιοχή, μικρά κυστίδια εισέρχονται και συσσωρεύονται στην κορυφαία περιοχή (Εικόνες 1Α, Β). Στην κορυφαία περιοχή, τα νημάτια ακτίνης είναι λιγότερο άφθονα, αλλά είναι εξαιρετικά δυναμικά. Η δυναμική του εντοπισμένου στην άκρη πληθυσμού των νηματίων ακτίνης έχει διερευνηθεί σε σωλήνες γύρης καπνού, κρίνου και Arabidopsis (Fu et al., 2001· Qu et al., 2013· Rounds et al., 2014, βλέπε επίσης τη λεπτομερή περιγραφή παρακάτω ), το οποίο έχει διευρύνει την κατανόησή μας για τη λειτουργία των νηματίων ακτίνης. Ωστόσο, τα μέσα με τα οποία αυτά τα νημάτια ακτίνης ρυθμίζουν με ακρίβεια τα υποκείμενα κυτταρικά συμβάντα,
ΣΧΗΜΑ 1. Χωρική κατανομή των νημάτων ακτίνης στο σωλήνα γύρης. (ΕΝΑ)Σχηματικό που δείχνει τη χωρική κατανομή των νηματίων ακτίνης στο σωλήνα γύρης. Στην κορυφή, τα νημάτια ακτίνης είναι λιγότερο άφθονα. Στην υποακρορριζική περιοχή, τα νήματα ακτίνης σχηματίζουν την κανονική δομή κολάρου ακτίνης. Στην περιοχή του στελέχους, τα νήματα ακτίνης συσκευάζονται αξονικά σε καλώδια, που ονομάζονται διαμήκη καλώδια ακτίνης. Αυτές οι δομές ακτίνης πιστεύεται ότι εκτελούν διακριτές λειτουργίες. Τα διαμήκη καλώδια ακτίνης παρέχουν τις μοριακές διαδρομές για την κίνηση μεγάλων οργανιδίων και κυστιδίων από τη βάση προς την άκρη. Τα οργανίδια και τα κυστίδια αντιστρέφουν την κατεύθυνση στην υποακρορριζική περιοχή και επιστρέφουν στη βάση μέσω του μέσου του σωλήνα γύρης, δημιουργώντας το μοτίβο κυτταροπλασματικής ροής αντίστροφης πηγής. Αυτά τα μεγάλα οργανίδια δεν εισέρχονται ποτέ στην άκρη, με αποτέλεσμα να σχηματίζεται η οπτική λεία ζώνη στο άκρο που αναφέρεται ως «καθαρή ζώνη». Ωστόσο, αυτή η περιοχή είναι γεμάτη με μικρά κυστίδια. Επομένως, τα νημάτια ακτίνης στην κορυφαία περιοχή πιστεύεται ότι είναι σημαντικά για τη στόχευση κυστιδίων και τα συμβάντα σύντηξης. Τα μαύρα βέλη δείχνουν την κατεύθυνση της κυτταροπλασματικής ροής.(Β) Χωρική κατανομή των ARA7-θετικών κυστιδίων και των RabA4b-θετικών κυστιδίων σε σωλήνες γύρης. Τα θετικά στο ARA7 κυστίδια δεν εισβάλλουν στην κορυφαία περιοχή, ενώ τα θετικά στο RabA4b κυστίδια εισέρχονται στην κορυφαία περιοχή. Μπάρα κλίμακας = 10 μm. (Γ) Το ABD2-GFP διακοσμεί τα διαμήκη καλώδια ακτίνης. Μπάρα κλίμακας = 10 μm. (D) Τα νήματα ακτίνης σε σωλήνες γύρης Arabidopsis αποκαλύφθηκαν με διακόσμηση με Lifeact-mEGFP. Παρουσιάζονται εικόνες που δείχνουν το φλοιώδες επίπεδο, το μεσαίο επίπεδο και μια προβολή αντιπροσωπευτικού σωλήνα γύρης. Τα νήματα ακτίνης στην περιοχή του κορμού, στην υποακρορριζική και στην κορυφαία περιοχή υποδεικνύονται με πράσινες, κίτρινες και κόκκινες κουκκίδες, αντίστοιχα. Μπάρα κλίμακας = 10 μm.
Δείκτες ακτίνης που χρησιμοποιούνται για τη διακόσμηση των νημάτων ακτίνης σε αναπτυσσόμενους σωλήνες γύρης
Η χρώση των νηματίων ακτίνης σε σταθερούς σωλήνες γύρης έχει δώσει πολλές χρήσιμες πληροφορίες σχετικά με τη χωρική κατανομή των νημάτων ακτίνης στο σωλήνα γύρης (Gibbon et al., 1999; Geitmann et al., 2000; Lovy-Wheeler et al., 2005 ). Ωστόσο, η χρήση σταθερών ιστών παρέχει μόνο μια στατική εικόνα και δεν αποκαλύπτει πώς ο κυτταροσκελετός της ακτίνης αναδιαμορφώνεται κατά την ανάπτυξη του σωλήνα γύρης. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη δεικτών για την επισήμανση των νημάτων ακτίνης σε ζωντανούς σωλήνες γύρης ήταν πολύ απαραίτητη, προκειμένου να επιτραπεί η ανίχνευση της δυναμικής του νήματος ακτίνης κατά την ανάπτυξη του σωλήνα γύρης. Η εισαγωγή της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) έχει φέρει επανάσταση στον τρόπο με τον οποίο απεικονίζεται η κυτταρική δυναμική (Brandizzi et al., 2002). Πολυάριθμοι χρήσιμοι δείκτες σύντηξης GFP έχουν αναπτυχθεί με σκοπό την οπτικοποίηση της δυναμικής του κυτταροσκελετού και έχουν φέρει επανάσταση στην έρευνα στον τομέα του κυτταροσκελετού (Stringham et al., 2012). Στα φυτά, μέχρι σήμερα, η GFP-ακτίνη δεν έχει ποτέ αποδειχθεί ότι είναι χρήσιμος δείκτης για τη διακόσμηση της νηματώδους ακτίνης, πιθανώς για έναν ή περισσότερους από τους ακόλουθους λόγους. Ένα πιθανό ζήτημα είναι ότι η ετικέτα GFP αλλάζει τη λειτουργία της ακτίνης και εμποδίζει την ενσωμάτωσή της στη νηματώδη ακτίνη ή αλλάζει τη διαμόρφωση της νηματώδους ακτίνης μετά την ενσωμάτωσή της. Ένας άλλος πιθανός λόγος είναι ότι η νηματώδης ακτίνη αντιπροσωπεύει μόνο έναν μικρό πληθυσμό της συνολικής ακτίνης στα φυτικά κύτταρα (Staiger and Blanchoin, 2006). Επομένως, το νηματοειδές σήμα μπορεί να καλυφθεί από τη συντριπτική ποσότητα μονομερούς σήματος. Η GFP-ακτίνη δεν έχει ποτέ αποδειχθεί ότι είναι χρήσιμος δείκτης για τη διακόσμηση της νηματώδους ακτίνης, πιθανώς για έναν ή περισσότερους από τους ακόλουθους λόγους. Ένα πιθανό ζήτημα είναι ότι η ετικέτα GFP αλλάζει τη λειτουργία της ακτίνης και εμποδίζει την ενσωμάτωσή της στη νηματώδη ακτίνη ή αλλάζει τη διαμόρφωση της νηματώδους ακτίνης μετά την ενσωμάτωσή της. Ένας άλλος πιθανός λόγος είναι ότι η νηματώδης ακτίνη αντιπροσωπεύει μόνο έναν μικρό πληθυσμό της συνολικής ακτίνης στα φυτικά κύτταρα (Staiger and Blanchoin, 2006). Επομένως, το νηματοειδές σήμα μπορεί να καλυφθεί από τη συντριπτική ποσότητα μονομερούς σήματος. Η GFP-ακτίνη δεν έχει ποτέ αποδειχθεί ότι είναι χρήσιμος δείκτης για τη διακόσμηση της νηματώδους ακτίνης, πιθανώς για έναν ή περισσότερους από τους ακόλουθους λόγους. Ένα πιθανό ζήτημα είναι ότι η ετικέτα GFP αλλάζει τη λειτουργία της ακτίνης και εμποδίζει την ενσωμάτωσή της στη νηματώδη ακτίνη ή αλλάζει τη διαμόρφωση της νηματώδους ακτίνης μετά την ενσωμάτωσή της. Ένας άλλος πιθανός λόγος είναι ότι η νηματώδης ακτίνη αντιπροσωπεύει μόνο έναν μικρό πληθυσμό της συνολικής ακτίνης στα φυτικά κύτταρα (Staiger and Blanchoin, 2006). Επομένως, το νηματοειδές σήμα μπορεί να καλυφθεί από τη συντριπτική ποσότητα μονομερούς σήματος. Ένα πιθανό ζήτημα είναι ότι η ετικέτα GFP αλλάζει τη λειτουργία της ακτίνης και εμποδίζει την ενσωμάτωσή της στη νηματώδη ακτίνη ή αλλάζει τη διαμόρφωση της νηματώδους ακτίνης μετά την ενσωμάτωσή της. Ένας άλλος πιθανός λόγος είναι ότι η νηματώδης ακτίνη αντιπροσωπεύει μόνο έναν μικρό πληθυσμό της συνολικής ακτίνης στα φυτικά κύτταρα (Staiger and Blanchoin, 2006). Επομένως, το νηματοειδές σήμα μπορεί να καλυφθεί από τη συντριπτική ποσότητα μονομερούς σήματος. Ένα πιθανό ζήτημα είναι ότι η ετικέτα GFP αλλάζει τη λειτουργία της ακτίνης και εμποδίζει την ενσωμάτωσή της στη νηματώδη ακτίνη ή αλλάζει τη διαμόρφωση της νηματώδους ακτίνης μετά την ενσωμάτωσή της. Ένας άλλος πιθανός λόγος είναι ότι η νηματώδης ακτίνη αντιπροσωπεύει μόνο έναν μικρό πληθυσμό της συνολικής ακτίνης στα φυτικά κύτταρα (Staiger and Blanchoin, 2006). Επομένως, το νηματοειδές σήμα μπορεί να καλυφθεί από τη συντριπτική ποσότητα μονομερούς σήματος.
Η επισήμανση ορισμένων ABP ή των περιοχών δέσμευσης ακτίνης που προέρχονται από αυτά με GFP έχει παράσχει έναν μη επεμβατικό τρόπο απεικόνισης νηματίων ακτίνης στα φυτά. Αρκετοί από αυτούς τους δείκτες ακτίνης έχουν χρησιμοποιηθεί για την απεικόνιση νημάτων ακτίνης σε αναπτυσσόμενους σωλήνες γύρης (Πίνακας 1). Ο παλαιότερος δείκτης ακτίνης που χρησιμοποιήθηκε για τη διακόσμηση νημάτων ακτίνης σε σωλήνες γύρης ήταν ο GFP-mTalin (Πίνακας 1, Kost et al., 1998). Ωστόσο, στις μέρες μας, το GFP-mTalin χρησιμοποιείται σπάνια επειδή προκαλεί υπερβολική δέσμευση νημάτων (Ketelaar et al., 2004b). Το GFP-ADF αποδείχθηκε ότι διακοσμεί νημάτια ακτίνης και κυρίως στην υποακρορριζική περιοχή του σωλήνα γύρης (Πίνακας 1· Chen et al., 2002· Cheung et al., 2008, 2010) και LIM-GFP και GFP-fimbrin/ Το ABD2-GFP διακοσμεί τα διαμήκη καλώδια ακτίνης στα στελέχη των σωλήνων γύρης (Πίνακας 1· Εικόνα 1C· Wilsen et al., 2006· Cheung et al., 2008). Ωστόσο, Αυτοί οι δείκτες ακτίνης έχουν ο καθένας ξεχωριστά μειονεκτήματα στην αποκάλυψη δομών ακτίνης στο σωλήνα γύρης. για παράδειγμα, το GFP-fimbrin/ABD2-GFP δεν επισημαίνει καλά τα νήματα ακτίνης στις κορυφαίες και υποακρορριζικές περιοχές (Εικόνα 1C· Cheung et al., 2008). Παρά αυτά τα ζητήματα, αυτοί οι δείκτες είναι χρήσιμοι για την επισήμανση διαφορετικών πτυχών του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Έτσι, η χρήση διαφορετικών δεικτών ακτίνης μπορεί να είναι αποτελεσματική για τη μελέτη της κατανομής και των αλλαγών στον κυτταροσκελετό της ακτίνης στο σωλήνα γύρης. Ωστόσο, ο ιδανικός δείκτης ακτίνης θα ήταν σε θέση να ανιχνεύσει όλες τις σειρές νημάτων ακτίνης που υπάρχουν στον αναπτυσσόμενο σωλήνα γύρης και θα ήταν ακόμη καλύτερο εάν είχε ελάχιστη επίδραση στη φυσιολογική δυναμική της ακτίνης. Από αυτή την άποψη, το Lifeact-mEGFP έχει γίνει ο δείκτης ακτίνης επιλογής στο σωλήνα γύρης. Το Lifeact-mEGFP περιέχει μια θέση δέσμευσης ακτίνης που αποτελείται από 17 αμινοξέα που προέρχονται από ζυμομύκητα ABP-140 συντηγμένο με mEGFP. Αυτή η πρωτεΐνη διακοσμεί νημάτια ακτίνης σε ζωικά κύτταρα (Riedl et al., 2008) και έχει χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση νημάτων ακτίνης σε αναπτυσσόμενους σωλήνες γύρης καπνού και κρίνου (Vidali et al., 2009; Dong et al., 2012). Πρόσφατα, έχει χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση νημάτων ακτίνης σε σωλήνες γύρης Arabidopsis (Qu et al., 2013; Zhu et al., 2013; Qin et al., 2014). Το Lifeact-mEGFP αποκαλύπτει όμορφα δομές ακτίνης μέσα σε διαφορετικές περιοχές του σωλήνα γύρης Arabidopsis (Εικόνα 1D· Qu et al., 2013) και τα αποτελέσματα που χρησιμοποιούν αυτόν τον δείκτη θυμίζουν αποτελέσματα από χρώση με ακτίνη σταθερών σωλήνων γύρης (Gibbon et al., 1999 Lovy-Wheeler et al., 2005). Επομένως, Το Lifeact-mEGFP αντιπροσωπεύει έναν ιδανικό δείκτη ακτίνης για την οπτικοποίηση της οργάνωσης και την ανίχνευση της δυναμικής των νημάτων ακτίνης στο σωλήνα γύρης (Εικόνα 1D, βλέπε την ακόλουθη ενότητα). Σίγουρα, η προσεκτική ανάλυση της οργάνωσης και της δυναμικής του κυτταροσκελετού ακτίνης σε ολόκληρο τον γυρεοσωλήνα χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό τυπικών και νέων δεικτών ακτίνης θα είναι χρήσιμη στο μέλλον.
ΠΙΝΑΚΑΣ 1. Δείκτες ακτίνης που χρησιμοποιούνται για τη διακόσμηση των νημάτων ακτίνης σε ζωντανούς σωλήνες γύρης.
Δυναμική νήματος ακτίνης στον σωλήνα γύρης
Ο κυτταροσκελετός της ακτίνης παίζει αναπόσπαστο ρόλο κατά την ανάπτυξη του γυρεόσωληνα. Εκτιμάται καλά ότι τα σχετικά σταθερά διαμήκη καλώδια ακτίνης οδηγούν την ενδοκυτταρική κίνηση στο στέλεχος για την προώθηση της ανάπτυξης του σωλήνα γύρης (Hepler et al., 2001; Ye et al., 2009; Wu et al., 2010). Εν τω μεταξύ, αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η δυναμική κατάσταση των νημάτων ακτίνης στην περιοχή της κορυφής είναι επίσης κρίσιμη για την ανάπτυξη (Gibbon et al., 1999· Vidali et al., 2001). Τα κορυφαία νημάτια ακτίνης πιστεύεται ότι διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ταχύτητας και της κατεύθυνσης της ανάπτυξης του σωλήνα γύρης ελέγχοντας τα συμβάντα πρόσδεσης και σύντηξης κυστιδίων (Gibbon et al., 1999; Fu et al., 2001; Vidali et al., 2001; Lee et al., 2008· Qu et al., 2013). Ωστόσο, η ακριβής λειτουργία των νημάτων ακτίνης εντός της κορυφαίας περιοχής παραμένει ελάχιστα κατανοητή. Αυτό οφείλεται εν μέρει στο ότι γνωρίζουμε πολύ λίγα για την ακριβή οργάνωση των κορυφαίων νημάτων ακτίνης. Απαιτείται άμεση οπτικοποίηση μεμονωμένων νηματίων ακτίνης και ποσοτικοποίηση των σχετικών παραμέτρων για την παροχή πληροφοριών σχετικά με την οργανωτική φύση αυτών των κορυφαίων νημάτων ακτίνης.
Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η ανάπτυξη του σωλήνα γύρης είναι πιο ευαίσθητη από την κυτταροπλασματική ροή σε φάρμακα αποπολυμερισμού ακτίνης (Gibbon et al., 1999· Vidali et al., 2001), υπονοώντας ότι οι δομές ακτίνης στο άκρο είναι εξαιρετικά δυναμικές. Η άμεση οπτικοποίηση των διακοσμημένων με GFP-mTalin νημάτων ακτίνης έδειξε ότι τα εντοπισμένα στο άκρο νήματα ακτίνης, που ονομάζονται βραχείες δέσμες ακτίνης, είναι πράγματι εξαιρετικά δυναμικά και ότι η δυναμική τους συνδέεται με το σχηματισμό δομών ακτίνης στην υποακρορριζική περιοχή (Fu et al. , 2001· Hwang et al., 2005). Η πρόσφατη οπτικοποίηση και ποσοτικοποίηση μεμονωμένων νημάτων ακτίνης εντός του κορυφαίου θόλου των σωλήνων γύρης Arabidopsis thaliana παρείχε περαιτέρω πληροφορίες για αυτό το σύστημα. Μέσω της χρήσης της προηγμένης τεχνολογίας απεικόνισης της ομοεστιακής μικροσκοπίας περιστρεφόμενου δίσκου, Ανιχνεύσαμε τη δυναμική των μεμονωμένων νημάτων ακτίνης και ποσοτικοποιήσαμε τις σχετικές παραμέτρους τους, όπως οι ρυθμοί επιμήκυνσης και βράχυνσης του νήματος, η συχνότητα αποκοπής και άλλοι παράγοντες (Qu et al., 2013). Οι παρατηρήσεις μας αποκάλυψαν ότι τα νήματα ακτίνης δημιουργούνται συνεχώς από την κορυφαία μεμβράνη του σωλήνα γύρης (Εικόνα 2Α· Qu et al., 2013) και ότι αυτή η διαδικασία πιθανότατα μεσολαβείται από φορμίνες, όπως η AtFH5 (Cheung et al., 2010 ). Τα νήματα ακτίνης που προέρχονται από την ακραία κορυφή είναι εξαιρετικά δυναμικά. Είτε αναποδογυρίζονται τοπικά είτε μετακινούνται στην κορυφαία πλευρά, πιθανώς με τη ροή της μεμβράνης (Εικόνα 2Β), εξηγώντας εν μέρει γιατί τα νήματα ακτίνης είναι λιγότερο άφθονα στην ακραία κορυφή. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν επίσης πειστικά στοιχεία ότι η εξωκυττάρωση εμφανίζεται στην ακραία κορυφή, υποστηρίζοντας προηγούμενα ευρήματα (Lee et al., 2008; Wang et al.,
ΕΙΚΟΝΑ 2. Δυναμική ακτίνης στο σωλήνα γύρης. (Α) Τα νήματα ακτίνης δημιουργούνται συνεχώς από την κορυφαία μεμβράνη εντός του κορυφαίου θόλου. Οι εικόνες που παρουσιάζονται είναι εικόνες time-lapse με μέγιστη προβολή. Τα αναδυόμενα μεμονωμένα νήματα ακτίνης σημειώνονται με δύο κουκκίδες του ίδιου χρώματος. Τα κίτρινα τρίγωνα υποδεικνύουν την προέλευση των γεγονότων πολυμερισμού της ακτίνης και η κίνηση των νημάτων από την κορυφή προς την κορυφαία πλευρά υποδεικνύεται με πορτοκαλί βέλη. Οι εικόνες είναι μεγαλύτερη μεγέθυνση της περιοχής του πλαισίου ολόκληρου του γυρεοσωλήνα που εμφανίζεται στο άκρο δεξιό πλαίσιο. Ράβδοι κλίμακας = 4 μm. (Β) Αντίστοιχες μεμονωμένες οπτικές τομές εικόνων που εμφανίζονται στο (Α)επιτρέποντας σαφή απεικόνιση της δυναμικής του απλού νήματος ακτίνης. Τα νήματα ακτίνης επισημαίνονται με δύο κουκκίδες του ίδιου χρώματος. Τα κόκκινα βέλη υποδεικνύουν συμβάντα επιμήκυνσης του νήματος, τα πράσινα βέλη υποδεικνύουν συμβάντα συρρίκνωσης του νήματος και το λευκό ψαλίδι υποδεικνύει συμβάντα αποκοπής. Μπάρα κλίμακας = 4 μm. (Γ) Σχηματική περιγραφή της δυναμικής των νημάτων ακτίνης εντός του κορυφαίου θόλου. Σχήμα προσαρμοσμένο από τους Qu et al. (2013). Με την άδεια από την Αμερικανική Εταιρεία Φυτικών Βιολόγων (www.plantcell.org). Για λεπτομερή περιγραφή, δείτε το σχετικό κείμενο και Qu et al. (2013). Τα 1, 2 και 3 σημαδεύουν νημάτια ακτίνης που πυρήνωναν από τη μεμβράνη στην ακραία κορυφή, που μετακινήθηκαν από την κορυφή στην κορυφαία πλευρά και που πυρηνώθηκαν από τη μεμβράνη στην κορυφή, αντίστοιχα. (D,E)Δυναμικός σχηματισμός δεσμών ακτίνης στην περιοχή του κορμού. (Δ) Συμβάντα αποδέσμευσης νήματος. Οι κίτρινες κουκκίδες τονίζουν τις δέσμες ακτίνης που χωρίζονται σε δύο δέσμες που επισημαίνονται με κόκκινες και πράσινες κουκκίδες. Η δέσμη που σημειώνεται με κόκκινες κουκκίδες υποβάλλεται σε κοπή (ενοχοποιείται με ψαλίδι) και αποπολυμερισμό. Οι εικόνες είναι μεγαλύτερη μεγέθυνση της περιοχής του πλαισίου που εμφανίζεται στο άκρο δεξιό πλαίσιο. (Ε) Συμβάν ομαδοποίησης. Τα νήματα ακτίνης που σημειώνονται με πράσινες κουκκίδες και κόκκινες κουκκίδες συγκεντρώθηκαν μέσω “φερμουάρ” για να σχηματίσουν τη μεγαλύτερη δέσμη που υποδεικνύεται με κίτρινες κουκκίδες. Ράβδοι κλίμακας = 4 μm.
Τα νήματα ακτίνης επιμηκύνονται πολύ γρήγορα εντός της κορυφαίας περιοχής (Πίνακας 2· Qu et al., 2013), σύμφωνα με μετρήσεις που υποδεικνύουν ότι υπάρχει υψηλή συγκέντρωση συμπλόκου ακτίνης/προφιλίνης στα κύτταρα γύρης (Vidali and Hepler, 1997; Gibbon et al. , 1999, Snowman et al., 2002). Τα νημάτια ακτίνης αποκόπτονται επίσης συχνά εντός της κορυφαίας περιοχής (Εικόνα 2Β· Qu et al., 2013), παρόμοια με ευρήματα που δείχνουν ότι τα νημάτια ακτίνης στην περιοχή του φλοιού των αιτιολωμένων υποκοτυλίκων κυττάρων και των κυττάρων αιωρήματος BY-2 εξαλείφονται κυρίως με την αποκοπή του νήματος δραστηριότητα (Staiger et al., 2009; Smertenko et al., 2010). Εκτός από την αύξηση της τοπικής ανακύκλωσης των κορυφαίων νημάτων ακτίνης, αυτή η δραστηριότητα αποκοπής μπορεί να διευκολύνει την απομάκρυνση των κομμένων νημάτων ακτίνης από την κορυφαία περιοχή. παρέχοντας μια δεξαμενή νημάτων ακτίνης που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την κατασκευή δομών ακτίνης στην υποακρορριζική περιοχή (Εικόνα 2Α· Qu et al., 2013). Έτσι, σε κάποιο βαθμό, τα νημάτια ακτίνης στις κορυφαίες και υποακρορριζικές περιοχές φαίνεται να συνδέονται εγγενώς, σύμφωνα με προηγούμενα ευρήματα (Fu et al., 2001; Hwang et al., 2005; Cheung et al., 2010). Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, παρουσιάζουμε ένα απλό μοντέλο που περιγράφει την οργάνωση και τη δυναμική των νημάτων ακτίνης εντός του κορυφαίου θόλου του σωλήνα γύρης (Εικόνα 2C· Qu et al., 2013). Μια εξαιρετικά δυναμική δεξαμενή νημάτων ακτίνης δημιουργείται συνεχώς από την κορυφαία μεμβράνη. Είτε αναποδογυρίζονται τοπικά με δραστηριότητες αποκοπής νήματος και αποπολυμερισμού, είτε μπορούν να μετακινηθούν από την ακραία κορυφή προς την κορυφαία πλευρά,
ΠΙΝΑΚΑΣ 2. Δυναμικές παράμετροι που σχετίζονται με νημάτια ακτίνης σε διαφορετικές περιοχές του σωλήνα γύρης.
Η δυναμική των νημάτων ακτίνης εντός της περιοχής του κορμού ανιχνεύθηκε και ποσοτικοποιήθηκε επίσης. Συγκριτικά, το μέγιστο μήκος νήματος αυξήθηκε σημαντικά και η συχνότητα αποκοπής μειώθηκε ουσιαστικά στην περιοχή του κορμού σε σύγκριση με εκείνη στην κορυφαία περιοχή (Πίνακας 2), υποδηλώνοντας ότι τα νημάτια ακτίνης προσανατολισμένα στο στέλεχος είναι σχετικά σταθερά. Αυτό το εύρημα είναι σύμφωνο με προηγούμενες παρατηρήσεις που δείχνουν ότι η κυτταροπλασματική ροή είναι πιο ανθεκτική από την ανάπτυξη του σωλήνα γύρης στα φάρμακα αποπολυμερισμού της ακτίνης (Gibbon et al., 1999· Vidali et al., 2001). Δεδομένου ότι τα περισσότερα νημάτια ακτίνης συσκευάζονται σε δέσμες, πιθανώς με το «φερμουάρ» των επιμέρους νημάτων ακτίνης μεταξύ τους μέσω παραγόντων δέσμευσης ακτίνης, όπως η βιλίνη, το κρότο και άλλοι, οι δραστηριότητες δέσμης ακτίνης αναλύθηκαν σε σωλήνες γύρης Arabidopsis (Εικόνες 2D, E). Αναλύθηκαν δύο μετρήσεις που περιγράφουν τη δυναμική της δέσμης κατά τη διάρκεια της απεικόνισης ζωντανών κυττάρων: οι συχνότητες ομαδοποίησης και αποδέσμευσης (Πίνακας 2). Η ομαδοποίηση παρατηρήθηκε σε συχνότητα 2,3 × 10-4 συμβάντα/μm 2 /s, ενώ ο διαχωρισμός έλαβε χώρα σε συχνότητα 5,4 × 10 -5 συμβάντα/μm 2 /s (Zheng et al., 2013). Συγκριτικά, η συχνότητα δέσμευσης στα επιδερμικά κύτταρα υποκοτυλίου μετρήθηκε ότι είναι 6,9 × 10 -5 συμβάντα/μm 2 /s (Hoffmann et al., 2014). Αυτά τα ευρήματα μπορεί να εξηγήσουν, σε κάποιο βαθμό, γιατί τα περισσότερα νημάτια ακτίνης υπάρχουν σε διαμήκεις δέσμες στο στέλεχος των σωλήνων γύρης. Η μελλοντική τεκμηρίωση του ρόλου και του μηχανισμού δράσης πολλών κύριων παραγόντων δέσμευσης ακτίνης σε αυτές τις διεργασίες θα ρίξει φως στη ρύθμιση της ισορροπίας μεταξύ των επιμέρους νημάτων και δεσμίδων ακτίνης.
Ρύθμιση της δυναμικής της ακτίνης στον σωλήνα γύρης: Οι ρόλοι και οι μηχανισμοί δράσης αρκετών ABP που εκφράζονται με γύρη
Λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι η οργάνωση και η δυναμική του κυτταροσκελετού ακτίνης ρυθμίζονται άμεσα από διάφορα ABP, η μελέτη των λειτουργιών και των μηχανισμών δράσης τους θα πρέπει να παρέχει πληροφορίες για τη ρύθμιση της οργάνωσης και τη δυναμική του κυτταροσκελετού της ακτίνης στο σωλήνα γύρης. Πράγματι, ο γενετικός χειρισμός των ABP που εκφράζονται με γύρη έχει εμπλουτίσει όλο και περισσότερο τις γνώσεις μας σε αυτόν τον τομέα. Δεδομένου ότι τα νήματα ακτίνης στις κορυφαίες και υποακρορριζικές περιοχές είναι εξαιρετικά δυναμικά και εγγενώς συνδεδεμένα (Fu et al., 2001; Hwang et al., 2005; Cheung et al., 2010; Qu et al., 2013) και ότι προσανατολίζονται στο στέλεχος τα διαμήκη καλώδια ακτίνης είναι σχετικά σταθερά και, σε κάποιο βαθμό, λειτουργικά διακριτά, στις επόμενες ενότητες,
Αρκετά ABP έχουν εμπλακεί στη ρύθμιση της κατασκευής και της αναδιαμόρφωσης των δομών ακτίνης στις κορυφαίες και υποκορυφαίες περιοχές
Είναι πλέον γενικά αποδεκτό ότι ένας πληθυσμός από εξαιρετικά δυναμικά νήματα ακτίνης υπάρχει στην κορυφαία περιοχή του σωλήνα γύρης. Ωστόσο, η οργανωτική φύση των δομών ακτίνης εντός της κορυφαίας περιοχής παραμένει ελάχιστα κατανοητή. Ο πρόσφατος χαρακτηρισμός αρκετών ABP έδωσε μοναδικές γνώσεις σχετικά με αυτό το ζήτημα και έχει επίσης επεκτείνει σημαντικά την κατανόησή μας για τις λειτουργίες αυτών των νημάτων ακτίνης, οδηγώντας μας να εξετάσουμε πώς ρυθμίζουν τις κυτταρικές διεργασίες, όπως η εξωκυττάρωση.
Η Φορμίνη Πυρηνώνει Νήματα Ακτίνης από την Κορυφαία Μεμβράνη
Η απεικόνιση ζωντανών κυττάρων της δυναμικής του νήματος ακτίνης έχει δείξει ότι τα νήματα ακτίνης δημιουργούνται συνεχώς από την κορυφαία πλασματική μεμβράνη (Εικόνα 2Α), υποδηλώνοντας ότι μπορεί να απαιτούνται παράγοντες πυρήνωσης ακτίνης αγκυρωμένοι στη μεμβράνη για αυτόν τον ρόλο. Το σύμπλοκο Arp2/3 και οι πρωτεΐνες φορμίνης είναι αναμφισβήτητα οι καλύτερα χαρακτηρισμένοι παράγοντες πυρήνωσης ακτίνης στα φυτά (Deeks et al., 2002; Blanchoin and Staiger, 2010; Zheng et al., 2012; Yanagisawa et al., 2013). Ιστορικά, το σύμπλεγμα Arp2/3 θεωρήθηκε ότι παίζει ρόλο στη ρύθμιση της πυρήνωσης των νημάτων ακτίνης στην κορυφαία περιοχή του σωλήνα γύρης (Mathur and Hulskamp, 2001). Ωστόσο, λαμβάνοντας υπόψη τις παρατηρήσεις ότι τα νημάτια ακτίνης αναπτύσσονται προς τα έξω αρκετά γραμμικά από την κορυφαία μεμβράνη και ότι η απώλεια λειτουργίας του συμπλέγματος Arp2/3 δεν παράγει προφανή φαινότυπο στη γύρη (αδημοσίευτη παρατήρηση), είναι πολύ απίθανο το σύμπλεγμα Arp2/3 να λειτουργεί ως ο κύριος παράγοντας πυρήνωσης σε αυτήν την περιοχή. Αντίθετα, οι φορμίνες μπορεί να είναι πιο λογικοί υποψήφιοι για παράγοντες πυρήνωσης ακτίνης σε αυτή την περιοχή. Η υπερέκφραση του Arabidopsis Formin1 (AtFH1) έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί σε υπερβολικό σχηματισμό καλωδίων ακτίνης και προκαλεί καμπυλότητα μεμβράνης στο άκρο του σωλήνα γύρης (Cheung and Wu, 2004), εμπλέκοντας αυτή τη φορμίνη στη δημιουργία νημάτων ακτίνης από την κορυφαία μεμβράνη. Πολύ πρόσφατα, αποδείχθηκε ότι το AtFH5 είναι ένας κύριος ρυθμιστής της πυρήνωσης των νημάτων ακτίνης που αναπτύσσονται από την κορυφαία μεμβράνη του σωλήνα γύρης (Cheung et al., 2010). Το AtFH5 εντοπίστηκε στην κορυφαία μεμβράνη και η καταστροφή του AtFH5 μείωσε την αφθονία των δομών ακτίνης στις κορυφαίες και υποακρορριζικές περιοχές των σωλήνων γύρης (Cheung et al., 2010). υποδηλώνοντας ότι η αγκυρωμένη σε κορυφαία μεμβράνη AtFH5 πυρηνώνει τη διάταξη ακτίνης για την κατασκευή δομών ακτίνης στις κορυφαίες και υποακρορριζικές περιοχές. Προς υποστήριξη αυτής της υπόθεσης, τα βιοχημικά δεδομένα αποκάλυψαν ότι το AtFH5 είναι ένας καλόπιστος παράγοντας πυρήνωσης ακτίνης και είναι ικανός να πυρηνώσει το συγκρότημα ακτίνης από μονομερή ακτίνης ή μονομερή ακτίνης συνδεδεμένα με το προφίλ (Ingouff et al., 2005). Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να αναλυθεί ο τρόπος με τον οποίο ρυθμίζεται η δραστηριότητα του AtFH5 κατά την ανάπτυξη του σωλήνα γύρης, καθώς και πώς μπορεί να συντονίσει τη δραστηριότητά του με αυτή άλλων φορμινών. Επιπλέον, λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι οι πρωτεΐνες φορμίνης μπορούν να χρησιμοποιήσουν το σύμπλεγμα προφίλ/ακτίνης για συναρμολόγηση και ότι η δεξαμενή μονομερούς ακτίνης στα φυτικά κύτταρα προβλέπεται να ρυθμιστεί από το προφίλ (Staiger and Blanchoin, 2006),
Πρωτεΐνες διαχωρισμού νήματος που εξαρτώνται από ασβέστιο οδηγούν τον κύκλο εργασιών των νηματίων ακτίνης κορυφής
Ο λειτουργικός χαρακτηρισμός των πρωτεϊνών βιλλίνης έδωσε πρόσφατα μοναδικές γνώσεις σχετικά με τον τρόπο με τον οποίο επιτυγχάνεται η ταχεία εναλλαγή των νημάτων ακτίνης στην κορυφαία περιοχή του σωλήνα γύρης. Λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι υπάρχει μια βαθμίδα ασβεστίου εστιασμένη στην άκρη στο σωλήνα γύρης με συγκεντρώσεις ασβεστίου που μπορούν να φτάσουν τα 1-3 μM στην κορυφαία περιοχή (Pierson et al., 1994; Holdaway-Clarke et al., 1997; Messerli et al. ., 2000), ο villin, ένας παράγοντας που προάγει τον αποπολυμερισμό της ακτίνης που ανταποκρίνεται στο ασβέστιο, προτάθηκε ως σημαντικός παράγοντας (Hepler et al., 2001· Vidali and Hepler, 2001· Yokota et al., 2005· Staiger et al., 201 ). Το Villin απομονώθηκε αρχικά από τη γύρη του κρίνου (Lilium longiflorum) βιοχημικά (Nakayasu et al., 1998· Yokota et al., 1998) και αποδείχθηκε ότι μειώνει το μήκος των νηματίων ακτίνης παρουσία ασβεστίου/καλμοδουλίνης (Yokota et al., 2005). Έκτοτε, αρκετά μέλη της υπεροικογένειας των πρωτεϊνών βιλλίνης/γκελσολίνης/φραγμίνης έχουν εμπλακεί στη ρύθμιση της δυναμικής της ακτίνης στον σωλήνα γύρης (Xiang et al., 2007· Wang et al., 2008b). Είναι σημαντικό, εκμεταλλευόμενοι τη δύναμη των γενετικών προσεγγίσεων A. thaliana, ο χαρακτηρισμός των villins στο Arabidopsis έχει παράσχει εξαιρετικές γνώσεις σχετικά με τους ρόλους αυτών των πρωτεϊνών στη ρύθμιση της δυναμικής της ακτίνης στον σωλήνα γύρης και κατά την ανάπτυξή του (Huang et al., 2014). .
Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι το Arabidopsis villin2 (VLN2) και το VLN5 που εκφράζεται με γύρη είναι σε θέση να αποκόψουν τα νήματα ακτίνης παρουσία μικρομοριακών συγκεντρώσεων ελεύθερου ασβεστίου (Zhang et al., 2010a; Bao et al., 2012). Αξιοσημείωτα, βρήκαμε επίσης ότι το VLN5 προάγει τον αποπολυμερισμό της ακτίνης παρουσία προφίλ υπό παρόμοιες συνθήκες (Zhang et al., 2010a), οδηγώντας στην υπόθεση ότι οι βιλλίνες μπορεί να ρυθμίζουν τη δυναμική της ακτίνης προάγοντας τον αποπολυμερισμό της ακτίνης στην κορυφαία περιοχή. Σύμφωνα με αυτή την ιδέα, νημάτια ακτίνης συσσωρεύτηκαν στην κορυφαία περιοχή των διπλών μεταλλαγμένων σωλήνων γύρης vln2 vln5 (Qu et al., 2013). Η οπτικοποίηση της δυναμικής των νηματίων ακτίνης σε ανάλυση ενός νήματος έδειξε ότι η μέση συχνότητα αποκοπής νήματος μειώθηκε και η μέση μέγιστη διάρκεια ζωής του νήματος αυξήθηκε στην κορυφαία περιοχή των διπλών μεταλλαγμένων σωλήνων γύρης vln2 vln5 (Qu et al., 2013). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι κακοποιοί προάγουν την ανακύκλωση της ακτίνης μέσω της εξαρτώμενης από το ασβέστιο δραστηριότητάς τους αποκοπής νήματος στις άκρες των σωλήνων γύρης.
Σύμφωνα με την ιδέα ότι τα νημάτια ακτίνης που έχουν πυρήνα από την κορυφαία μεμβράνη απαιτούνται για την κατασκευή δομών ακτίνης στην υποκορυφαία περιοχή (Cheung et al., 2010), η συσσώρευση νημάτων ακτίνης στην κορυφαία περιοχή των διπλών μεταλλαγμένων σωλήνων γύρης vln2 vln5 ήταν συνοδεύεται από αποδιοργάνωση των νημάτων ακτίνης στην υποακρορριζική περιοχή (Qu et al., 2013). Βεβαίως, καθώς οι βιλλίνες είναι γνωστό ότι είναι ευέλικτες ρυθμιστικές πρωτεΐνες ακτίνης (Huang et al., 2014), η δέσμευση νημάτων και η σταθεροποιητική δραστηριότητα των VLN2 και VLN5 μπορεί επίσης να συμβάλει στην κατασκευή δομών ακτίνης στην υποακρορριζική περιοχή του σωλήνα γύρης. Προς υποστήριξη αυτής της ιδέας, τα νημάτια ακτίνης στην υποκορυφική περιοχή των διπλών μεταλλαγμένων σωλήνων γύρης vln2 vln5 είναι πιο κυματιστά και είναι πιο λεπτά από εκείνα των ομολόγων τους άγριου τύπου (Qu et al., 2013). Επιπροσθέτως,
Αρκετές πρόσφατα χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες αποκοπής νημάτων που ανταποκρίνονται στο ασβέστιο, όπως η MAP18 (Zhu et al., 2013) και η MDP25 (Qin et al., 2014), μπορεί να συντονίζονται με βίλινες για τη ρύθμιση της δυναμικής της ακτίνης στον σωλήνα γύρης. Τόσο το MAP18 όσο και το MDP25 αποδείχθηκε ότι λειτουργούν ως πρωτεΐνες που σχετίζονται με μικροσωληνίσκους σε βλαστικά κύτταρα (Wang et al., 2007; Li et al., 2011). Παραδόξως, αυτές οι πρωτεΐνες έχει αποδειχθεί ότι δρουν ως ρυθμιστές της δυναμικής της ακτίνης στον σωλήνα γύρης (Zhu et al., 2013· Qin et al., 2014). Ο in vitro βιοχημικός χαρακτηρισμός αποκάλυψε ότι και οι δύο πρωτεΐνες είναι σε θέση να αποκόψουν τα νήματα της ακτίνης με τρόπο εξαρτώμενο από το ασβέστιο (Zhu et al., 2013· Qin et al., 2014). Η άμεση οπτικοποίηση του κυτταροσκελετού ακτίνης έδειξε ότι υπήρχαν περισσότερες δέσμες ακτίνης στην κορυφαία και υποακρορριζική περιοχή των σωλήνων γύρης map18 σε σύγκριση με τον άγριου τύπου (Zhu et al., 2013). υποδηλώνοντας ότι το MAP18 οδηγεί τον κύκλο εργασιών των νημάτων ακτίνης με αποκοπή. Ομοίως, η συχνότητα αποκοπής του νήματος μειώθηκε και τα νήματα ακτίνης ήταν πιο άφθονα στην υποακρορριζική περιοχή των σωλήνων γύρης mdp25 (Qin et al., 2014). Ο τρόπος με τον οποίο αυτές οι αποκρινόμενες στο ασβέστιο πρωτεΐνες αποκοπής νημάτων συντονίζονται για να ρυθμίσουν τον κύκλο εργασιών των νηματίων ακτίνης στην κορυφή του σωλήνα γύρης παραμένει να καθοριστεί. Επιπλέον, ο παράγοντας αποπολυμερισμού ακτίνης (ADF) και η πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με ακτίνη (AIP1) έχουν εμπλακεί στη ρύθμιση των δομών ακτίνης στην υποακρορική περιοχή του σωλήνα γύρης (Chen et al., 2002; Lovy-Wheeler et al., 2006 ), αν και ο τρόπος με τον οποίο συντονίζονται με πρωτεΐνες αποκοπής νημάτων που ανταποκρίνονται στο ασβέστιο για να οδηγήσουν τον κύκλο εργασιών των νηματίων ακτίνης μένει να εξεταστεί. Η συχνότητα αποκοπής του νήματος μειώθηκε και τα νήματα ακτίνης ήταν πιο άφθονα στην υποαριθική περιοχή των σωλήνων γύρης mdp25 (Qin et al., 2014). Ο τρόπος με τον οποίο αυτές οι αποκρινόμενες στο ασβέστιο πρωτεΐνες αποκοπής νημάτων συντονίζονται για να ρυθμίσουν τον κύκλο εργασιών των νηματίων ακτίνης στην κορυφή του σωλήνα γύρης παραμένει να καθοριστεί. Επιπλέον, ο παράγοντας αποπολυμερισμού ακτίνης (ADF) και η πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με ακτίνη (AIP1) έχουν εμπλακεί στη ρύθμιση των δομών ακτίνης στην υποακρορική περιοχή του σωλήνα γύρης (Chen et al., 2002; Lovy-Wheeler et al., 2006 ), αν και ο τρόπος με τον οποίο συντονίζονται με πρωτεΐνες αποκοπής νημάτων που ανταποκρίνονται στο ασβέστιο για να οδηγήσουν τον κύκλο εργασιών των νηματίων ακτίνης μένει να εξεταστεί. Η συχνότητα αποκοπής του νήματος μειώθηκε και τα νήματα ακτίνης ήταν πιο άφθονα στην υποαριθική περιοχή των σωλήνων γύρης mdp25 (Qin et al., 2014). Ο τρόπος με τον οποίο αυτές οι αποκρινόμενες στο ασβέστιο πρωτεΐνες αποκοπής νημάτων συντονίζονται για να ρυθμίσουν τον κύκλο εργασιών των νηματίων ακτίνης στην κορυφή του σωλήνα γύρης παραμένει να καθοριστεί. Επιπλέον, ο παράγοντας αποπολυμερισμού ακτίνης (ADF) και η πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με ακτίνη (AIP1) έχουν εμπλακεί στη ρύθμιση των δομών ακτίνης στην υποακρορική περιοχή του σωλήνα γύρης (Chen et al., 2002; Lovy-Wheeler et al., 2006 ), αν και ο τρόπος με τον οποίο συντονίζονται με πρωτεΐνες αποκοπής νημάτων που ανταποκρίνονται στο ασβέστιο για να οδηγήσουν τον κύκλο εργασιών των νηματίων ακτίνης μένει να εξεταστεί. Ο τρόπος με τον οποίο αυτές οι αποκρινόμενες στο ασβέστιο πρωτεΐνες αποκοπής νημάτων συντονίζονται για να ρυθμίσουν τον κύκλο εργασιών των νηματίων ακτίνης στην κορυφή του σωλήνα γύρης παραμένει να καθοριστεί. Επιπλέον, ο παράγοντας αποπολυμερισμού ακτίνης (ADF) και η πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με ακτίνη (AIP1) έχουν εμπλακεί στη ρύθμιση των δομών ακτίνης στην υποακρορική περιοχή του σωλήνα γύρης (Chen et al., 2002; Lovy-Wheeler et al., 2006 ), αν και ο τρόπος με τον οποίο συντονίζονται με πρωτεΐνες αποκοπής νημάτων που ανταποκρίνονται στο ασβέστιο για να οδηγήσουν τον κύκλο εργασιών των νηματίων ακτίνης μένει να εξεταστεί. Ο τρόπος με τον οποίο αυτές οι αποκρινόμενες στο ασβέστιο πρωτεΐνες αποκοπής νημάτων συντονίζονται για να ρυθμίσουν τον κύκλο εργασιών των νηματίων ακτίνης στην κορυφή του σωλήνα γύρης παραμένει να καθοριστεί. Επιπλέον, ο παράγοντας αποπολυμερισμού ακτίνης (ADF) και η πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με ακτίνη (AIP1) έχουν εμπλακεί στη ρύθμιση των δομών ακτίνης στην υποακρορική περιοχή του σωλήνα γύρης (Chen et al., 2002; Lovy-Wheeler et al., 2006 ), αν και ο τρόπος με τον οποίο συντονίζονται με πρωτεΐνες αποκοπής νημάτων που ανταποκρίνονται στο ασβέστιο για να οδηγήσουν τον κύκλο εργασιών των νηματίων ακτίνης μένει να εξεταστεί.
Αρκετά ABP έχουν εμπλακεί στη δημιουργία και την αναδιαμόρφωση των διαμήκων καλωδίων ακτίνης στο στέλεχος
Στην περιοχή του κορμού, τα νήματα ακτίνης διατάσσονται σε διαμήκη καλώδια (Lancelle and Hepler, 1992; Gibbon et al., 1999; Fu et al., 2001; Lovy-Wheeler et al., 2005). Είναι σαφές ότι αυτά τα διαμήκη καλώδια ακτίνης ρυθμίζουν την κυτταροπλασματική ροή σε σωλήνες γύρης παρέχοντας μοριακές διαδρομές για μυοσίνες, παρόμοια με τις παρατηρήσεις σε άλλα φυτικά κύτταρα (Shimmen and Yokota, 2004). Προηγούμενα αποτελέσματα έδειξαν ότι η κυτταροπλασματική ροή είναι σχετικά πιο ανθεκτική από την ανάπτυξη σωλήνων γύρης σε φάρμακα αποπολυμερισμού ακτίνης (Gibbon et al., 1999· Vidali et al., 2001), υποδηλώνοντας ότι τα διαμήκη καλώδια ακτίνης είναι σχετικά σταθερά. Ωστόσο, οι μηχανισμοί με τους οποίους δημιουργούνται και συντηρούνται αυτά τα διαμήκη καλώδια ακτίνης, καθώς και ο τρόπος με τον οποίο αναδιαμορφώνονται, παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστοι. Χαρακτηρισμός αρκετών ABP που εκφράζονται με γύρη,
Συγκρότημα Nucleate Actin Formins για την κατασκευή διαμήκων καλωδίων ακτίνης
Ο χαρακτηρισμός της ειδικής για τη γύρη φορμίνης Κατηγορίας Ι, AtFH3, έχει δώσει πληροφορίες για το βήμα πυρήνωσης που απαιτείται για τη δημιουργία διαμήκων καλωδίων ακτίνης στο στέλεχος του σωλήνα γύρης (Ye et al., 2009). Το AtFH3 είναι ένας καλόπιστος παράγοντας πυρήνωσης ακτίνης, ικανός να χρησιμοποιεί το σύμπλεγμα ακτίνης/προφιλίνης για την πυρηνοποίηση του συγκροτήματος ακτίνης. Είναι επίσης σε θέση να αλληλεπιδρά με το αγκαθωτό άκρο των νημάτων ακτίνης. Η καταστροφή του AtFH3 με χρήση RNAi επηρεάζει τον σχηματισμό διαμήκων καλωδίων ακτίνης, με αποτέλεσμα την εκπόλωση του σωλήνα γύρης (Ye et al., 2009). Δεδομένου ότι το AtFH3 είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής του πυρήνα της ακτίνης, θα είναι πολύ ενδιαφέρον να κατανοήσουμε καλύτερα πώς ακριβώς ρυθμίζεται η δραστηριότητά του. Επί πλέον,
Ο ADF/Cofilin Ρυθμίζει την αναδιαμόρφωση των διαμήκων καλωδίων ακτίνης
Ο παράγοντας αποπολυμερισμού ακτίνης/κοφιλίνη είναι σημαντικός για την ταχεία ανακύκλωση των νηματίων ακτίνης στα κύτταρα. Μέλη της οικογένειας ADF έχουν εμπλακεί στη ρύθμιση του κύκλου εργασιών της ακτίνης στη γύρη. Για παράδειγμα, οι ADF κρίνων αποδείχθηκε ότι συσσωρεύονται στο άνοιγμα βλάστησης κατά τη διάρκεια της προεξοχής του σωλήνα, αλλά κατανέμονται ομοιόμορφα στον σωλήνα γύρης (Smertenko et al., 2001). Σε αντίθεση με αυτήν την παρατήρηση, η επισήμανση της ειδικής για τη γύρη του καπνού ADF/cofilin (NtADF1) με GFP αποκάλυψε ότι αυτή η πρωτεΐνη διακοσμεί τη νηματώδη ακτίνη, ιδιαίτερα τις υποακρορριζικές δομές ακτίνης και τα διαμήκη καλώδια ακτίνης στο στέλεχος (Chen et al., 2002). Η υπερέκφραση του NtADF1 μειώνει τον αριθμό των αξονικά διατεταγμένων καλωδίων λεπτής ακτίνης (Chen et al., 2002), εμπλέκοντας το ADF ως οδηγό στον κύκλο εργασιών των διαμήκων καλωδίων ακτίνης.
Προκειμένου να διερευνηθεί ο ενδοκυτταρικός εντοπισμός του ειδικού για τη γύρη παράγοντα αποπολυμερισμού της ακτίνης Arabidopsis 7 (ADF7) στο σωλήνα γύρης, δημιουργήσαμε αρκετές δομές σύντηξης ADF7-EGFP που περιέχουν EGFP που έχουν εισαχθεί σε διαφορετικές θέσεις εντός του μορίου ADF7 με την ελπίδα να ελαχιστοποιήσουμε την παρεμβολή του η σύντηξη EGFP στη λειτουργία του ADF7. Μεταξύ των οποίων, μία πρωτεΐνη σύντηξης ADF7-EGFP (ADF7-EGFPV 10) είναι πλήρως λειτουργική (Zheng et al., 2013) και διακοσμεί τη νηματώδη ακτίνη σε όλο το σωλήνα γύρης (Daher et al., 2011; Zheng et al., 2013). Ο in vitro βιοχημικός χαρακτηρισμός έδειξε ότι ο ADF7 είναι ένας τυπικός ADF. Προτιμά την ακτίνη φορτωμένη με ADP και αναστέλλει την ανταλλαγή νουκλεοτιδίων και είναι σε θέση να προάγει τον αποπολυμερισμό της ακτίνης και να αποκόπτει τα νήματα ακτίνης. Ωστόσο, συγκριτικά, Η δράση του αποπολυμερισμού και αποκοπής της ακτίνης είναι χαμηλότερη από αυτή του φυτικού ADF1 (Zheng et al., 2013). Αυτή η παρατήρηση είναι σύμφωνη με μια προηγούμενη αναφορά ότι η γύρη κρίνος ADF1 (LIADF1) έχει ασθενή αποπολυμεριστική δράση ακτίνης σε σύγκριση με το φυτικό ADF καλαμποκιού Zea, ZmADF3 (Smertenko et al., 2001). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι οι αναπαραγωγικοί ADF μπορεί να έχουν εξελιχθεί για να παίζουν συγκεκριμένους ρόλους στη ρύθμιση της δυναμικής της ακτίνης στο πλαίσιο της γύρης.
Είναι ενδιαφέρον ότι το ADF7-EGFPV 10 βρέθηκε ότι διατηρεί πλήρως τις δραστηριότητες δέσμευσης μονομερούς ακτίνης (G-ακτίνη) και αποκοπής νήματος και είναι πλήρως λειτουργικό in vivo, ενώ μια άλλη πρωτεΐνη σύντηξης ADF7-EGFP (ADF7-EGFPD75) διατήρησε τη δέσμευση της G-ακτίνης. αλλά ήταν ανεπαρκής στην αποκοπή των νημάτων ακτίνης, ήταν μη λειτουργικός στον σωλήνα γύρης (Zheng et al., 2013). Τα αποτελέσματα από την ανάλυση αυτών των πρωτεϊνών πρότειναν ότι η δραστηριότητα αποκοπής του ADF7 είναι κρίσιμη για τις λειτουργίες του in vivo. Σύμφωνα με αυτή την υπόθεση, η ειδική κατάργηση της δραστηριότητας αποκοπής της cofilin ζυμομύκητα έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζει τη λειτουργία της in vivo (Chen and Pollard, 2011). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η σχετιζόμενη δραστηριότητα αποκοπής είναι σημαντική για τη λειτουργία των μελών της οικογένειας πρωτεΐνης ADF/κοφιλίνης in vivo. Πρόσθετες παρατηρήσεις έδειξαν ότι ο ρυθμός ανακύκλωσης των νημάτων ακτίνης μειώθηκε στους σωλήνες γύρης adf7, σύμφωνα με έναν ρόλο στην προώθηση του αποπολυμερισμού ακτίνης. Κατά συνέπεια, η ποσότητα της νηματώδους ακτίνης και η έκταση της δέσμης νημάτων αυξήθηκαν στους σωλήνες γύρης adf7. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το ADF7 είναι ένας σημαντικός παράγοντας στην ώθηση του κύκλου εργασιών των νημάτων ακτίνης στα στελέχη των σωλήνων γύρης (Zheng et al., 2013). Λεπτομερής τεκμηρίωση του λειτουργικού συντονισμού του ADF7 με άλλα ισοπαραγωγικά ADF, όπως το ADF10 (Daher et al., 2011), θα παράσχει περαιτέρω πληροφορίες σχετικά με τη ρύθμιση του κύκλου εργασιών της ακτίνης στο σωλήνα γύρης. Επιπλέον, ο προσδιορισμός της λειτουργικής σχέσης μεταξύ του ADF7 και άλλων παικτών, όπως η πρωτεΐνη που σχετίζεται με την κυκλάση (CAP1) (Chaudhry et al., 2007; Deeks et al., 2007) και το AIP1 (Ketelaar et al., 2004a; Shi et al., 2013) θα ρίξουν επίσης φως στη ρύθμιση του δυναμικού κύκλου εργασιών των διαμήκων καλωδίων ακτίνης.
Οι πρωτεΐνες δέσμης νήματος ακτίνης δημιουργούν διαμήκη καλώδια και διατηρούν τη διαμήκη διάταξη τους
Αρκετές πρωτεΐνες δέσμης νημάτων ακτίνης έχουν εμπλακεί στην οργάνωση των νημάτων ακτίνης σε δεσμίδες, καθώς και στη διατήρηση της διαμήκους διάταξης των δεσμίδων ακτίνης στα στελέχη των σωλήνων γύρης. In vitro βιοχημικές μελέτες έχουν δείξει ότι το Arabidopsis FIMBRIN5 (FIM5) είναι ένας καλόπιστος παράγοντας δέσμευσης ακτίνης που σταθεροποιεί τα νήματα ακτίνης (Wu et al., 2010). Η απώλεια της λειτουργίας του FIM5 επηρεάζει τη βλάστηση της γύρης και την πολωμένη ανάπτυξη του σωλήνα. Το FIM5 διακοσμεί τα νήματα ακτίνης σε όλο το σωλήνα γύρης και η απώλεια της λειτουργίας του FIM5 οδηγεί σε αποδιοργάνωση των νημάτων ακτίνης στον σωλήνα γύρης και μεταβάλλει τη διαμήκη διάταξη των καλωδίων ακτίνης (Wu et al., 2010; Su et al., 2012). Ως αποτέλεσμα, το μοτίβο της κυτταροπλασματικής ροής μεταβάλλεται, παρουσιάζοντας μειωμένη ταχύτητα και αλλαγμένη κατεύθυνση (Wu et al., 2010). Απρόσμενα, Οι δέσμες ακτίνης βρέθηκαν να είναι παχύτερες στους σωλήνες γύρης fim5 σε σύγκριση με τους σωλήνες άγριου τύπου (Wu et al., 2010), γεγονός που υποδηλώνει ότι η απώλεια λειτουργίας του FIM5 μπορεί να αυξήσει τη δραστηριότητα ορισμένων άλλων παραγόντων δέσμευσης ακτίνης. Αυτή η ερώτηση ίσως αξίζει να εξεταστεί στο μέλλον. Επιπλέον, η δραστηριότητα του LI-FIM1 αποδείχθηκε ότι είναι ευαίσθητη στο pH (Su et al., 2012), υποδηλώνοντας ότι το fimbrin μπορεί να λειτουργεί ως αισθητήρας που ρυθμίζει τη δυναμική της ακτίνης ως απόκριση στο pH. Απαιτείται περαιτέρω μελέτη για τον χαρακτηρισμό των μηχανισμών με τους οποίους το κροσσό ρυθμίζει τη δυναμική της ακτίνης στον σωλήνα γύρης ως απόκριση στις ταλαντώσεις του ενδοκυτταρικού pH. Αυτή η ερώτηση ίσως αξίζει να εξεταστεί στο μέλλον. Επιπλέον, η δραστηριότητα του LI-FIM1 αποδείχθηκε ότι είναι ευαίσθητη στο pH (Su et al., 2012), υποδηλώνοντας ότι το fimbrin μπορεί να λειτουργεί ως αισθητήρας που ρυθμίζει τη δυναμική της ακτίνης ως απόκριση στο pH. Απαιτείται περαιτέρω μελέτη για τον χαρακτηρισμό των μηχανισμών με τους οποίους το κροσσό ρυθμίζει τη δυναμική της ακτίνης στον σωλήνα γύρης ως απόκριση στις ταλαντώσεις του ενδοκυτταρικού pH. Αυτή η ερώτηση ίσως αξίζει να εξεταστεί στο μέλλον. Επιπλέον, η δραστηριότητα του LI-FIM1 αποδείχθηκε ότι είναι ευαίσθητη στο pH (Su et al., 2012), υποδηλώνοντας ότι το fimbrin μπορεί να λειτουργεί ως αισθητήρας που ρυθμίζει τη δυναμική της ακτίνης ως απόκριση στο pH. Απαιτείται περαιτέρω μελέτη για τον χαρακτηρισμό των μηχανισμών με τους οποίους το κροσσό ρυθμίζει τη δυναμική της ακτίνης στον σωλήνα γύρης ως απόκριση στις ταλαντώσεις του ενδοκυτταρικού pH.
Ο παράγοντας δέσμευσης villin έχει επίσης εμπλακεί στη ρύθμιση του διαμήκους σχηματισμού δέσμης ακτίνης στο στέλεχος του σωλήνα γύρης. Δύο ισοπαραγωγικά γονίδια Arabidopsis που εκφράζονται σε γύρη, τα VLN2 και VLN5, αποδείχθηκαν ότι είναι καλόπιστες πρωτεΐνες δέσμης νημάτων ακτίνης (Zhang et al., 2010a; Bao et al., 2012). Αν και η απώλεια της λειτουργίας του VLN5 από μόνη της δεν είχε εμφανή επίδραση στη δημιουργία και το σχηματισμό διαμήκων καλωδίων ακτίνης (Zhang et al., 2010a), η απώλεια λειτουργίας τόσο του VLN2 όσο και του VLN5 μείωσε την ποσότητα των νημάτων ακτίνης, υποδηλώνοντας ότι αυτές οι πρωτεΐνες σταθεροποίηση των νημάτων ακτίνης στο σωλήνα γύρης. Επιπλέον, τα καλώδια ακτίνης έγιναν πιο λεπτά και πιο αποδιοργανωμένα στα στελέχη των σωλήνων γύρης vln2 vln5 (Qu et al., 2013).
Διάφοροι άλλοι παράγοντες δέσμευσης νήματος ακτίνης μπορεί επίσης να εμπλέκονται στη ρύθμιση της κατασκευής και συντήρησης διαμήκων καλωδίων ακτίνης, όπως τα LIMs (Papuga et al., 2010) και η πρόσφατα αναγνωρισμένη, νέα φυτική πρωτεΐνη διασταυρούμενης σύνδεσης ακτίνης, CROLIN1 (Jia et al. ., 2013). Για παράδειγμα, το LI-LIM1 αποδείχθηκε ότι προάγει τη δέσμευση νημάτων ακτίνης και σταθεροποιεί τα νήματα ακτίνης στον σωλήνα γύρης (Wang et al., 2008a), υποδηλώνοντας ότι το LI-LIM1 εμπλέκεται στη ρύθμιση του σχηματισμού διαμήκων καλωδίων ακτίνης. Η απώλεια της λειτουργίας του CROLIN1 οδήγησε σε αστάθεια των νημάτων ακτίνης στα στελέχη των σωλήνων γύρης (Jia et al., 2013), εμπλέκοντας αυτή την πρωτεΐνη στη ρύθμιση της κατασκευής διαμήκων καλωδίων ακτίνης προσανατολισμένα στο στέλεχος. Ωστόσο,
Σχηματική περιγραφή της ρύθμισης της κατασκευής και της αναδιαμόρφωσης διακριτών δομών ακτίνης στον σωλήνα γύρης
Όπως περιγράφηκε παραπάνω, οι γνώσεις μας σχετικά με την οργάνωση και τη ρύθμιση του κυτταροσκελετού της ακτίνης στον σωλήνα γύρης έχει αυξηθεί σημαντικά. Ο λειτουργικός χαρακτηρισμός αρκετών ABP που εκφράζονται με γύρη έχει εμπλουτίσει την κατανόησή μας για τους σχετικούς μηχανισμούς. Συγκεκριμένα, η άμεση οπτικοποίηση και η ποσοτική ανάλυση της δυναμικής μεμονωμένων νημάτων ακτίνης σε σωλήνες γύρης με απώλεια λειτουργίας συγκεκριμένων ABPs, καθώς και προσεκτικές συγκρίσεις με σωλήνες γύρης άγριου τύπου έχουν δώσει ουσιαστική εικόνα. Με βάση αυτά τα δεδομένα, προτείνουμε ένα απλό μοντέλο που περιγράφει τον ρόλο των διαφόρων ABP στη ρύθμιση της οργάνωσης του κυτταροσκελετού της ακτίνης στον σωλήνα γύρης (Εικόνα 3).
ΣΧΗΜΑ 3. Σχηματική περιγραφή της ρύθμισης της δυναμικής της ακτίνης στο σωλήνα γύρης με βάση τον λειτουργικό χαρακτηρισμό των ABP που προέρχονται κυρίως από το Arabidopsis. (Α) Ενδοκυτταρικός εντοπισμός αρκετών ABP στον γυρεόσωληνα. Για μεθόδους που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό του εντοπισμού των FIMBRIN5, ADF7 και VILLIN5, βλέπε περιγραφές σε προηγούμενες μελέτες (Wu et al., 2010· Qu et al., 2013· Zheng et al., 2013). Μπάρα κλίμακας = 10 μm. (Β) Σχηματικό που περιγράφει τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό και τη λειτουργία διαφόρων ABPs στο σωλήνα γύρης. Για λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό και τη λειτουργία κάθε ABP, δείτε την περιγραφή στο κείμενο.
Δύο φορμίνες, η AtFH5 και η AtFH3, ρυθμίζουν την κατασκευή δομών ακτίνης στην κορυφαία και υποακρορριζική περιοχή και στην περιοχή του κορμού, αντίστοιχα. Το AtFH5 εντοπίζεται στην κορυφαία μεμβράνη εντός του κορυφαίου θόλου, όπου πυρηνώνει νημάτια ακτίνης από την κορυφαία μεμβράνη που χρησιμοποιούνται για την κατασκευή δομών ακτίνης στις κορυφαίες και υποακρορριζικές περιοχές (Εικόνα 3Β· Cheung et al., 2010). Αντίθετα, το AtFH3 πυρηνώνει νημάτια ακτίνης μέσα στο κυτταρόπλασμα ή από τη μεμβράνη για να δημιουργήσει διαμήκη καλώδια ακτίνης στο στέλεχος (Εικόνα 3Β· Ye et al., 2009). Σίγουρα, η μεταφορά νημάτων ακτίνης από τις κορυφαίες και υποακρορριζικές περιοχές στο στέλεχος θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει έναν άλλο πιθανό μηχανισμό που οδηγεί στην κατασκευή διαμήκων καλωδίων ακτίνης. Επιπροσθέτως,
Για να δημιουργηθούν δομές ακτίνης στις κορυφαίες και υποακρορριζικές περιοχές, τα νημάτια ακτίνης που δημιουργούνται από AtFH5 δεσμεύονται στιγμιαία από παράγοντες δέσμευσης ακτίνης, όπως βιλίνες (Qu et al., 2013), φιμπρίνες (Wu et al., 2010; Su et al., 2012) και/ή LIMs (Papuga et al., 2010), επιτρέποντάς τους να αναπτυχθούν προς τα έξω γραμμικά από τη μεμβράνη. Αυτά τα νημάτια ακτίνης υπόκεινται σε ταχεία ανακύκλωση λόγω των δραστηριοτήτων αποκοπής και αποπολυμερισμού του νήματος. Όσον αφορά αυτές τις δραστηριότητες, αρκετές εξαρτώμενες από το ασβέστιο πρωτεΐνες αποκοπής και αποπολυμερισμού νημάτων, συμπεριλαμβανομένων των βιλλινών (Qu et al., 2013), MAP18 (Zhu et al., 2013) και MDP25 (Qin et al., 2014), είναι λογικές υποψήφιοι για αυτούς τους ρόλους. Μαζί, αυτοί οι μηχανισμοί προφανώς οδηγούν στη μειωμένη αφθονία νηματίων ακτίνης στην κορυφή του σωλήνα γύρης. Σίγουρα,
Η δραστηριότητα αποκοπής νήματος που προκαλείται από πρωτεΐνες αποκοπής που ανταποκρίνονται στο ασβέστιο μπορεί να επιτρέψει την απομάκρυνση των νημάτων ακτίνης που προέρχονται από την κορυφαία μεμβράνη μακριά από την περιοχή της κορυφής. Αυτά τα νημάτια μπορούν στη συνέχεια να χρησιμοποιηθούν για την κατασκευή υποακρορικών δομών ακτίνης. Αυτή η ιδέα υποστηρίζεται εν μέρει από την παρατήρηση ότι η απώλεια της λειτουργίας των κακών επηρεάζει το σχηματισμό δομών ακτίνης στην υποκορυφή (Qu et al., 2013). Επιπλέον, τα νημάτια ακτίνης που προέρχονται από την ακραία κορυφαία μεμβράνη μπορούν να μετατοπιστούν προς την κορυφαία πλευρά μέσω της ροής μεμβράνης και μπορούν περαιτέρω να επιμηκυνθούν για να συμμετάσχουν άμεσα στην κατασκευή δομών ακτίνης στην υποκορυφή. Στην υποακρορριζική περιοχή, η βιλλίνη παίζει σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό κανονικών περιλαίμιων ακτίνης μέσω της δέσμευσης και της σταθεροποίησης των διαμήκως ευθυγραμμισμένων νημάτων ακτίνης (Εικόνα 3Β· Qu et al., 2013). Επιπλέον, η βιλλίνη μπορεί να διευκολύνει τον σχηματισμό κανονικών περιλαίμιων ακτίνης εξαλείφοντας τα νήματα ακτίνης που δεν ευθυγραμμίζονται κατά μήκος μέσω της δραστηριότητάς της αποκοπής νήματος (Εικόνα 3Β· Qu et al., 2013). Το MDP25 μπορεί επίσης να έχει παρόμοια λειτουργία στην αποκοπή των νημάτων ακτίνης που δεν ευθυγραμμίζονται κατά μήκος στην υποακρορριζική περιοχή (Qin et al., 2014). Επιπλέον, προηγούμενες μελέτες υποδηλώνουν ότι το ADF και το AIP1 μπορεί επίσης να εμπλέκονται στη ρύθμιση του κύκλου εργασιών των δομών ακτίνης στην υποακρορριζική περιοχή (Chen et al., 2002; Lovy-Wheeler et al., 2006). Το MDP25 μπορεί επίσης να έχει παρόμοια λειτουργία στην αποκοπή των νημάτων ακτίνης που δεν ευθυγραμμίζονται κατά μήκος στην υποακρορριζική περιοχή (Qin et al., 2014). Επιπλέον, προηγούμενες μελέτες υποδηλώνουν ότι το ADF και το AIP1 μπορεί επίσης να εμπλέκονται στη ρύθμιση του κύκλου εργασιών των δομών ακτίνης στην υποακρορριζική περιοχή (Chen et al., 2002; Lovy-Wheeler et al., 2006). Το MDP25 μπορεί επίσης να έχει παρόμοια λειτουργία στην αποκοπή των νημάτων ακτίνης που δεν ευθυγραμμίζονται κατά μήκος στην υποακρορριζική περιοχή (Qin et al., 2014). Επιπλέον, προηγούμενες μελέτες υποδηλώνουν ότι το ADF και το AIP1 μπορεί επίσης να εμπλέκονται στη ρύθμιση του κύκλου εργασιών των δομών ακτίνης στην υποακρορριζική περιοχή (Chen et al., 2002; Lovy-Wheeler et al., 2006).
Στο στέλεχος, τα νημάτια ακτίνης που δημιουργούνται από AtFH3 (Ye et al., 2009) υφίστανται αρχικά δυναμική εναλλαγή λόγω της δραστηριότητας των ADFs, όπως το ADF7 (Zheng et al., 2013), μαζί με αρκετούς συμπαράγοντες ADF, όπως ο AIP1 (Ketelaar et al., 2004a· Shi et al., 2013) και CAP1 (Chaudhry et al., 2007· Deeks et al., 2007). Στη συνέχεια, παράγοντες δέσμευσης ακτίνης, όπως κροσσοί, βιλίνες, LIMs και CROLIN1, μπορούν να συμμετέχουν στη συσκευασία αυτών των νημάτων σε διαμήκη καλώδια ακτίνης εκτός από τη διατήρηση της διαμήκους διάταξης και τη σταθεροποίησή τους (Εικόνα 3Β).
Τελικές παρατηρήσεις
Δεν υπάρχει αμφιβολία ότι οι γνώσεις μας σχετικά με την οργάνωση, τη δυναμική και τη ρύθμιση του κυτταροσκελετού της ακτίνης στον σωλήνα γύρης έχει αυξηθεί σημαντικά τα τελευταία χρόνια, αν και πολλά ζητήματα απομένουν να επιλυθούν. Είναι σημαντικό ότι η υιοθέτηση του σωλήνα γύρης A. thaliana ως κυτταρικού συστήματος για τη μελέτη αυτών των διεργασιών έχει διευκολύνει σημαντικά την πρόοδο σε αυτόν τον τομέα λόγω του ισχυρού συνδυασμού γονιδιωματικών και γενετικών προσεγγίσεων Arabidopsis, καθώς και της εισαγωγής πολύπλοκης τεχνολογίας χωροχρονικής απεικόνισης και την ανάπτυξη κατάλληλων δεικτών ακτίνης που επέτρεψαν την απεικόνιση σε πραγματικό χρόνο μεμονωμένων νημάτων ακτίνης. Οι πρόσφατες βελτιώσεις στην τεχνολογία απεικόνισης έχουν διευρύνει την άποψή μας για τη δυναμική του νήματος ακτίνης, καθώς και την κατανόησή μας για την υποκείμενη οργάνωση των δομών ακτίνης στο σωλήνα γύρης. Μια λεπτομερής περιγραφή των δυναμικών ιδιοτήτων των νημάτων ακτίνης στην κορυφαία περιοχή αντιπροσωπεύει ένα από τα συναρπαστικά επιτεύγματα που προκύπτουν από αυτές τις τεχνολογίες (Qu et al., 2013) και αυτά τα δεδομένα έχουν βελτιώσει σημαντικά την κατανόησή μας για τη λειτουργία του κυτταροσκελετού της ακτίνης στη ρύθμιση πολωμένη ανάπτυξη σωλήνων γύρης. Ο προσεκτικός χαρακτηρισμός του τρόπου δράσης αρκετών ABP που εκφράζονται με γύρη έχει παράσχει πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με τη ρύθμιση του κυτταροσκελετού της ακτίνης κατά την ανάπτυξη του σωλήνα γύρης. Καθώς ορισμένα ABP λειτουργούν ως άμεσοι αισθητήρες για διάφορα σήματα, αυτές οι μελέτες έχουν επίσης ρίξει φως στο πώς διάφορα σήματα συγκλίνουν σε αυτά τα ABP για τον έλεγχο της δυναμικής της ακτίνης. Για παράδειγμα, το Ca και αυτά τα δεδομένα έχουν ενισχύσει σημαντικά την κατανόησή μας για τη λειτουργία του κυτταροσκελετού της ακτίνης στη ρύθμιση της ανάπτυξης του πολωμένου σωλήνα γύρης. Ο προσεκτικός χαρακτηρισμός του τρόπου δράσης αρκετών ABP που εκφράζονται με γύρη έχει παράσχει πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με τη ρύθμιση του κυτταροσκελετού της ακτίνης κατά την ανάπτυξη του σωλήνα γύρης. Καθώς ορισμένα ABP λειτουργούν ως άμεσοι αισθητήρες για διάφορα σήματα, αυτές οι μελέτες έχουν επίσης ρίξει φως στο πώς διάφορα σήματα συγκλίνουν σε αυτά τα ABP για τον έλεγχο της δυναμικής της ακτίνης. Για παράδειγμα, το Ca και αυτά τα δεδομένα έχουν ενισχύσει σημαντικά την κατανόησή μας για τη λειτουργία του κυτταροσκελετού της ακτίνης στη ρύθμιση της ανάπτυξης του πολωμένου σωλήνα γύρης. Ο προσεκτικός χαρακτηρισμός του τρόπου δράσης αρκετών ABP που εκφράζονται με γύρη έχει παράσχει πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με τη ρύθμιση του κυτταροσκελετού της ακτίνης κατά την ανάπτυξη του σωλήνα γύρης. Καθώς ορισμένα ABP λειτουργούν ως άμεσοι αισθητήρες για διάφορα σήματα, αυτές οι μελέτες έχουν επίσης ρίξει φως στο πώς διάφορα σήματα συγκλίνουν σε αυτά τα ABP για τον έλεγχο της δυναμικής της ακτίνης. Για παράδειγμα, το Ca Καθώς ορισμένα ABP λειτουργούν ως άμεσοι αισθητήρες για διάφορα σήματα, αυτές οι μελέτες έχουν επίσης ρίξει φως στο πώς διάφορα σήματα συγκλίνουν σε αυτά τα ABP για τον έλεγχο της δυναμικής της ακτίνης. Για παράδειγμα, το Ca Καθώς ορισμένα ABP λειτουργούν ως άμεσοι αισθητήρες για διάφορα σήματα, αυτές οι μελέτες έχουν επίσης ρίξει φως στο πώς διάφορα σήματα συγκλίνουν σε αυτά τα ABP για τον έλεγχο της δυναμικής της ακτίνης. Για παράδειγμα, το CaΗ σηματοδότηση 2 έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει τη δυναμική της ακτίνης ελέγχοντας τη δραστηριότητα των κακοποιών στο σωλήνα γύρης. Μια σημαντική μελλοντική πρόκληση θα είναι η οριοθέτηση των ρόλων των διαφόρων μονοπατιών μεταγωγής σηματοδότησης προκειμένου να προσδιοριστεί πώς συγκλίνουν διάφορα σήματα στα ABP για να ρυθμίσουν τη δυναμική της ακτίνης στον σωλήνα γύρης. Σίγουρα, σε αυτό το πεδίο, το αιώνιο και πιο δύσκολο ερώτημα είναι να κατανοήσουμε ακριβώς πώς λειτουργεί ο κυτταροσκελετός της ακτίνης για να ρυθμίζει την ανάπτυξη του σωλήνα γύρης.
Δήλωση Σύγκρουσης Συμφερόντων
Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη απουσία εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.
Ευχαριστίες
Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε με επιχορηγήσεις από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας (2013CB945100 και 2011CB944600) και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (31125004).
Ακτίνη, σωλήνας γύρης, πρωτεΐνη δέσμευσης ακτίνης, φορμίνη, Villin, adf, fimbrin