Παραγωγή Θηλυκοποιημένων Σπόρων Cannabis sativa L. με υψηλή περιεκτικότητα σε CBD με χειραγώγηση της σεξουαλικής έκφρασης και την εφαρμογή της στην αναπαραγωγή
- Τμήμα Γεωπονίας, Βιοτεχνική Σχολή, Πανεπιστήμιο της Λιουμπλιάνας, Λιουμπλιάνα, Σλοβενία
Η χρήση του φυτού κάνναβης ως πηγής θεραπευτικών ενώσεων αποκτά μεγάλη σημασία αφού οι περιορισμοί στην ανάπτυξη και χρήση του μειώνονται σταδιακά σε όλο τον κόσμο. Η εντατικοποίηση της παραγωγής ιατρικής (τύπου φαρμάκου) κάνναβης τόνωσε τις δραστηριότητες αναπαραγωγής με στόχο την ανάπτυξη νέων, βελτιωμένων ποικιλιών με επακριβώς καθορισμένα και σταθερά προφίλ κανναβινοειδών. Οι επιδράσεις πολλών εξωγενών ουσιών, που είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στις εκφράσεις του φύλου, όπως ο θειοθειικός άργυρος (STS), το γιβερελικό οξύ (GA) και ο κολλοειδής άργυρος, αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Δοκιμάστηκαν διάφορες συγκεντρώσεις σε 23 διαφορετικές θεραπείες σε δύο πληθυσμούς αναπαραγωγής με υψηλή περιεκτικότητα σε κανναβιδιόλη (CBD). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ο ψεκασμός ολόκληρων φυτών με STS μία φορά είναι πιο αποτελεσματικός από την εφαρμογή STS στις άκρες των βλαστών ενώ ψεκάζετε φυτά με 0. Το 01% GA και η εντατική κοπή είναι αναποτελεσματική στην τόνωση της παραγωγής αρσενικών λουλουδιών. Επιπλέον, ο ψεκασμός ολόκληρων φυτών με κολλοειδές ασήμι αποδείχθηκε επίσης αποτελεσματικός στην επαγωγή αρσενικών λουλουδιών σε θηλυκά φυτά, καθώς παρήγαγε έως και 379 αρσενικά άνθη ανά φυτό. Η βιωσιμότητα και η γονιμότητα των επαγόμενων αρσενικών λουλουδιών επιβεβαιώθηκαν με χρώση κόκκων γύρης με διοξική φλουορεσκεΐνη (FDA), in vitro και in vivo δοκιμές βλάστησης γύρης, μέτρηση του αριθμού των σπόρων που αναπτύχθηκαν μετά τον υβριδισμό και αξιολόγηση των ρυθμών βλάστησης των αναπτυγμένων σπόρων. Τέλος, εφαρμόστηκε ένα καθιερωμένο πρωτόκολλο για τη διασταύρωση επιλεγμένων θηλυκών φυτών. Το προφίλ κανναβινοειδών των απογόνων συγκρίθηκε με το προφίλ του γονικού πληθυσμού και επιβεβαιώθηκε μια βελτίωση στο βιοχημικό προφίλ του πληθυσμού αναπαραγωγής. Οι απόγονοι είχαν υψηλότερη και πιο ομοιόμορφη αναλογία ολικής CBD (tCBD) προς ολική τετραϋδροκανναβινόλη (tTHC) (έως 29,6, μέσος όρος 21,33 ± 0,39) σε σύγκριση με τον αρχικό πληθυσμό (έως 18,8, μέσος όρος 7,83 ± 1,03). Αυτή είναι η πρώτη ολοκληρωμένη έκθεση για την επαγωγή γόνιμων αρσενικών λουλουδιών σε θηλυκά φυτά από δίοικη ιατρική κάνναβη (Cannabis sativa L.).
Εισαγωγή
Η κάνναβη (Cannabis sativa L.) εμφανίζει φυσικά σεξουαλικό διμορφισμό με ένα μικρό ποσοστό μονοοικισμού. Στο παρελθόν, καλλιεργούνταν ως επί το πλείστον για φυτικές ίνες και δημητριακά, αλλά στις μέρες μας, το φυτό αποκτά σημασία στη φαρμακευτική βιομηχανία λόγω της παραγωγής μοναδικών κανναβινοειδών (Andre et al., 2016). Παράγονται στα τρίχωμα σε βράκτια ανθέων θηλυκών ταξιανθιών (Small, 2015; Andre et al., 2016). Τα περισσότερα φαρμακευτικά σημαντικά κανναβινοειδή είναι η κανναβιδιόλη (CBD) και η ψυχοδραστική τετραϋδροκανναβινόλη (THC) (Δ-9-THC) (Freeman et al., 2019). Η σχετική περιεκτικότητα (σε % του ξηρού βάρους) της τελευταίας χωρίζει τους γονότυπους κάνναβης σε δύο ομάδες: (i) βιομηχανική κάνναβη, κοινώς γνωστή ως κάνναβη ή κάνναβη τύπου ινών (που ορίζεται ότι περιέχει lt; 0,2% THC κατά ξηρό βάρος στην Ευρώπη) και που καλλιεργείται συνήθως ως καλλιέργεια αγρού και (ii) ιατρική κάνναβη,
Το φύλο του C. sativa L. (2n = 20) προσδιορίζεται γενετικά από ένα ζεύγος φυλετικών χρωμοσωμάτων X και Y, όπου το αρσενικό φύλο των διοικογενών φυτών καθορίζεται από ετερογαματικά χρωμοσώματα XY, ενώ τα δίοικα θηλυκά και μονόοικα ή ερμαφρόδιτα φυτά εμφανίζουν ομοιογαμητικό ΧΧ (Moliterni et al., 2004; van Bakel et al., 2011; Divashuk et al., 2014; Faux et al., 2014). Η αναλογία θηλυκών προς αρσενικά άνθη σε ένα μόνο μονόοικο φυτό κάνναβης είναι εξαιρετικά μεταβλητή και κυμαίνεται από κυρίως αρσενικά άνθη έως κυρίως θηλυκά άνθη (Faux et al., 2014). Επιπλέον, τα δίοικα φυτά κάνναβης μπορούν να παράγουν άνθη του αντίθετου φύλου όπως προσδιορίζεται από τα φυλετικά τους χρωμοσώματα (Moliterni et al., 2004). Λόγω της αστάθειας των σεξουαλικών φαινοτύπων μεταξύ των γενεών XX φυτών και της ποσοτικής φύσης της σεξουαλικής έκφρασης, υποτέθηκε ότι η σεξουαλική έκφραση είναι ένα πολυγονιδιακό χαρακτηριστικό (Faux et al., 2013, 2014; Faux and Bertin, 2014). Μια πρώτη μελέτη χαρτογράφησης συσχέτισης του προσδιορισμού του φύλου πραγματοποιήθηκε το 2016 (Faux et al., 2016) σε τρεις διγονικούς πληθυσμούς κάνναβης (δύο δίοικους και έναν μονόοικο) χρησιμοποιώντας 71 ενισχυμένους δείκτες πολυμορφισμού μήκους θραύσματος (AFLP). Προσδιόρισε πέντε ποσοτικούς τόπους χαρακτηριστικών (QTLs) που σχετίζονται με εκφράσεις φύλου που υποτίθεται ότι βρίσκονταν σε φυλετικά χρωμοσώματα. Πρόσφατα, ο Petit και οι συνεργάτες του (Petit et al., 2020) δημοσίευσαν τα αποτελέσματα μιας ανάλυσης GWAS (Genome-Wide Association Study) για τον χαρακτηρισμό της γενετικής αρχιτεκτονικής που στηρίζει τον προσδιορισμό του φύλου στην κάνναβη. Χρησιμοποίησαν ένα σύνολο δεικτών πολυμορφισμού μονονουκλεοτιδίου (SNP) 600 K σε ένα πάνελ 123 προσαρτήσεων κάνναβης (μονοοικογενείς και δίοικες), έχει δοκιμαστεί σε τρία περιβάλλοντα αντίθεσης σε όλη την Ευρώπη με συστήματα φωτοπεριόδου αντίθεσης. Εντόπισαν δύο QTL για τον προσδιορισμό του φύλου σε τοποθεσίες που περιείχαν μεταγραφικούς παράγοντες και γονίδια που εμπλέκονται στη ρύθμιση της ισορροπίας των φυτοορμονών, ιδιαίτερα των αυξινών και του γιβερελικού οξέος (GA). Δύο γονίδια παράγοντα απόκρισης αυξίνης (arf2 και arf5), bZIP μεταγραφικού παράγοντα 16-όπως και γονίδιο μη ευαίσθητο στο γιβερελικό οξύ (GAI) που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη τύπου DELLA RGL1 (καταστολέας του γιβερελικού οξέος) ταυτοποιήθηκαν στο QTLSex_det1 για προσδιορισμό φύλου . Αυτά τα γονίδια εμπλέκονται στην ισορροπία των φυτοορμονών αυξινών και του γιβερελικού οξέος (GA), τα οποία είναι γνωστό ότι παίζουν ενεργό ρόλο στην έκφραση του φύλου (αρσενικό ή θηλυκό) σε πολλές καλλιέργειες, όπως η κάνναβη ή το σπανάκι.
Τα ευρήματα επιβεβαίωσαν προηγούμενες αναφορές ότι αρκετοί παράγοντες, όπως γονίδια που καθορίζουν το φύλο, φυλετικά χρωμοσώματα, επιγενετικός έλεγχος με μεθυλίωση DNA και microRNA, και φυσιολογική ρύθμιση με φυτοορμόνες επηρεάζουν τη σεξουαλική έκφραση των προκαθορισμένων φυτών κάνναβης (Galoch, 1978; Dellaporta and Calderon-Urrea, 1993· Hall et al., 2012· Punja and Holmes, 2020). Αρκετές μελέτες με ορμονική χειραγώγηση επιβεβαίωσαν την αντιστροφή του φύλου στο C. sativa L. και απέδειξαν τη διδύναμη των σεξουαλικά προκαθορισμένων διοικίων φυτών κάνναβης. Έχει αποδειχθεί ότι οι γιββερελλίνες προκαλούν αρρενωπότητα στα φυτά, ενώ το αιθυλένιο, οι κυτοκινίνες και οι αυξίνες διεγείρουν το σχηματισμό θηλυκών ανθέων σε γενετικά αρσενικά φυτά (Ainsworth, 2000). Ο Galoch (1978) έδειξε ότι η ινδόλη-3-οξικό οξύ (IAA), η κινετίνη (έως 100 μg/φυτό), και η ένωση απελευθέρωσης αιθυλενίου εθρέλης (έως 500 μg/φυτό) ενίσχυσαν τη θηλυκοποίηση των αρσενικών φυτών. Το αψισικό οξύ (ΑΒΑ) ήταν εντελώς αναποτελεσματικό στη φυλή τόσο της αρσενικής όσο και της θηλυκής κάνναβης όταν χρησιμοποιήθηκε μόνο του. Το GA3 (έως 100 μg/φυτό) προώθησε τον αρρενωπισμό των θηλυκών φυτών, ενώ δεν είχε καμία επίδραση στην αλλαγή φύλου στα αρσενικά φυτά. Ομοίως, οι Ram και Jaiswal (1972) ανακάλυψαν νωρίτερα ότι τα αρσενικά φυτά δεν παρουσίασαν καμία αλλαγή στην έκφραση του φύλου όταν υποβλήθηκαν σε θεραπεία με γιβερελλίνες (έως 100 μg/φυτό), αλλά τα θηλυκά φυτά ανέπτυξαν αρσενικά άνθη με κανονικούς στήμονες και βιώσιμους κόκκους γύρης. Επιπλέον, περιβαλλοντικοί παράγοντες όπως η θερμοκρασία, η φωτοπερίοδος, οι συνθήκες φωτός, η έλλειψη θρεπτικών συστατικών και οι μηχανικές καταπονήσεις (π.χ. βλάβες) μπορούν να επηρεάσουν την έκφραση του φύλου και να προκαλέσουν μονοοικισμό (Ram and Sett, 1979). Όπως ανασκοπείται στους Truta et al. (2007) και Petit et al. (2020), η αναλογία διαφορετικών φυτοορμονών παίζει καθοριστικό ρόλο στη σεξουαλική έκφραση της κάνναβης. Η εξωτερική επεξεργασία του GA στο σπανάκι, για παράδειγμα, επηρεάζει την έκφραση του γονιδίου GAI, το οποίο είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας της οικογένειας DELLA. Εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στις θηλυκές ταξιανθίες και δρα ως καταστολέας της έκφρασης ομοιογενών γονιδίων κατηγορίας Β, που είναι παράγοντες αρρενωπότητας. Τα γονίδια της κατηγορίας Β διεγείρουν το σχηματισμό αρσενικών οργάνων και ταυτόχρονα καταστέλλουν την ανάπτυξη θηλυκών οργάνων στα άνθη (Petit et al., 2020). που είναι αρρενωτικοί παράγοντες. Τα γονίδια της κατηγορίας Β διεγείρουν το σχηματισμό αρσενικών οργάνων και ταυτόχρονα καταστέλλουν την ανάπτυξη θηλυκών οργάνων στα άνθη (Petit et al., 2020). που είναι αρρενωτικοί παράγοντες. Τα γονίδια της κατηγορίας Β διεγείρουν το σχηματισμό αρσενικών οργάνων και ταυτόχρονα καταστέλλουν την ανάπτυξη θηλυκών οργάνων στα άνθη (Petit et al., 2020).
Ο προσδιορισμός του φύλου της κάνναβης θα μπορούσε να τροποποιηθεί με την εφαρμογή εξωγενών ρυθμιστών ανάπτυξης ή χημικών ουσιών, οι οποίες μπορούν να επηρεάσουν την αναλογία των ενδογενών ορμονών και ως εκ τούτου τη συχνότητα εμφάνισης των γεννητικών οργάνων (Truta et al., 2007). Ενώσεις αργύρου όπως ο νιτρικός άργυρος (AgNO3) ή ο θειοθειικός άργυρος (Ag2S2O3; STS) έχει βρεθεί ότι έχουν αρσενικές επιδράσεις σε πολλά είδη φυτών, π.χ. στα Coccinia grandis (Devani et al., 2017), Cucumis sativus (Den Nijs and Visser). , 1980), Silene latifolia (Law et al., 2002), Cucumis melo (Owens et al., 1980), και επίσης Cannabis sativa. Οι Ram και Sett (1982) εφάρμοσαν 50, 100 και 150 μg νιτρικού αργύρου και 25, 50 και 100 μg STS για να εκτοξεύσουν τις άκρες των θηλυκών φυτών κάνναβης. Και οι δύο ενώσεις αργύρου προκάλεσαν με επιτυχία το σχηματισμό αρσενικών λουλουδιών, αλλά το STS ήταν πιο αποτελεσματικό από το AgNO3. 100 μg STS προκάλεσαν τον υψηλότερο αριθμό πλήρως αλλοιωμένων αρσενικών λουλουδιών, ο οποίος ήταν σημαντικά υψηλότερος από τον αριθμό των μειωμένων αρσενικών, διαφυλικών και θηλυκών λουλουδιών. Από την άλλη πλευρά, η επεξεργασία του άκρου του βλαστού με 100 μg AgNO3 είχε ως αποτέλεσμα περισσότερο από το μισό χαμηλότερο αριθμό αρσενικών λουλουδιών, με την υψηλότερη ποσότητα AgNO3 (150 μg) να είναι αναποτελεσματική στην αλλαγή της έκφρασης του φύλου. Επιπλέον, η γύρη από όλα τα αρσενικά άνθη που προκλήθηκαν ήταν βιώσιμη in vitro και επίσης προκάλεσε επιτυχώς το σύνολο των σπόρων. Οι Lubell και Brand (2018) δημοσίευσαν τα αποτελέσματα της χρήσης STS 3 και 0,3 mM για την πρόκληση αρσενικών λουλουδιών σε γενετικά θηλυκά φυτά κάνναβης τεσσάρων στελεχών. Ψέκασαν τρεις φορές σε μεσοδιαστήματα 7 ημερών και μέτρησαν τα άνθη (αρσενικά και θηλυκά) σε τερματικούς οφθαλμούς, όχι ολόκληρα φυτά. Προσδιόρισαν το ποσοστό των αρσενικών λουλουδιών σε όλα τα λουλούδια και το ποσοστό αρρενωποποίησης. Οι συγγραφείς επιβεβαίωσαν την επιτυχή επαγωγή αρσενικών λουλουδιών σε στελέχη κάνναβης. Όσον αφορά το ποσοστό των ταξιανθιών με αρσενικά άνθη, τα δύο καλύτερα στελέχη κάνναβης απέδωσαν έως και ≈15% χωρίς αρσενικές ταξιανθίες, ανεξάρτητα από τη συγκέντρωση STS που χρησιμοποιήθηκε. Στα βιβλία των Green (2005) και Rosenthal (2010), οι συγγραφείς προτείνουν μια μέθοδο για την παρασκευή 0,3 mM STS και τον ψεκασμό ολόκληρου του θηλυκού φυτού μέχρι το διάλυμα να στάζει από το φυτό. Δεν υπάρχουν ποσοτικές αποδείξεις για την επιτυχία της μεθόδου που χρησιμοποιήθηκε. Πιο πρόσφατα, δύο άλλες μελέτες χρησιμοποίησαν επίσης με επιτυχία STS για να προκαλέσουν αρσενικά άνθη: DiMatteo et al. (2020) ψέκασε 3 mM STS μέχρι την απορροή τρεις φορές σε διαστήματα 7 ημερών μετά την έκθεση των φυτών σε συνθήκες σύντομης ημέρας για 12 ώρες. Οι Adal et al. (2021) εφάρμοσε 20 ml STS (2. 5 μg/ml) σε ολόκληρα φυτά την πρώτη και τρίτη ημέρα μετά την έναρξη του 12ωρου φωτισμού και λίπανσης σε διαφυλλική βάση. Ωστόσο, αυτές οι μελέτες στόχευαν στη διερεύνηση ορισμένων άλλων πτυχών της πρόκλησης ανδρικού φύλου στην κάνναβη αντί για τη θέσπιση του πρωτοκόλλου πρόκλησης φύλου, επομένως δεν παρουσιάστηκαν λεπτομερή δεδομένα σχετικά με την επιτυχία της αντιστροφής του φύλου. Από όσο γνωρίζουμε, καμία επιστημονική μελέτη δεν έχει χρησιμοποιήσει κολλοειδές ασήμι για αντιστροφή φύλου στην κάνναβη και όχι σε άλλα είδη φυτών. Ωστόσο, αυτή η μέθοδος είναι πολύ γνωστή στη βιομηχανία κάνναβης και πολλές πληροφορίες είναι διαθέσιμες στο διαδίκτυο. Αρκετές άλλες χημικές ουσίες έχουν δείξει αλλοίωση της σεξουαλικής έκφρασης της κάνναβης, π.χ. θηλυκά φυτά που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 75 μg αμινοαιθοξυβινυλογλυκίνης σχημάτισαν μόνο αρσενικά και όχι διαφυλικά άνθη (Ram and Sett, 1981). Ο διαφυλλικός ψεκασμός αρσενικών φυτών κάνναβης με 960 ppm 2-χλωροαιθανοφωσφονικό οξύ προκάλεσε τον υψηλότερο σχηματισμό του γόνιμου θηλυκού άνθους (Ram and Jaiswal, 1970). Συνολικά 100 μg/φυτό χλωριούχου κοβαλτίου που εφαρμόζονται στην άκρη του βλαστού πυροδοτούν την έκφραση του αρσενικού φύλου στα θηλυκά φυτά της κάνναβης (Ram and Sett, 1979). Ο τρόπος δράσης αυτών των χημικών ουσιών στα φυτά δεν έχει ακόμη αποκρυπτογραφηθεί πλήρως. Οι Truta et al. (2007) υπέθεσαν ότι αυτοί οι εξωτερικοί παράγοντες πιθανώς επηρεάζουν έμμεσα το επίπεδο των ενδογενών αυξινών, οι οποίες έχουν ρυθμιστικό ρόλο στους παράγοντες που ελέγχουν τη διαφοροποίηση των σεξουαλικών οργάνων. Οι συγγραφείς κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι τα γονίδια προσδιορισμού του φύλου εξισορροπούν τα ενδογενή ορμονικά επίπεδα μέσω του μηχανισμού μεταγωγής σήματος και έτσι επιτρέπουν την αναστροφή φύλου σε σεξουαλικά διδύναμα floral primordia. Μια ολοκληρωμένη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης κατά την ανάπτυξη των λουλουδιών στην κάνναβη δημοσιεύτηκε πρόσφατα από τους Adal et al. (2021), ο οποίος ανακάλυψε περίπου 200 γονίδια που δυνητικά εμπλέκονται στην παραγωγή αρσενικών λουλουδιών σε θηλυκά φυτά. Αν και ο ακριβής ρόλος όλων αυτών των γονιδίων δεν εξετάστηκε περαιτέρω, η μελέτη άνοιξε πολλές δυνατότητες για περαιτέρω μελέτες του γενετικού υποβάθρου της σεξουαλικής έκφρασης στην κάνναβη.
Ο χειρισμός της σεξουαλικής έκφρασης είναι υψίστης σημασίας για την αναπαραγωγή ιατρικής κάνναβης, καθώς μόνο γενετικά και φαινοτυπικά θηλυκά φυτά χρησιμοποιούνται στην εμπορική καλλιέργεια. Επιτρέπει την αυτο-γονιμοποίηση και τη διασταύρωση θηλυκών φυτών για τη λήψη καθαρών γραμμών και θηλυκοποιημένων σπόρων, αντίστοιχα (Ram and Sett, 1982). Κατά τη βλάστηση, τα τελευταία παράγουν εξ ολοκλήρου θηλυκούς απογόνους που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή θηλυκών λουλουδιών. Οι περισσότερες μελέτες χειραγώγησης φύλου στην κάνναβη πραγματοποιούνται σε κάνναβη τύπου ίνας (Ram and Sett, 1982; Lubell and Brand, 2018; DiMatteo et al., 2020) και γνώση σχετικά με την αποτελεσματικότητα διαφόρων εξωγενών παραγόντων και μεθόδων εφαρμογής για την πρόκληση μετατροπής φύλου σε χρειάζεται ιατρική κάνναβη.
Ο στόχος της έρευνάς μας ήταν να δοκιμάσουμε διαφορετικές μεθόδους χειραγώγησης φύλου (χημικές, ορμονικές και φυσιολογικές) για την επαγωγή αρσενικών λουλουδιών σε θηλυκά φυτά ιατρικής κάνναβης και να αξιολογήσουμε την αποτελεσματικότητά τους με βάση τον αριθμό των αρσενικών ταξιανθιών και των αρσενικών λουλουδιών, με αξιολόγηση βιωσιμότητα γύρης, δυνατότητα βλάστησης in vitro και in vivo και σύνολο σπόρων. Επιπλέον, η επιλεγμένη θεραπεία εφαρμόστηκε σε ένα πρόγραμμα αναπαραγωγής για τη διασταύρωση πληθυσμού θηλυκών φυτών με υψηλό πληθυσμό αναπαραγωγής CBD ιατρικής κάνναβης για να επαληθευτεί η χρησιμότητα τέτοιων θεραπειών στη βιομηχανία ιατρικής κάνναβης υψηλής αξίας.
Υλικά και μέθοδοι
Φυτικό Υλικό και Συνθήκες Καλλιέργειας
Το πείραμα διεξήχθη χρησιμοποιώντας φυτά δύο αναπαραγωγικών πληθυσμών ιατρικής κάνναβης, συγκεκριμένα των MX-CBD-11 και MX-CBD-707, που ανήκουν στην MGC Pharmaceuticals Ltd. και περιγράφονται στους Mestinšek Mubi et al. (2020). Αναπτύχθηκαν ως μέρος ενός κοινού ερευνητικού προγράμματος μεταξύ της Βιοτεχνικής Σχολής του Πανεπιστημίου της Λιουμπλιάνα και της MGC Pharmaceuticals με άδεια του Υπουργείου Υγείας της Σλοβενίας.
Τα μητρικά φυτά (48 διαφορετικοί γονότυποι του MX-CBD-707 και 31 διαφορετικοί γονότυποι του MX-CBD-11) αναπτύχθηκαν από θηλυκοποιημένους σπόρους. Τα ριζωμένα μοσχεύματα έγιναν από πλευρικούς βλαστούς μητρικών φυτών. Όλα τα φυτά αναπτύχθηκαν σε γλάστρες των 3,5 L (υπόστρωμα Kekkila, Φινλανδία) σε θάλαμο ανάπτυξης σταδίου σε θερμοκρασία 24–26°C και 16/8 φωτός/σκότους. Το φως εξασφαλίστηκε με τη χρήση λαμπτήρων νατρίου υψηλής πίεσης (HPS) 600 W (Phantom HPS 600W; Hydrofarm, Petaluma, CA, Ηνωμένες Πολιτείες). Στο βλαστικό στάδιο, τα φυτά γονιμοποιήθηκαν με μείγμα φυτικού λιπάσματος (NPK 4-1-2) και CalMag (N-Ca-Mg 2-5-2,5) μικροστοιχεία σε αναλογία 1:1. Μετά από 31 (Πείραμα 1) ή 60 (Πείραμα 2) ημέρες βλαστικής ανάπτυξης, τα φυτά γονιμοποιήθηκαν με ένα μείγμα λιπάσματος ανθοφορίας (NPK 1-3-5) και CalMag (N-Ca-Mg 2-5-2,5) μικροστοιχεία σε 1:
Σχεδιασμός και εκτέλεση των πειραμάτων
Στο πρώτο πείραμα, εφαρμόστηκαν οκτώ διαφορετικές αγωγές χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικούς ρυθμιστές ανάπτυξης σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και τρόπους εφαρμογής, μαζί με μία φυσιολογική επεξεργασία (κόψιμο) και έλεγχο (χωρίς εφαρμογή) (Πίνακας 1). Οι συγκεντρώσεις (ποσότητες) των STS και GA επιλέχθηκαν με βάση τα δεδομένα της βιβλιογραφίας (Ram and Sett, 1982; Green, 2005; Rosenthal, 2010) και η παραλλαγή “cut” βασίστηκε στις συστάσεις των καλλιεργητών. Το πείραμα σχεδιάστηκε ως τυχαιοποιημένο σχέδιο πλήρους μπλοκ με δύο παράγοντες: επτά θεραπείες αρσενικής επαγωγής και έλεγχος σε δύο πληθυσμούς αναπαραγωγής, με έξι επαναλήψεις (φυτά σε γλάστρες) για κάθε συνδυασμό παραγόντων.
Πίνακας 1. Θεραπείες του πρώτου πειράματος επαγωγής αρσενικών ανθέων σε θηλυκά φυτά Cannabis sativa.
Ένα σύνολο 20 mM STS παρασκευάστηκε με ανάμιξη 0,1 Μ AgNO3 και 0,1 Μ Na2S2O3 σε μοριακή αναλογία 1:4. 0,7 mM STS παρασκευάστηκε με 30χ αραίωση 20 mM STS με νερό. Το GA3 (Duchefa) διαλύθηκε σε διπλά απεσταγμένο νερό και εφαρμόστηκε σε συγκέντρωση 0,01%. Ο ψεκασμός με STS ή GA3 (θεραπείες 1, 2 και 6) πραγματοποιήθηκε μία φορά στην αρχή του πειράματος μέχρι την απορροή. Για τις θεραπείες 3, 4 και 5, 10 μl μητρικών διαλυμάτων STS (1, 2 και 3 μg/μl, αντίστοιχα) εφαρμόστηκαν για πέντε διαδοχικές ημέρες στην κορυφή του βλαστού μέχρι να επιτευχθούν οι τελικές ποσότητες STS (50, 100 , και 150 μg STS, αντίστοιχα) (Εικόνα 1Α). Για την επεξεργασία 7, τα φυτά κόπηκαν στο ύψος των δύο πρώτων κόμβων. Τα φυτά από την όγδοη θεραπεία αντιπροσώπευαν μια ομάδα ελέγχου και δεν πραγματοποιήθηκε καμία θεραπεία. Όταν εφαρμόστηκαν οι θεραπείες και ξεκίνησε το πείραμα,
Εικόνα 1. Η επαγωγή αρσενικών λουλουδιών σε θηλυκά φυτά ιατρικής κάνναβης. (Α) Εφαρμογή θειοθειικού αργύρου (STS) στην άκρη του βλαστού. (Β) Κίτρινες κηλίδες στα φύλλα 1 εβδομάδα μετά τον ψεκασμό με 20 mM STS. (Γ) Αρσενική ταξιανθία σε πλήρη ανθοφορία. (Δ) In vivo βλάστηση της γύρης. (Ε) Βλάστηση in vitro της γύρης. (ΣΤ) Η εμφάνιση αρσενικών λουλουδιών σε θηλυκά φυτά αναπαραγωγικού πληθυσμού MX-CBD-707 μετά από ψεκασμό με κολλοειδές άργυρο 30 ppm κάθε μέρα. (Ζ) Βιώσιμη γύρη χρωματισμένη με διοξική φλουορεσκεΐνη (FDA). (Η) Ανάπτυξη σπόρων μετά την επικονίαση ενός φυτού ελέγχου.
Στο δεύτερο πείραμα (Πίνακας 2), 45 φυτά αναπαραγωγικού πληθυσμού MX-CBD-707 υποβλήθηκαν σε αγωγή για επαγωγή αρσενικού φύλου. Μετά από 60 ημέρες βλαστικής ανάπτυξης, εκτέθηκαν για πρώτη φορά σε τρία διαφορετικά καθεστώτα φωτισμού (εφεξής «προεπεξεργασίες», 15 φυτά ανά προεπεξεργασία), που ακολουθήθηκαν από τέσσερις διαφορετικές επεξεργασίες: ψεκασμός ολόκληρων φυτών με STS (Green, 2005). ψεκασμός ολόκληρων φυτών με κολλοειδές ασήμι μία φορά ή κάθε μέρα μέχρι την άνθηση (σύσταση του καλλιεργητή) και έλεγχος (μη επεξεργασμένα φυτά).
Πίνακας 2. Συνδυασμοί προεπεξεργασιών, θεραπειών και φωτοπεριόδων ανάπτυξης που χρησιμοποιήθηκαν στο δεύτερο πείραμα επαγωγής αρσενικών ανθέων.
Μετά την εφαρμογή διαλυμάτων αργύρου, τα φυτά από όλους σχεδόν τους συνδυασμούς προεπεξεργασίας και επεξεργασίας εκτέθηκαν σε καθεστώς φωτός/σκότους 12/12 για να προκληθεί άνθηση. Μετά την εφαρμογή 0,3 mM STS σε ολόκληρα φυτά, δοκιμάστηκε μια φωτοπερίοδος που προκαλεί στρες με 96 ώρες φως και 72 ώρες σκοτάδι και συγκρίθηκε με τα αποτελέσματα της ίδιας θεραπείας STS ακολουθούμενη από μια κανονική φωτοπερίοδο 12 ωρών.
Μετρήσεις Μεταβλητών Απόκρισης
Στο πρώτο πείραμα αναλύθηκαν πέντε διαφορετικές μεταβλητές απόκρισης, και συγκεκριμένα:
(1) Ύψος φυτού.
(2) Ένας αριθμός κόμβων ανά φυτό, που εκφράζονται και οι δύο ως αναλογία μεταξύ της τελικής κατάστασης (μέτρηση/μέτρηση στο τέλος του πειράματος) και της αρχικής κατάστασης (μετράται στην αρχή του πειράματος πριν από τις (προ)επεξεργασίες). Με αυτόν τον τρόπο λήφθηκε υπόψη όχι μόνο η τελική μορφολογία των φυτών, αλλά και η αρχική κατάσταση των φυτών.
(3) Αριθμός όλων των ταξιανθιών ανά φυτό.
(4) Ο αριθμός των ταξιανθιών με ένα αρσενικό άνθος ή περισσότερα ανά φυτό.
(5) Ο αριθμός των αρσενικών λουλουδιών ανά φυτό. Οι μεταβλητές μετρήθηκαν 31 ημέρες μετά την έναρξη του πειράματος.
Στο δεύτερο πείραμα, ο αριθμός των αρσενικών λουλουδιών στον αναπαραγωγικό πληθυσμό MX-CBD-707 μετρήθηκε 37 ημέρες μετά την έναρξη του πειράματος.
Βιωσιμότητα και βλάστηση της γύρης
Πραγματοποιήθηκαν αρκετές δοκιμές για να επαληθευτεί η βιωσιμότητα της γύρης που αναπτύχθηκε σε αρσενικά άνθη που προκλήθηκαν. Η γύρη χρωματίστηκε με FDA σε τελική συγκέντρωση 1 μg/ml και αναλύθηκε σε μικροσκόπιο επι-φθορισμού (Nikon Eclipse 80i) με σετ φίλτρων για την ανίχνευση πράσινου φθορισμού. Η βλάστηση της γύρης δοκιμάστηκε αρχικά in vitro σε στερεοποιημένο φυτικό μέσο αποτελούμενο από 170 g/l σακχαρόζη, 0,1 g/l H3BO3, 0,432 g/l Ca(NO3)2 ∗4Η2Ο και ρΗ 7,0. Τα τρυβλία Petri επωάστηκαν στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες και τα αποτελέσματα ανιχνεύθηκαν στο μικροσκόπιο. Περαιτέρω, η in vivo βλάστηση της γύρης δοκιμάστηκε με επικονίαση θηλυκών λουλουδιών ελέγχου, μη επεξεργασμένων, και φυτών. Τα στίγματα των επικονιασμένων θηλυκών λουλουδιών συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες, χρωματίστηκαν με 1% μπλε ανιλίνης σε 0,1 N Na3PO4, όπως περιγράφεται από τους Murovec και Bohanec (2013), και αναλύθηκαν στο μικροσκόπιο επι-φθορισμού με σετ φίλτρων για την ανίχνευση του μπλε φθορισμού . Τέλος, η γύρη από ορισμένες από τις θεραπείες χρησιμοποιήθηκε για την επικονίαση θηλυκών φυτών ελέγχου και ο αριθμός των αναπτυσσόμενων σπόρων μετρήθηκε 2 εβδομάδες μετά την επικονίαση.
Στατιστική ανάλυση
Και τα δύο πειράματα επαγωγής φύλου πραγματοποιήθηκαν μία φορά και αναλύθηκαν ως πείραμα δύο παραγόντων, όπου η κύρια επίδραση των παραγόντων και η αλληλεπίδρασή τους ποσοτικοποιήθηκε στατιστικά χρησιμοποιώντας ANOVA. Πριν από την ανάλυση, κάθε μεταβλητή απόκρισης δοκιμάστηκε για υποθέσεις σχετικά με την κανονική κατανομή και την ομοιογένεια των διακυμάνσεων της θεραπείας με τη δοκιμή Levene. Στην περίπτωση της μη ομοιογένειας των διακυμάνσεων, τα δεδομένα μετασχηματίστηκαν σε sqrt(y). Αξιολογήθηκαν σημαντικές διαφορές στις μέσες τιμές που υποδεικνύονται με ANOVA χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Tukey (α = 0,05). Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο agricolae στο πρόγραμμα στατιστικού λογισμικού R έκδοση 3.2.5 (R Core Team, 2019). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μη μετασχηματισμένα μέσα ± SE. Τα γραφήματα σχεδιάστηκαν στο πρόγραμμα Microsoft Excel.
Εφαρμογή της σεξουαλικής χειραγώγησης για την αναπαραγωγή ιατρικής κάνναβης
Προκειμένου να επαληθεύσουμε τη χρησιμότητα της προσέγγισής μας για την αναπαραγωγή ιατρικής κάνναβης, αναλύσαμε πρώτα την περιεκτικότητα σε κανναβινοειδή σε ταξιανθίες 48 μητρικών φυτών του αναπαραγωγικού πληθυσμού MX-CBD-707. Η ανάλυση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται από τους Gul et al. (2015), με τροποποιήσεις που περιγράφονται στο Laznik et al. (2020).
Με βάση τα αποτελέσματα, επιλέχθηκαν 23 μητρικά φυτά με υψηλή περιεκτικότητα σε ολική CBD (tCBD) και χαμηλή ολική THC (tTHC) με αναλογία tCBD:tTHC gt; 13 για περαιτέρω αναπαραγωγή. Από κάθε επιλεγμένο μητρικό φυτό, δύο κλώνοι παρήχθησαν και καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες βλάστησης σε χωριστούς θαλάμους. Ένας κλώνος ανά μητρικό φυτό εκτέθηκε σε συνθήκες ανθοφορίας φωτός και γονιμοποίησης και ψεκαζόταν με κολλοειδές ασήμι 30 ppm κάθε μέρα μέχρι την εμφάνιση του αρσενικού άνθους. Ο άλλος κλώνος εκτέθηκε σε καθεστώς ανθοφορίας χωρίς καμία επεξεργασία προκειμένου να διεγείρει τη θηλυκή ανθοφορία. Τα αρρενωποποιημένα και τα μη κατεργασμένα φυτά ενώθηκαν στο ίδιο δωμάτιο ανθοφορίας με την εμφάνιση αρσενικών λουλουδιών σε φυτά που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και αφέθηκαν να διασταυρωθούν λόγω εξαναγκασμού αερισμού στον θάλαμο ανθοφορίας.
Οι ώριμοι σπόροι συλλέχθηκαν, εμποτίστηκαν σε νερό για 12 ώρες στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια σπάρθηκαν σε πλάκες πολυστυρενίου με 84 τρύπες στο υπόστρωμα Kekkila (Φινλανδία). Οι πλάκες πολυστυρενίου επωάστηκαν στους 25°C με φωτοπερίοδο 16/8 ημέρες/νύχτες και 60% υγρασία. Τα σπορόφυτα που προέκυψαν πολλαπλασιάστηκαν κλωνικά και οι κλώνοι 74 γενετικά διαφορετικών φυταρίων αναλύθηκαν για την περιεκτικότητά τους σε κανναβινοειδή σε ταξιανθίες όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα φυτά από αυτό το πείραμα αναπαραγωγής αναπτύχθηκαν στο στάδιο της βλάστησης και της ανθοφορίας όπως τα άλλα φυτά σε αυτήν τη μελέτη (που περιγράφεται στην ενότητα «Φυτικό Υλικό και Συνθήκες Καλλιέργειας»).
Αποτελέσματα
Πείραμα 1
Ο θειοθειικός άργυρος επηρεάζει αρνητικά την ανάπτυξη των φυτών και τη μορφολογία
Στα φυτά από την επεξεργασία 1 (ψεκασμένο με 20 mM STS), παρατηρήθηκαν κίτρινες κηλίδες στα φύλλα 1 εβδομάδα μετά την εφαρμογή και στη συνέχεια οι κηλίδες άρχισαν να στεγνώνουν (Εικόνα 1Β). Τα φυτά άρχισαν να χάνουν φύλλα μετά από 3 εβδομάδες ανθοφορίας. Τα φυτά από την επεξεργασία 2 (ψεκασμένα με 0,7 mM STS) είχαν λιγότερες κιτρινωπές κηλίδες και ξερά φύλλα. Η ανάπτυξή τους και η ανάπτυξή τους δεν παρεμποδίστηκαν τόσο όσο εκείνες των φυτών από την επεξεργασία 1.
Οι θεραπείες 3, 4 και 5 (εφαρμογή 50, 100 και 150 μg STS στην άκρη του βλαστού, αντίστοιχα) προκάλεσαν επίσης ορισμένες φυσιολογικές αποκρίσεις. Τρεις εβδομάδες μετά την εφαρμογή, τα νεαρά φύλλα, τα οποία δεν είχαν αναπτυχθεί πλήρως τη στιγμή της θεραπείας, άρχισαν να παρουσιάζουν τραυματισμούς και παραμορφώσεις. Τα φύλλα άρχισαν να στεγνώνουν σε όλο το φυτό, όχι μόνο στην άκρη του βλαστού, όπου εφαρμόστηκε το STS. Η ένταση αυτών των τραυματισμών συνέπεσε με την ποσότητα STS που εφαρμόστηκε στην άκρη του βλαστού. Όσο υψηλότερη ήταν η ποσότητα STS που εφαρμόζεται στην άκρη του βλαστού, τόσο πιο σοβαρή επίδραση είχε στη μορφολογία και την καλή φυσική κατάσταση του φυτού. Τα φυτά από την επεξεργασία 6 (ψεκασμένα με 0,01% GA) άρχισαν να αναπτύσσονται σε μήκος και παρατηρήθηκε έντονη επιμήκυνση των μεσογονάκων.
Οι αρσενικές ταξιανθίες άρχισαν να εμφανίζονται 3 εβδομάδες μετά την επεξεργασία των θηλυκών φυτών. Παρατηρήθηκαν για πρώτη φορά στη θεραπεία 1 (20 mM STS, ψεκασμένος), ακολουθούμενη από την εμφάνιση αρσενικών λουλουδιών στα φυτά από τις θεραπείες 2 (0,7 mM STS, ψεκασμένος), 5, 4 και 3 (εφαρμογή 150, 100 και 50 μg STS στην άκρη του βλαστού, αντίστοιχα) σε μεσοδιαστήματα 3 ημερών όπως αναφέρονται οι θεραπείες. Τα αρσενικά άνθη άρχισαν να ανοίγουν 4 εβδομάδες μετά την επεξεργασία των φυτών και η γύρη άρχισε να εξαπλώνεται (Εικόνα 1Γ). Στα φυτά από τις επεξεργασίες 6 (GA3), 7 (κόψιμο) και τον έλεγχο, παρατηρήθηκαν μόνο λίγα αρσενικά άνθη. Φυτά από όλες τις θεραπείες ανέπτυξαν επίσης θηλυκά άνθη. Δεν παρατηρήθηκαν ερμαφρόδιτα άνθη (δηλαδή, λουλούδια γεριού που περιέχουν επίσης ανθήρες).
Διαφορετικές θεραπείες προκάλεσαν το σχηματισμό αρσενικών λουλουδιών σε θηλυκά φυτά
Ο πληθυσμός αναπαραγωγής και η θεραπεία είχαν στατιστικά σημαντική επίδραση στην αναλογία ύψους των φυτών, την αναλογία του αριθμού των κόμβων, τον αριθμό όλων των ταξιανθιών και τον αριθμό των αρσενικών ταξιανθιών με μία μόνο εξαίρεση (Πίνακας 3). Δεν βρέθηκε αλληλεπίδραση μεταξύ του πληθυσμού αναπαραγωγής και της θεραπείας για τις αναφερόμενες μεταβλητές.
Πίνακας 3. Επίδραση του αναπαραγωγικού πληθυσμού και της θεραπείας στην αναλογία ύψους των φυτών, την αναλογία του αριθμού των κόμβων, τον αριθμό όλων των ταξιανθιών και τον αριθμό των αρσενικών ταξιανθιών.
Οι στατιστικά σημαντικοί πληθυσμοί αναπαραγωγής (p lt; 0,001) διέφεραν και για τις τέσσερις μετρημένες μεταβλητές απόκρισης, όπου το MX-CBD-707 εξέθεσε πιο εντατική μορφολογική ανάπτυξη (υψηλότερη αναλογία ύψους και αριθμού κόμβων) και σχημάτισε περισσότερες ταξιανθίες σε σύγκριση με το MX-CBD-11 . Αλλά ο αναπαραγωγικός πληθυσμός MX-CBD-11 εμφάνισε μεγαλύτερο αριθμό αρσενικών ταξιανθιών.
Η επεξεργασία δεν είχε καμία επίδραση στην αναλογία ύψους, παρά το γεγονός ότι τα κομμένα φυτά παρουσίασαν τη μικρότερη ανάπτυξη. Αντίθετα, η αναλογία ενός αριθμού κόμβων διέφερε σημαντικά μεταξύ των θεραπειών (p lt; 0,001), όπου τα κομμένα φυτά παρουσίασαν τη μικρότερη αύξηση σε έναν αριθμό κόμβων. Η ίδια παρατήρηση συμβαίνει και με τον αριθμό όλων των ταξιανθιών, όπου τα φυτά από αυτήν την επεξεργασία ανέπτυξαν τις λιγότερες ταξιανθίες. Οι διαφορές μεταξύ των θεραπειών είναι πιο έντονες για τον αριθμό των ταξιανθιών με αρσενικά άνθη, όπου ο ψεκασμός με 20 mM STS διέγειρε την ανάπτυξη του μεγαλύτερου αριθμού αρσενικών ταξιανθιών, ακολουθούμενο από ψεκασμό με 0,7 mM STS και εφαρμογή 50 μg STS στην άκρη του βλαστού. Μικρότεροι αριθμοί ταξιανθιών με αρσενικά άνθη χωρίς στατιστική διαφορά παρατηρήθηκαν στις θεραπείες 6 (GA3), 7 (κόψιμο) και στον έλεγχο.
Ο αριθμός των αρσενικών λουλουδιών επηρεάστηκε από την επίδραση αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο παραγόντων
Βρέθηκε στατιστικά σημαντική αλληλεπίδραση (p = 0,0393) μεταξύ των κύριων παραγόντων για τον αριθμό των αρσενικών λουλουδιών ανά φυτό (Εικόνα 2). Ο υψηλότερος αριθμός αρσενικών λουλουδιών (και για τους δύο αναπαραγωγικούς πληθυσμούς) παρατηρήθηκε μετά τις θεραπείες 1 και 2 (ψεκασμού με 20 και 0,7 mM STS), ακολουθούμενες από τις θεραπείες 3, 4 και 5 (εφαρμογή 50, 100 και 150 μg STS στο βλαστάρι συμβουλή, αντίστοιχα). Οι τρεις τελευταίες θεραπείες (6 – GA3, 7 – κοπή και έλεγχος) παρήγαγαν σημαντικά μικρότερο αριθμό αρσενικών λουλουδιών. Και στις οκτώ δοκιμασμένες θεραπείες, ο πληθυσμός αναπαραγωγής MX-CBD-11 ανέπτυξε μεγαλύτερο αριθμό αρσενικών λουλουδιών σε σύγκριση με το MX-CBD-707 (Εικόνα 2).
Σχήμα 2. Ο αριθμός των επαγόμενων αρσενικών λουλουδιών ανά φυτό υποδεικνύεται από την επίδραση αλληλεπίδρασης μεταξύ του πληθυσμού αναπαραγωγής και της θεραπείας. Οι μέσες τιμές ακολουθούμενες από διαφορετικά γράμματα είναι σημαντικά διαφορετικές στο επίπεδο πιθανότητας 5% (Tukey). Οι οριζόντιες ράβδοι αντιπροσωπεύουν SE (± SE).
Πείραμα 2
Προκαλούμενος από κολλοειδές άργυρος σχηματισμός γόνιμων αρσενικών λουλουδιών σε θηλυκά φυτά
Στο δεύτερο πείραμα, μελετήθηκε η επίδραση διαφορετικών προεπεξεργασιών (168 ώρες φως, 168 ώρες σκοτάδι και εναλλαγή 18/6 φωτός/σκότους) πριν από την εφαρμογή 0,3 mM STS ή 30 ppm κολλοειδούς αργύρου. Μετά τον ψεκασμό ολόκληρων των φυτών, εκτέθηκαν σε σταθερή φωτοπερίοδο φωτός/σκότους 12/12 ή σε φωτοπερίοδο που προκαλεί στρες (μία θεραπεία). Η προεπεξεργασία, καθώς και η θεραπεία, είχαν στατιστικά σημαντική επίδραση στον αριθμό των αρσενικών λουλουδιών, αλλά η αλληλεπίδρασή τους δεν παρατηρήθηκε (Πίνακας 4). Ο υψηλότερος μέσος αριθμός αρσενικών λουλουδιών ανά φυτό (339) επιτεύχθηκε μετά από προεπεξεργασία των φυτών στο συνηθισμένο καθεστώς φωτός για βλαστική ανάπτυξη (18 ώρες φως και 6 ώρες σκοτάδι), ενώ η επώαση στο σκοτάδι για 168 ώρες προκάλεσε τη χαμηλότερη εμφάνιση αρσενικών λουλούδια. Μεταξύ των δοκιμασμένων θεραπειών, 0,3 mM STS προκάλεσε τον υψηλότερο σχηματισμό αρσενικών λουλουδιών, ακολουθούμενη από την ίδια επεξεργασία και έκθεση των φυτών σε καθεστώτα φωτός που προκαλούν στρες. Σε αντίθεση με τον ψεκασμό 0,3 mM STS, που προκαλεί αρσενική ανθοφορία μετά από μία μόνο εφαρμογή, ο κολλοειδής άργυρος έπρεπε να ψεκάζεται κάθε μέρα μέχρι να σχηματιστούν αρσενικά άνθη και να αποδώσει κατά μέσο όρο 293 αρσενικά άνθη ανά φυτό. Ο ψεκασμός φυτών με κολλοειδές ασήμι μόνο μία φορά παρήγαγε αμελητέο αριθμό αρσενικών λουλουδιών, τα αποτελέσματα ήταν πρακτικά ίσα με τα αποτελέσματα των φυτών ελέγχου, τα οποία δεν ψεκάστηκαν με κανένα διάλυμα αργύρου (Πίνακες 4, 5). Η εμφάνιση των επαγόμενων αρσενικών λουλουδιών και η βιωσιμότητα της γύρης φαίνονται στα Σχήματα 1F,G. το κολλοειδές ασήμι έπρεπε να ψεκάζεται κάθε μέρα μέχρι να σχηματιστούν αρσενικά άνθη και απέδωσε κατά μέσο όρο 293 αρσενικά άνθη ανά φυτό. Ο ψεκασμός φυτών με κολλοειδές ασήμι μόνο μία φορά παρήγαγε αμελητέο αριθμό αρσενικών λουλουδιών, τα αποτελέσματα ήταν πρακτικά ίσα με τα αποτελέσματα των φυτών ελέγχου, τα οποία δεν ψεκάστηκαν με κανένα διάλυμα αργύρου (Πίνακες 4, 5). Η εμφάνιση των επαγόμενων αρσενικών λουλουδιών και η βιωσιμότητα της γύρης φαίνονται στα Σχήματα 1F,G. το κολλοειδές ασήμι έπρεπε να ψεκάζεται κάθε μέρα μέχρι να σχηματιστούν αρσενικά άνθη και απέδωσε κατά μέσο όρο 293 αρσενικά άνθη ανά φυτό. Ο ψεκασμός φυτών με κολλοειδές ασήμι μόνο μία φορά παρήγαγε αμελητέο αριθμό αρσενικών λουλουδιών, τα αποτελέσματα ήταν πρακτικά ίσα με τα αποτελέσματα των φυτών ελέγχου, τα οποία δεν ψεκάστηκαν με κανένα διάλυμα αργύρου (Πίνακες 4, 5). Η εμφάνιση των επαγόμενων αρσενικών λουλουδιών και η βιωσιμότητα της γύρης φαίνονται στα Σχήματα 1F,G.
Πίνακας 4. Επίδραση της προεπεξεργασίας και της επεξεργασίας σε έναν αριθμό αρσενικών λουλουδιών ανά φυτό του MX-CBD-707.
Πίνακας 5. Αριθμός αρσενικών λουλουδιών ανά φυτό και αριθμός βλαστημένων κυττάρων γύρης in vitro μετά την επαγωγή αρσενικής ανθοφορίας σε θηλυκά φυτά του MX-CBD-707.
Η γύρη φύτρωσε επιτυχώς in vitro και in vivo
Η in vitro δοκιμή βλάστησης έδειξε ότι τα επαγόμενα αρσενικά άνθη παρήγαγαν βιώσιμη γύρη που είναι ικανή να βλαστήσει in vitro σε στερεοποιημένο μέσο βλάστησης (Εικόνα 1Ε και Πίνακας 5).
Η βλαστική ικανότητα της γύρης επιβεβαιώθηκε επίσης με in vivo επικονίαση θηλυκών ανθέων. Μετά από 24 ώρες, οι βλαστικοί σωλήνες γύρης ήταν καθαρά ορατοί σε στίγματα βαμμένα με μπλε ανιλίνης (Εικόνα 1D).
Προκειμένου να επαληθευτεί η ικανότητα της γύρης να γονιμοποιεί θηλυκά άνθη και να παράγει θηλυκοποιημένους σπόρους, η γύρη συλλέχθηκε από επεξεργασμένα φυτά του αναπαραγωγικού πληθυσμού MX-CBD-707 και χρησιμοποιήθηκε για την επικονίαση διαφορετικών βλαστών ενός φυτού ελέγχου (μη επεξεργασμένο). Δύο εβδομάδες μετά την επικονίαση, μετρήθηκε ο αριθμός των αναπτυσσόμενων θηλυκοποιημένων σπόρων, ο οποίος παρουσιάζεται στον Πίνακα 6 και στο Σχήμα 1Η.
Πίνακας 6. Αριθμός αναπτυσσόμενων σπόρων 2 εβδομάδες μετά την επικονίαση με γύρη από φυτά MX-CBD-707 που προκλήθηκαν με διαφορετικές ελαφριές (προ)επεξεργασίες και εφαρμογές αργύρου.
Αναπαραγωγή MX-CBD-707
Η ανάλυση του προφίλ κανναβινοειδών αποκάλυψε ότι 48 φυτά MX-CBD-707 περιείχαν μεταξύ 3,47 και 11,70% και 0,41 έως 9,91% tCBD και tTHC, αντίστοιχα. Οι αναλογίες μεταξύ tCBD και tTHC κυμαίνονταν έτσι μεταξύ 0,9 και 18,8, που αντιπροσωπεύει σχεδόν 21 φορές διαφορά. Για να σταθεροποιήσουμε την εκχύλιση CBD από θηλυκά άνθη, επιλέξαμε 23 φυτά με αναλογίες tCBD προς tTHC πάνω από 13.
Αυτά τα μητρικά φυτά κλωνοποιήθηκαν, προκλήθηκαν να παράγουν αρσενικά άνθη ψεκάζοντάς τα με κολλοειδές ασήμι 30 ppm κάθε μέρα και αφέθηκαν να διασταυρωθούν σε έναν περιεχόμενο θάλαμο ανθοφορίας. Η επεξεργασία με κολλοειδές άργυρο επιλέχθηκε με βάση τα αποτελέσματά μας που λήφθηκαν στα πειράματα που περιγράφηκαν παραπάνω, τα οποία έδειξαν την καλύτερη απόδοση όσον αφορά τον αριθμό των in vitro βλαστημένων κόκκων γύρης και τον αριθμό των αναπτυσσόμενων σπόρων (Πίνακες 5, 6). Οι σπόροι αφέθηκαν στα φυτά μέχρι την ωρίμανση όταν σπάρθηκαν, και καταγράφηκε ποσοστό βλάστησης 64,3%. Η ανάλυση κανναβινοειδών 74 δενδρυλλίων έδειξε ότι τα άνθη τους περιείχαν από 1,77 έως 24,34% και 0,09 έως 0,85% tCBD και tTHC, αντίστοιχα. Η αναλογία μεταξύ tCBD και tTHC κυμαινόταν μεταξύ 13,26 και 29,58 (Εικόνα 3).
Εικόνα 3. Κατανομή των αναλογιών μεταξύ tCBD και tTHC σε 48 μητρικά φυτά αναπαραγωγικού πληθυσμού MX-CBD-707 (αριστερά-μπλε) και 74 των απογόνων τους (δεξιά-πράσινα).
Συζήτηση
Η αλλαγή του συστήματος αναπαραγωγής στην κάνναβη, με τη μορφή της εμφάνισης αρσενικών λουλουδιών σε θηλυκά φυτά, είναι ένα χρήσιμο φαινόμενο στην εκτροφή κάνναβης. Επιτρέπει την αυτογονιμοποίηση και/ή τη διασταύρωση φυτών που είναι γενετικά θηλυκά. Επιπλέον, οδηγεί σε απογόνους σπόρους που είναι εξ ολοκλήρου θηλυκοποιημένοι. Ως εκ τούτου, είναι εξαιρετικά πολύτιμα στην παραγωγή ιατρικής κάνναβης, η οποία βασίζεται αποκλειστικά σε φαινοτυπικά θηλυκά φυτά (Soler et al., 2017).
Το αιθυλένιο είναι μια γνωστή αέρια φυτική ορμόνη, η οποία εμπλέκεται στη σεξουαλική έκφραση στα φυτά. Προωθεί τη θηλυκότητα και οι αναστολείς της βιοσύνθεσης του αιθυλενίου ή της απόκρισης του αιθυλενίου καταστέλλουν την ανάπτυξη των γυναικείων αναπαραγωγικών οργάνων, προάγοντας έτσι την αρρενωπότητα (Kumar et al., 2009). Ο τρόπος δράσης διευκρινίστηκε εν μέρει πρόσφατα στο αγγούρι και το πεπόνι, όπου οι Tao et al. (2018) απέδειξε ότι η σηματοδότηση αιθυλενίου εμπλέκεται άμεσα στην αλληλεπίδραση μεταξύ των γονιδίων που σχετίζονται με τον προσδιορισμό του φύλου ελέγχοντας τους παράγοντες μεταγραφής που ανταποκρίνονται στο αιθυλένιο CsERF110 και CmERF110 (Tao et al., 2018). Τα ιόντα αργύρου από το STS και ο κολλοειδής άργυρος δρουν ως ανταγωνιστές του αιθυλενίου, εμποδίζοντας έτσι τη λειτουργία του, και με αυτόν τον τρόπο πιθανώς επιτρέπουν την επαγωγή του ανδρικού φύλου (Ram and Sett, 1982). Οι Ram και Sett (1982) έδειξαν για πρώτη φορά ότι το STS είναι ικανό για επαγωγή αρσενικού φύλου στην άγρια προσχώρηση του C. sativa L. Ανακάλυψαν επίσης ότι το STS ήταν πιο αποτελεσματικό σε σύγκριση με το AgNO3, πιθανώς λόγω της ταχύτερης μεταφοράς του STS μέσω των φυτών . Πρόσφατα, οι Adal et al. (2021) χρησιμοποίησε STS για τη χημική επαγωγή αρσενικών λουλουδιών σε θηλυκά φυτά. Εντόπισαν πάνω από 10.500 διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια, από τα οποία, περίπου 200 είναι δυνητικά υπεύθυνα για την ανάπτυξη αρσενικών λουλουδιών σε θηλυκά φυτά. Η μελέτη τους επιβεβαίωσε ότι ο προσδιορισμός του φύλου στα άνθη κάνναβης ελέγχεται κυρίως σε γενετικό επίπεδο. Ωστόσο, τα εκφραζόμενα γονίδια φάνηκε να εμπλέκονται σε διάφορα μονοπάτια, όπως η σηματοδότηση φυτοορμονών, η ανάπτυξη ανθέων, ο μεταβολισμός των λιπιδίων, η ζάχαρη και άλλα,
Στο πείραμά μας, χρησιμοποιήθηκαν 23 διαφορετικές θεραπείες (χημικές με STS ή κολλοειδές άργυρο, ορμονικές με χρήση GA και φυσιολογικές με εντατική κοπή) για την επαγωγή αρσενικών λουλουδιών σε θηλυκά φυτά, προκειμένου να αξιολογηθεί η επιρροή τους στη σεξουαλική έκφραση στην ιατρική κάνναβη. Το ύψος του φυτού και ο αριθμός των κόμβων, που αξιολόγησαν την επίδραση των θεραπειών στην ανάπτυξη των φυτών, δεν έδειξαν αρνητική επίδραση ως αποτέλεσμα των θεραπειών μας. Αν και οι Ram και Sett (1982) ανέφεραν ότι μετά την εφαρμογή του STS στις άκρες των βλαστών, τα φυτά που υποβλήθηκαν σε θεραπεία έγιναν μαύρα, τα νεαρά φύλλα αποχρωματίστηκαν, μαραίνονταν και παραμορφώθηκαν κ.λπ., παρατηρήθηκαν λιγότερο έντονες επιδράσεις του STS στην ανάπτυξη και τη μορφολογία των φυτών. μελέτη. Ακόμη και η υψηλότερη ποσότητα STS που προστέθηκε στην άκρη του βλαστού στην έρευνά μας (150 μg) δεν είχε αρνητική επίδραση στην ανάπτυξη των φυτών (Πίνακας 3). ενώ η εφαρμογή 100 μg στο άκρο του βλαστού στη μελέτη των Ram και Sett (1982) προκάλεσε ολική κατάρρευση της άκρης του βλαστού, μειωμένη επιφάνεια φύλλων και μειωμένη ανάπτυξη του φυτού σε ύψος μετά την επεξεργασία. Ο αριθμός των αρσενικών λουλουδιών ανά φυτό στη μελέτη μας ήταν παρόμοιος με τον αριθμό που μέτρησαν για την ίδια θεραπεία (εφαρμογή 100 μg, έως 110 αρσενικά άνθη), αλλά η έρευνά μας έδειξε επίσης ότι η εφαρμογή STS σε ολόκληρα φυτά είναι πιο αποτελεσματική από την εφαρμογή STS στις άκρες βλαστών.
Η επίδραση αλληλεπίδρασης μεταξύ γονότυπου και θεραπείας σε έναν αριθμό αρσενικών λουλουδιών σε αυτή τη μελέτη απέδειξε ότι ο γονότυπος επηρεάζει την επιτυχία της επαγωγής αρσενικών λουλουδιών. Συνολικά, παρατηρήσαμε μεγαλύτερο αριθμό αρσενικών λουλουδιών που αναπτύχθηκαν ανά φυτό σε σύγκριση με τη μελέτη των Ram και Sett (1982), οι οποίοι έλαβαν θεραπεία φυτών κάνναβης τύπου ίνας. ενώ στο πείραμά μας χρησιμοποιήθηκαν φυτά ιατρικής κάνναβης. Εξάλλου, εφαρμόσαμε STS ψεκάζοντας ολόκληρα φυτά, όπου οι Ram και Sett (1982) προσθέτουν STS μόνο στην άκρη του βλαστού και αυτός θα μπορούσε επίσης να είναι ο λόγος για την παραλλαγή που προκύπτει. Διαφορές στην πρόκληση αρρενωπότητας παρατηρήθηκαν επίσης συγκρίνοντας τα αποτελέσματά μας με τους Lubell και Brand (2018), οι οποίοι χρησιμοποίησαν STS για την επαγωγή αρσενικών λουλουδιών σε θηλυκά φυτά κάνναβης. Αν και ο αριθμός των αρσενικών λουλουδιών στη μελέτη τους δεν μετρήθηκε ακριβώς, προσδιόρισαν έως και ≈85% των ταξιανθιών με αρσενικά άνθη, όπου στη μελέτη μας μόνο το 55% περίπου των ταξιανθιών περιείχε αρσενικά άνθη. Οι Lubell και Brand (2018) διαπίστωσαν ότι ένα (στα τέσσερα δοκιμασμένα) στελέχη κάνναβης ήταν πιο επιρρεπές στη μετατροπή του φύλου και εμφάνισε υψηλότερο επίπεδο αρρενωποποίησης. Το φαινόμενο της εξάρτησης του γονότυπου από την πρόκληση φύλου παρατηρήθηκε επίσης από τους Moliterni et al. (2004), ο οποίος παρατήρησε ότι οι ευρωπαϊκές ποικιλίες κάνναβης εμφανίζουν διαφορετικά στάδια αντοχής στις θεραπείες αναστροφής φύλου.
Η υπόθεση σχετικά με την ειδικότητα του γονότυπου για την αναστροφή φύλου επιβεβαιώθηκε από τα αποτελέσματα του πρώτου μας πειράματος, στο οποίο ο αναπαραγωγικός πληθυσμός MX-CBD-11 ξεπέρασε το MX-CBD-707 όσον αφορά την παραγωγή αρσενικών λουλουδιών μετά και τις επτά διαφορετικές θεραπείες. Δεδομένου ότι οι θεραπείες ήταν πανομοιότυπες και για τους δύο πληθυσμούς αναπαραγωγής και πραγματοποιήθηκαν ταυτόχρονα υπό τις ίδιες συνθήκες ανθοφορίας, τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ξεκάθαρα την εξάρτηση του γονότυπου της φυσιομορφολογικής απόκρισης στις ενώσεις αργύρου.
Η σύγκριση της γύρης από φυσικά αρσενικά φυτά κάνναβης και αρρενωποποιημένα θηλυκά έδειξε ότι τα τελευταία παράγουν σημαντικά υψηλότερο αριθμό ακανόνιστων ή κακοσχηματισμένων κόκκων γύρης που είναι ανεπαρκείς στη διασπορά από ανθήρες και είχαν χαμηλότερο ρυθμό βλάστησης (DiMatteo et al., 2020). Στη μελέτη μας, δεν ήταν δυνατή η σύγκριση μεταξύ της γύρης από αρρενωποποιημένα θηλυκά φυτά και των αρσενικών φυτών, επειδή οι ιατρικοί πληθυσμοί αναπαραγωγής περιείχαν αποκλειστικά θηλυκά φυτά. Ως εκ τούτου, αποφασίσαμε να δοκιμάσουμε τη βιωσιμότητα της γύρης και τη βλαστική της ικανότητα in vitro και in vivo και, τέλος, αξιολογήσαμε το σύνολο των σπόρων μετά την επικονίαση θηλυκών φυτών με γύρη από αρρενωποποιημένα φυτά. Τα αποτελέσματά μας (Εικόνα 1 και Πίνακες 5, 6) επιβεβαίωσαν τη βιωσιμότητα και τη λειτουργικότητα της γύρης που αναπτύχθηκε σε αρσενοποιημένα θηλυκά φυτά.
Από την άλλη πλευρά, ο ψεκασμός με την ορμόνη GA3 δεν είχε σημαντικές επιπτώσεις στην επαγωγή αρσενικών λουλουδιών στα φυτά μας ιατρικής κάνναβης, όπως έδειξαν επίσης οι Sarath και Ram (1978). Αν και ο Chailakhyan (1979) απέδειξε ότι το GA3 έχει ισχυρή επίδραση στην εμφάνιση των αρσενικών λουλουδιών, εφάρμοσαν την ορμόνη μέσω των ριζών πολύ νεαρών φυτών κάνναβης, κάτι που δεν είναι πρακτικό για λόγους αναπαραγωγής. Εκτός από τα χημικά και ορμονικά ερεθίσματα, το φυσιολογικό στρες που προκαλείται από μηχανική βλάβη αναμενόταν επίσης να αυξήσει την πιθανότητα αναστροφής του φύλου (Clarke, 1999). Ωστόσο, η εντατική κοπή, που ήταν μια από τις θεραπείες μας, δεν έφερε θετικά αποτελέσματα όσον αφορά την επαγωγή αρσενικών λουλουδιών.
Μερικά αρσενικά λουλούδια εμφανίστηκαν στα φυτά ελέγχου, όπου δεν αναμένονταν λουλούδια με έλασμα. Είναι πιθανό ότι η ανεπιθύμητη μετατόπιση του STS από τα φυτά που υποβλήθηκαν σε θεραπεία στα φυτά ελέγχου συνέβη στο δωμάτιο ανάπτυξης, καθώς χρησιμοποιήθηκε ισχυρός αερισμός κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Από την άλλη πλευρά, πρόσφατα αποδείχθηκε από τους Punja και Holmes (2020) ότι τα αρσενικά άνθη μπορούν να σχηματιστούν αυθόρμητα σε έως και 10% των θηλυκών φυτών, επομένως, δεν μπορεί να αποκλειστεί η πιθανότητα ανεπιθύμητης αυθόρμητης μετατροπής του φύλου.
Τέλος, το πρωτόκολλο που χρησιμοποιεί κολλοειδές ασήμι χρησιμοποιήθηκε με επιτυχία για την αναπαραγωγή θηλυκών φυτών πληθυσμού αναπαραγωγής ιατρικής κάνναβης MX-CBD-707. Ολόκληρα, ο θηλυκός απόγονος ελήφθη μετά τη διασταύρωση του γονικού πληθυσμού των θηλυκών που προκλήθηκαν να σχηματίσουν αρσενικά άνθη, επιβεβαιώνοντας έτσι τη θεωρία της παραγωγής αποκλειστικά θηλυκοποιημένων σπόρων όταν διασταυρώνονται μόνο φυτά XX (Green, 2005). Επιπλέον, παρατηρήθηκε σημαντική βελτίωση της αναλογίας tCBD/tTHC (με μέγιστη περιεκτικότητα tCBD 29,58% μετρημένη σε φυτό με tTHC τόσο χαμηλό όσο 0,82%) μετά τη διασταύρωση μόνο 23 επιλεγμένων μητρικών φυτών. Δείχνει ότι η διασταύρωση φυτών που επιλέγονται με βάση το προφίλ χημειότυπου τους βελτιώνει τη γενετική σύσταση του αναπαραγωγικού πληθυσμού και, κατά συνέπεια, επιτρέπει την ανάπτυξη νέων ποικιλιών με βελτιωμένα προφίλ κανναβινοειδών.
συμπέρασμα
Από όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη ολοκληρωμένη επιστημονική έκθεση σχετικά με την επαγωγή γόνιμων αρσενικών λουλουδιών σε θηλυκά φυτά ιατρικής κάνναβης (Cannabis sativa L.). Προηγούμενες αναφορές για τη χειραγώγηση του φύλου στην κάνναβη πραγματοποιήθηκαν σε γονότυπους ινών-κάνναβης (Ram and Sett, 1982; Lubell and Brand, 2018; DiMatteo et al., 2020), ενώ οι μέθοδοι για την ιατρική κάνναβη κοινοποιούνται μεταξύ των καλλιεργητών εδώ και χρόνια, αλλά πληροφορίες δεν ελήφθησαν με τρόπο που να βασίζεται σε επιστημονικές μεθοδολογίες.
Δήλωση διαθεσιμότητας δεδομένων
Οι πρωτότυπες συνεισφορές που παρουσιάζονται στη μελέτη περιλαμβάνονται στο άρθρο/συμπληρωματικό υλικό, περαιτέρω έρευνες μπορούν να απευθύνονται στον αντίστοιχο συγγραφέα.
Συνεισφορές Συγγραφέων
Ο MF και ο JM συνέλαβαν και σχεδίασαν τη μελέτη και έγραψαν το χειρόγραφο. Ο MS πραγματοποίησε τα πειράματα. Οι MF, MS και JM ανέλυσαν τα δεδομένα. Όλοι οι συγγραφείς διάβασαν και ενέκριναν το χειρόγραφο.
Χρηματοδότηση
Αυτή η εργασία πραγματοποιήθηκε στο πλαίσιο του επιστημονικού-ερευνητικού έργου «Breeding Medical Cannabis (Cannabis sativa L.)» σε συνεργασία μεταξύ της Βιοτεχνικής Σχολής του Πανεπιστημίου της Λουμπλιάνα, Σλοβενία, και της MGC Pharmaceuticals Ltd. Αυτή η μελέτη έλαβε χρηματοδότηση από την MGC Pharmaceuticals Ltd. Ο χρηματοδότης δεν συμμετείχε στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή, την ανάλυση και την ερμηνεία των δεδομένων, τη σύνταξη αυτού του άρθρου ή την απόφαση υποβολής του για δημοσίευση. Η έρευνα υποστηρίχθηκε επίσης από το ερευνητικό πρόγραμμα P4-0077 και το κέντρο υποδομής IC RRC-AG (IO-0022-0481-001) του Σλοβενικού Οργανισμού Ερευνών.
Σύγκρουση συμφερόντων
Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη απουσία εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.
Σημείωση εκδότη
Όλοι οι ισχυρισμοί που εκφράζονται σε αυτό το άρθρο είναι αποκλειστικά εκείνοι των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραιτήτως αυτούς των συνδεδεμένων οργανισμών τους ή του εκδότη, των εκδοτών και των κριτικών. Οποιοδήποτε προϊόν μπορεί να αξιολογηθεί σε αυτό το άρθρο ή ισχυρισμός που μπορεί να προβληθεί από τον κατασκευαστή του, δεν είναι εγγυημένο ή εγκεκριμένο από τον εκδότη.
Ευχαριστίες
Ευχαριστούμε τους Sinja Svetik, Špela Mestinšek Mubi, Liza Zavrl (από τη Βιοτεχνική Σχολή) και Irena Pribošič (από την MGC Pharmaceuticals Ltd.) για την τεχνική βοήθειά τους κατά τη διάρκεια των πειραμάτων.
Cannabis sativa L., Σεξουαλική χειραγώγηση, θειοθειικό άργυρο, κανναβιδιόλη, ιατρική κάνναβη υψηλής CBD, θηλυκοί σπόροι, κανναβινοειδή