Στοιχεία για διασταυρούμενη συζήτηση μεταξύ 5′-νουκλεοτιδασών κυτοσολίου και κινάσης πρωτεΐνης ενεργοποιημένης με AMP

• ¹ Unità di Biochimica, Dipartimento di Biologia, Università di Pisa, Πίζα, Ιταλία
• ² Unità di Fisiologia Generale, Dipartimento di Biologia, Università di Pisa, Πίζα, Ιταλία

Εισαγωγή

Η διατήρηση της σωστής ισορροπίας των δεξαμενών νουκλεοτιδίων είναι απαραίτητη για πολλές ζωτικές λειτουργίες (Bester et al., 2011; Garcia-Gil et al., 2018; Camici et al., 2019). Ο έλεγχος πολλών ενζυμικών δραστηριοτήτων που απαιτούνται για το μεταβολισμό των νουκλεοτιδίων συμβάλλει σε αυτή την ομοιόσταση. Μεταξύ των εμπλεκόμενων ενζύμων, οι κυτοσολικές 5′-νουκλεοτιδάσες (NT5Cs) παίζουν κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της δεξαμενής νουκλεοτιδίων πουρίνης (Εικόνα 1). Τα κύρια NT5C που δρουν στα νουκλεοτίδια πουρίνης είναι η κυτοσολική 5′-νουκλεοτιδάση Ι (NT5C1), η οποία ασκεί τη δράση της κυρίως στους σκελετικούς μύες, και η κυτοσολική 5′-νουκλεοτιδάση II (NT5C2), η οποία εκφράζεται παντού. Το προτιμώμενο υπόστρωμα για το NT5C1 είναι το AMP, με KM στην χιλιοστογραμμομοριακή περιοχή (Hunsucker et al., 2001; Tkacz-Stachowska et al., 2005). Αν και προτιμούν τα IMP και GMP ως υποστρώματα (KM στο μικρογραμμομοριακό εύρος) (Tozzi et al., 2013), Το NT5C2 καταλύει επίσης την υδρόλυση του φωσφοεστερικού δεσμού του AMP (με ένα KM στο millimolar εύρος) (Tozzi et al., 2013). Ο ρυθμός του κύκλου IMP-GMP (Εικόνα 1) που ρυθμίζει τις ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις νουκλεοτιδίων πουρίνης, εξαρτάται από τη δραστηριότητα του NT5C2 (Barsotti et al., 2003). Στην πραγματικότητα, παρουσία φορτίου υψηλής ενέργειας, το NT5C2 καταλύει τον καταβολισμό της περίσσειας IMP, που συντίθεται από de novo ή οδούς διάσωσης, ενώ επιτρέπει τη συσσώρευση IMP και AMP σε περίπτωση φορτίου χαμηλής ενέργειας (Pesi et al., 1994; Allegrini et al. al., 2004· Wallden and Nordlund, 2011· Camici et al., 2018). Για τη ρύθμιση του κύκλου AMP, εμπλέκονται και οι δύο δραστηριότητες NT5C1 και NT5C2 (Εικόνα 1). Τις τελευταίες δεκαετίες αυξανόμενα στοιχεία υποδεικνύουν τον κεντρικό ρόλο της «αίσθησης ενέργειας» που διαδραματίζει η ενεργοποιημένη με AMP πρωτεϊνική κινάση (AMPK) (Hardie et al., 2012; Garcia and Shaw, 2017). Το AMPK είναι ένα ετεροτριμερές που αποτελείται από την καταλυτική α (α1 ή α2), τη ρυθμιστική β (β1 ή β2) και τις γ υπομονάδες (γ1, γ2 ή γ3). Οι αλλαγές στην αναλογία AMP:ATP γίνονται αντιληπτές από την γ υπομονάδα του AMPK που περιέχει τρεις θέσεις δέσμευσης AMP, δύο από τις οποίες είναι ανταλλάξιμες με ATP (Xiao et al., 2007). Η δέσμευση της AMP αυξάνει περαιτέρω τη δραστηριότητα κινάσης της AMPK τόσο αλλοστερικά όσο και αναστέλλοντας την αποφωσφορυλίωση της (Sanders et al., 2007). Οι κύριες ανοδικές κινάσες που ενεργοποιούν την AMPK με φωσφορυλίωση του Thr172 (Hawley et al., 1996), είναι η ογκοκατασταλτική κινάση LKB1 (Woods et al., 2003) και το Ca δύο από τα οποία ανταλλάσσονται με ATP (Xiao et al., 2007). Η δέσμευση της AMP αυξάνει περαιτέρω τη δραστηριότητα κινάσης της AMPK τόσο αλλοστερικά όσο και αναστέλλοντας την αποφωσφορυλίωση της (Sanders et al., 2007). Οι κύριες ανοδικές κινάσες που ενεργοποιούν την AMPK με φωσφορυλίωση του Thr172 (Hawley et al., 1996), είναι η ογκοκατασταλτική κινάση LKB1 (Woods et al., 2003) και το Ca δύο από τα οποία ανταλλάσσονται με ATP (Xiao et al., 2007). Η δέσμευση της AMP αυξάνει περαιτέρω τη δραστηριότητα κινάσης της AMPK τόσο αλλοστερικά όσο και αναστέλλοντας την αποφωσφορυλίωση της (Sanders et al., 2007). Οι κύριες ανοδικές κινάσες που ενεργοποιούν την AMPK με φωσφορυλίωση του Thr172 (Hawley et al., 1996), είναι η ογκοκατασταλτική κινάση LKB1 (Woods et al., 2003) και το Ca² /εξαρτώμενη από καλμοδουλίνη κινάση β κινάσης (Hawley et al., 2005). Το AMPK ενεργοποιείται όταν το κυτταρικό ενεργειακό φορτίο είναι χαμηλό και, ενεργώντας σε πολλούς πρωτεϊνικούς στόχους, αυτή η πρωτεϊνική κινάση απενεργοποιεί τις αναβολικές οδούς που απαιτούν ATP και ενεργοποιεί τις καταβολικές οδούς που παράγουν ATP (Εικόνα 1). Η ενεργοποίηση της AMPK επιφέρει αύξηση της μυϊκής πρόσληψης γλυκόζης και της οξείδωσης των λιπαρών οξέων, καθιστώντας τους ενεργοποιητές AMPK χρήσιμα εργαλεία για τη θεραπεία του διαβήτη τύπου 2 (Coughlan et al., 2014). Επιπλέον, η ενεργοποίηση της AMPK μπορεί να είναι υπεύθυνη για ορισμένες από τις λειτουργίες καταστολής όγκων του LKB1 (Hardie and Alessi, 2013). Δεδομένου ότι τα NT5C είναι τα κύρια υπεύθυνα για τη ρύθμιση του επιπέδου AMP (Kulkarni et al., 2011), είναι κατανοητό ότι οι αλλαγές στις δραστηριότητές τους μπορεί να επηρεάσουν τις πολυάριθμες οδούς σηματοδότησης που ενεργοποιούνται από την ενεργοποίηση AMPK.

ΦΙΓΟΥΡΑ 1. Αλληλεπίδραση μεταξύ των κύκλων πουρίνης και της AMPK. Εμφανίζεται μια επιλογή μεταβολικών οδών που ρυθμίζονται από την AMPK: το κόκκινο φόντο περιλαμβάνει τις αναβολικές οδούς απενεργοποιημένες και το πράσινο φόντο τις καταβολικές οδούς που ενεργοποιούνται από την AMPK. ACC: ακετυλο-CoA καρβοξυλάση; Ado: αδενοσίνη; ADP: αδενοσίνη-5′-διφωσφορική; AMP: αδενοσίνη-5′-μονοφωσφορική; ATP: αδενοσίνη-5′-τριφωσφορική; Gua: γουανίνη; Guo: γουανοσίνη; GMP: γουανοσίνη-5′-μονοφωσφορική; HMGR: 3-υδροξυ-3-μεθυλγλουταρυλ-συνένζυμο Α αναγωγάση. Hyp: υποξανθίνη; IMP: ινοσίνη-5′-μονοφωσφορική; Ινο: ινοσίνη; NT5Cs: κυτοσολική 5′-νουκλεοτιδάση Ι και II. mTOR: θηλαστικός στόχος της ραπαμυκίνης. PFK2: 6-φωσφοφρουκτο-2-κινάση. Pi: ανόργανο φωσφορικό; PGC-1α: υποδοχέας ενεργοποιημένος από πολλαπλασιαστή υπεροξισώματος-συνενεργοποιητής γάμμα-1 άλφα. PPi: ανόργανο πυροφωσφορικό; PRPP: φωσφοριβοσυλοπυροφωσφορικό; Rib-1-P: ριβόζη-1-φωσφορική; Rib-5-P: ριβόζη-5-φωσφορική; TBC1D1: μέλος οικογένειας τομέα TBC1. TIF1A: ενδιάμεσος παράγοντας μεταγραφής-1α. UA: ουρικό οξύ; ULK1: Unc-51 σαν κινάση που ενεργοποιεί την αυτοφαγία 1. Τα ένζυμα που εμπλέκονται υποδεικνύονται με αριθμούς μέσα στους κύκλους: 1) Φωσφορυλάση νουκλεοσιδίου πουρίνης. 2) Φωσφοριβοσυλτρανσφεράση υποξανθίνης-γουανίνης. 3) Αδενοσινοκινάση. 4) Φωσφοριμομουτάση; 5) PRPP συνθετάση. 6) Απαμινάση αδενοσίνης. 7) ΑΜΡ απαμινάση. Διακεκομμένες κόκκινες γραμμές: αναστολή; διακεκομμένες πράσινες γραμμές: ενεργοποίηση. 3) Αδενοσινοκινάση. 4) Φωσφοριμομουτάση; 5) PRPP συνθετάση. 6) Απαμινάση αδενοσίνης. 7) ΑΜΡ απαμινάση. Διακεκομμένες κόκκινες γραμμές: αναστολή; διακεκομμένες πράσινες γραμμές: ενεργοποίηση. 3) Αδενοσινοκινάση. 4) Φωσφοριμομουτάση; 5) PRPP συνθετάση. 6) Απαμινάση αδενοσίνης. 7) ΑΜΡ απαμινάση. Διακεκομμένες κόκκινες γραμμές: αναστολή; διακεκομμένες πράσινες γραμμές: ενεργοποίηση.

Στους Μύες

Η γονιδιακή σίγαση του NT5C1A με ένεση shRNA και ηλεκτροδιάτρηση στον πρόσθιο κνημιαίο μύ ποντικού μείωσε την έκφραση της πρωτεΐνης NT5C1A, αύξησε τη φωσφορυλίωση της AMPK και του υποστρώματος της ακετυλο-CoA καρβοξυλάσης (ACC), καθώς και την πρόσληψη γλυκόζης (Kulkarni et al.,). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας NT5C2 siRNA σε καλλιεργημένους ανθρώπινους μυοσωληνίσκους. Η καθοδική ρύθμιση του NT5C2 οδήγησε σε αύξηση της αναλογίας AMP:ATP, αύξηση της φωσφορυλίωσης AMPK (Thr172) και αύξηση της φωσφορυλίωσης ACC (Kulkarni et al., 2011). Η υπερέκφραση του NT5C1A σε κύτταρα ανθρώπινου εμβρυϊκού νεφρού (HEK293T) προκάλεσε μείωση στην επαγόμενη από την ολιγομυκίνη αύξηση στις συγκεντρώσεις AMP και ADP και μείωση στην ενεργοποίηση AMPK (Plaideau et al., 2012). Απροσδόκητα, Η διαγραφή NT5C1A και NT5C2 δεν μπόρεσε να ενισχύσει την ενεργοποίηση της AMPK μετά από ηλεκτρική διέγερση στους μύες του πέλματος και του μακριού δακτύλου (EDL) του ποντικού (Kviklyte et al., 2017). Οι αναλογίες AMP:ATP ή ADP:ATP στους μύες που ηρεμούν νοκ-άουτ ήταν παρόμοιες με αυτές των ποντικών άγριου τύπου (WT) και η συστολή δεν προκάλεσε ενίσχυση αυτών των αναλογιών στους μυς των νοκ-άουτ ζώων (Kviklyte et al., 2017) . Στην πραγματικότητα, η ηλεκτρική διέγερση προκάλεσε τετραπλάσια αύξηση της δραστηριότητας AMPK σε σύγκριση με την κατάσταση ηρεμίας τόσο στους μύες WT όσο και στους μύες που έχουν διαγραφεί από νουκλεοτιδάση. Επίσης, η κατάντη φωσφορυλίωση ACC και η πρόσληψη γλυκόζης φάνηκε να αυξάνονται στον ίδιο βαθμό στην EDL από ηλεκτρικά διεγερμένα ποντίκια WT και NT5C2 ή NTC1A-knockout (Kviklyte et al., 2017). Επιπλέον, τα αποτελέσματα του συνδυασμού διαγραφής NT5C1 συν αναστολή της απαμινάσης AMP στην αναλογία AMP:ATP και τη δραστηριότητα AMPK, που μετρήθηκαν σε μυ σε ηρεμία και ηλεκτρικά διεγερμένο EDL μυ δεν ήταν διαφορετικά μεταξύ των μυών από τα ζώα WT και τα ζώα που έχουν κοπεί (Kviklyte et al., 2017 ). Οι συγγραφείς υπέθεσαν ότι, κατά τη συστολή, οι ροές μέσω των νουκλεοτιδασών μπορεί να είναι πολύ μειωμένες για να επηρεάσουν τα επίπεδα AMP και κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η φαρμακολογική αναστολή των ενζύμων που μεταβολίζουν την AMP μπορεί να μην είναι χρήσιμη για την προώθηση της ενεργοποίησης της AMPK και της πρόσληψης γλυκόζης στους μύες ασθενών με διαβήτη τύπου 2.

Στο Νευρικό Σύστημα

Σε ανθρώπινα νευρικά προγονικά κύτταρα (hNPCs), η καταστροφή του NT5C2 από το siRNA αύξησε την έκφραση και τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης AMPK, και εκπληκτικά, τη φωσφορυλίωση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S6 (RPS6) 40S, χωρίς τροποποίηση στην έκφραση RPS6. Επίσης, άλλαξε τη μεταγραφή αρκετών γονιδίων που εμπλέκονται στη μετάφραση πρωτεϊνών (Duarte et al., 2019). Το RPS6 συσχετίζεται με τον στόχο ενεργοποίησης του συμπλέγματος ραπαμυκίνης 1 (mTORC1) στα θηλαστικά και χρησιμοποιείται συχνά για την εκτίμηση του ρυθμού μετάφρασης πρωτεΐνης (Biever et al., 2015). Τα κύτταρα HEK293T που υπερεκφράζουν το NT5C2 χρησιμοποιήθηκαν για την περαιτέρω διερεύνηση της συσχέτισης μεταξύ του NT5C2 και της ρύθμισης του AMPK και του RPS6. Οι Duarte et al. (2019) βρήκε μείωση στη φωσφορυλιωμένη AMPK αλλά όχι στην ολική AMPK σε αυτά τα κύτταρα και μείωση στη συνολική πρωτεΐνη RPS6 που σχετίζεται με 300% αύξηση στη φωσφορυλίωση του RPS6. Επομένως, η επίδραση του NT5C2 στο RPS6 στα κύτταρα HEK293T ήταν αντίθετη από αυτή που παρατηρήθηκε στα hNPC. Οι συγγραφείς πρότειναν ότι η αύξηση στη φωσφορυλίωση του RPS6 που παρατηρήθηκε στα hNPC ως συνέπεια της καταστροφής του NT5C2 θα μπορούσε να αποδοθεί σε έναν βρόχο αρνητικής ανάδρασης που οδηγεί σε αυξημένη πρωτεϊνοσύνθεση μετά από μια αρχική διακοπή της πρωτεϊνοσύνθεσης, που έχει ήδη περιγραφεί κατά την ανάκαμψη στους μύες (Dreyer et al. , 2006). Πράγματι, η άσκηση αντοχής στους ανθρώπους αύξησε τη δραστηριότητα του AMPKα2 και μείωσε αμέσως την πρωτεϊνοσύνθεση. Ακολούθησε αυξημένη φωσφορυλίωση του p70S6K και αυξημένη πρωτεϊνική σύνθεση κατά την περίοδο αποκατάστασης, 2 ώρες μετά από μια περίοδο άσκησης (Dreyer et al., 2006). Αξίζει να σημειωθεί ότι εφόσον η πρωτεϊνοσύνθεση δεν έχει μετρηθεί άμεσα σε hNPC, είναι αδύνατο να γνωρίζουμε εάν η αύξηση του φωσφο-RPS6 που παρατηρήθηκε μετά την καταστροφή του NT5C2 (Duarte et al., 2019) αντανακλά μια αύξηση στη σύνθεση πρωτεϊνών. Αντίθετα, η πρωτεϊνοσύνθεση ήταν δραματικά χαμηλότερη στα κύτταρα ανθρώπινου καρκινώματος του πνεύμονα (A549) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Pesi et al., 2018), αλλά δεν βρέθηκε καμία τροποποίηση της δραστηριότητας AMPK σε αυτά τα κύτταρα, πιθανώς ως συνέπεια αδρανοποιητική μετάλλαξη του LKB1 σε κύτταρα Α459 (Zhong et al., 2006).

Το NT5C2 σχετίζεται με διαταραχές που χαρακτηρίζονται από ψυχιατρικές και ψυχοκινητικές διαταραχές όπως κληρονομικές σπαστικές παραπληγίες (HSP) (Garcia-Gil et al., 2018), σχιζοφρένεια (Cross-Disorder Group of the Psychiatric Genomics, 2013; Duarte et al. Duarte et al., 2019) και τη νόσο του Πάρκινσον. Το ανώμαλα ματισμένο NT5C2 που περιγράφεται από τους Elsaid et al. (2017) σε άτομα που επηρεάστηκαν από HSP έδειξε σημαντική μείωση στο επίπεδο έκφρασης στην in vitro μελέτη, υποδεικνύοντας σημαντική αστάθεια της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης NT5C2. Οι συγγραφείς προτείνουν ότι η ομόζυγη μεταβολή στο NT5C2 μπορεί να είναι απαραίτητη για την παραγωγή αναπτυξιακών ελαττωμάτων της κεντρικής λευκής ουσίας (Elsaid et al., 2017). Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι η πτώση του ομολόγου NT5C2 στο Drosophila melanogaster συσχετίστηκε με μη φυσιολογική συμπεριφορά αναρρίχησης όταν οδηγείται από έναν νευρωνικό προαγωγέα, υποστηρίζοντας έναν ρόλο για το NT5C2 στην κινητικότητα (Duarte et al., 2019). Οι μηχανισμοί που διέπουν τις παθολογικές επιδράσεις των μεταλλάξεων NT5C2 είναι άγνωστοι. Θα μπορούσε να είναι ενδιαφέρον να λάβουμε πληροφορίες όχι μόνο για τα επίπεδα έκφρασης και/ή δραστικότητας του NT5C2, αλλά και για τις πιθανές παραλλαγές της αναλογίας AMP:ATP που θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε ανοδική ρύθμιση της AMPK. Μια μόνιμη ενεργοποίηση του AMPK θα μπορούσε να οδηγήσει σε μη φυσιολογική ανάπτυξη του νευρικού συστήματος. Πράγματι, η ενεργοποίηση της AMPK προκαλεί απόπτωση σε κύτταρα ιππόκαμπου και νευροβλαστώματος (Pesi et al., 2000; Garcia-Gil et al., 2003) και μειώνει την ανάπτυξη των νευραξόνων (Williams et al., 2011). Επιπλέον, η υπερ-ενεργοποίηση της AMPK σε διαφοροποιημένους πρωτογενείς νευρώνες μειώνει τον αριθμό των συνάψεων και οδηγεί σε απώλεια της λειτουργικότητας του νευρωνικού δικτύου (Domise et al.,

Στο σωματικό βάρος

Το σωματικό βάρος των ποντικών NT5C1A ^−/− και NT5C2 ^−/− , που τρέφονταν με κανονική δίαιτα, ήταν παρόμοιο με τους συγγενείς τους με WT (Kviklyte et al., 2017). Ωστόσο, τα ποντίκια NT5C2 ^−/− που τρέφονταν με δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά (HFD) αύξησαν το σωματικό τους βάρος σημαντικά λιγότερο σε σύγκριση με τα ποντίκια WT (Johanns et al., 2019). Η διαφορά δεν οφειλόταν σε αλλαγές στην κατανάλωση τροφής ή στην πρόσληψη νερού. Αν και δεν είναι σημαντική, οι συγγραφείς ανέφεραν μια τάση προς αυξημένη δραστηριότητα AMPK σε επιθέματα λίπους από NT5C2 ^-/- σε σύγκριση με ποντίκια WT, τόσο σε βασικές όσο και σε συνθήκες διεγερμένες από νοραδρεναλίνη, ενώ σημαντική αύξηση στη συγκέντρωση AMP παρατηρήθηκε μόνο σε επιθέματα λίπους από NT5C2 ^−/−ποντίκια ως απόκριση στη θεραπεία με νοραδρεναλίνη. Σε συμφωνία με την ενεργοποίηση της AMPK, μια σημαντική αύξηση στη φωσφορυλίωση ACC συσχετίστηκε με τη διαγραφή NT5C2 και την HFD (Johanns et al., 2019).

Μελέτες συσχέτισης σε επίπεδο γονιδιώματος που πραγματοποιήθηκαν σε Ιάπωνες αποκάλυψαν ότι το αλληλόμορφο Τ του rs11191548 στο γονίδιο NT5C2 συσχετίστηκε με μειωμένη περιοχή σπλαχνικού λίπους, περιοχή υποδόριου λίπους και επιφάνεια ολικού λίπους στις γυναίκες (Hotta et al., 2012). Δυστυχώς, οι συγγραφείς δεν μέτρησαν τη δραστηριότητα του NT5C2, επομένως δεν γνωρίζουμε εάν ο αναφερόμενος πολυμορφισμός ενός νουκλεοτιδίου επηρεάζει τη λειτουργία του ενζύμου και το επίπεδο της AMP. Αν και δεν υποστηρίζεται από τα πειραματικά δεδομένα, είναι κατανοητό να υποτεθεί η εμπλοκή της AMPK, η οποία έχει αναφερθεί ότι ενσωματώνει θρεπτικά και ορμονικά σήματα για τη ρύθμιση της πρόσληψης τροφής και του σωματικού βάρους, τόσο στον υποθάλαμο όσο και στους περιφερειακούς ιστούς (Xue and Kahn, 2006). .

Τελικές παρατηρήσεις

Η δραστηριότητα του NT5C2 ρυθμίζεται αλλοστερικά από το ATP που, σε υψηλό φυσιολογικό επίπεδο, σταθεροποιεί μια πολύ ενεργή ενζυμική διαμόρφωση (Tozzi et al., 2013). Κατά τη γνώμη μας, το φορτίο υψηλής ενέργειας ενεργοποιεί τις δραστηριότητες απαμινάσης NT5C2 και AMP, οδηγώντας στην υδρόλυση της περίσσειας των νουκλεοτιδίων που έχουν πρόσφατα συντεθεί ή διασωθεί. Σε χαμηλή ενεργειακή φόρτιση, η χαμηλή δραστηριότητα και των δύο ενζύμων προκαλεί συσσώρευση μονοφωσφορικών νουκλεοσιδίων, ιδιαίτερα AMP, που μπορεί είτε να ενεργοποιήσει την AMPK είτε να υδρολυθεί από το NT5C1, απελευθερώνοντας αδενοσίνη, ξεκινώντας έτσι την πουρινεργική σηματοδότηση. Στην πραγματικότητα, η εξωκυτταρική αδενοσίνη, που δεσμεύεται σε ευρέως κατανεμημένους υποδοχείς (Α1, Α2Α, Α2Β και Α3) δρα όχι μόνο στη μεταβολική ρύθμιση μέσω της τροποποίησης της ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης του κυκλικού ΑΜΡ, αλλά και στον συντονισμό των συνάψεων και στον συντονισμό των νευρωνικών δικτύων (Agostinho et al., 2020). Μια αύξηση της εξωκυτταρικής συγκέντρωσης της αδενοσίνης μπορεί να αντανακλά σε πολλές βιολογικές διεργασίες όπως ο πολλαπλασιασμός, η ρύθμιση της ροής του αίματος, η φλεγμονή και η ανοσοκαταστολή (Vijayan et al., 2017; Jacobson et al., 2019). Αντίθετα, σε ορισμένα κύτταρα ή όργανα, η χαμηλή δραστηριότητα NT5C2 που λαμβάνεται με σίγηση, δεν ήταν σε θέση να προκαλέσει σημαντική συσσώρευση AMP, δημιουργώντας κάποιες αμφιβολίες για τον μηχανισμό που συνδέει τη χαμηλή δραστηριότητα NT5C2 και τις μεταβολικές συνέπειές της. Θα είναι πολύ ενδιαφέρον η περαιτέρω διερεύνηση αυτών των μοριακών μηχανισμών, καθώς η γνώση αυτού του θέματος θα υποστηρίξει την εφαρμογή των αναστολέων NT5C2 όχι μόνο στον καρκίνο αλλά και σε παθολογίες όπως το μεταβολικό σύνδρομο, η παχυσαρκία και ο διαβήτης. Μια αύξηση της εξωκυτταρικής συγκέντρωσης της αδενοσίνης μπορεί να αντανακλά σε πολλές βιολογικές διεργασίες όπως ο πολλαπλασιασμός, η ρύθμιση της ροής του αίματος, η φλεγμονή και η ανοσοκαταστολή (Vijayan et al., 2017; Jacobson et al., 2019). Αντίθετα, σε ορισμένα κύτταρα ή όργανα, η χαμηλή δραστηριότητα NT5C2 που λαμβάνεται με σίγηση, δεν ήταν σε θέση να προκαλέσει σημαντική συσσώρευση AMP, δημιουργώντας κάποιες αμφιβολίες για τον μηχανισμό που συνδέει τη χαμηλή δραστηριότητα NT5C2 και τις μεταβολικές συνέπειές της. Θα είναι πολύ ενδιαφέρον η περαιτέρω διερεύνηση αυτών των μοριακών μηχανισμών, καθώς η γνώση αυτού του θέματος θα υποστηρίξει την εφαρμογή των αναστολέων NT5C2 όχι μόνο στον καρκίνο αλλά και σε παθολογίες όπως το μεταβολικό σύνδρομο, η παχυσαρκία και ο διαβήτης. Μια αύξηση της εξωκυτταρικής συγκέντρωσης της αδενοσίνης μπορεί να αντανακλά σε πολλές βιολογικές διεργασίες όπως ο πολλαπλασιασμός, η ρύθμιση της ροής του αίματος, η φλεγμονή και η ανοσοκαταστολή (Vijayan et al., 2017; Jacobson et al., 2019). Αντίθετα, σε ορισμένα κύτταρα ή όργανα, η χαμηλή δραστηριότητα NT5C2 που λαμβάνεται με σίγηση, δεν ήταν σε θέση να προκαλέσει σημαντική συσσώρευση AMP, δημιουργώντας κάποιες αμφιβολίες για τον μηχανισμό που συνδέει τη χαμηλή δραστηριότητα NT5C2 και τις μεταβολικές συνέπειές της. Θα είναι πολύ ενδιαφέρον η περαιτέρω διερεύνηση αυτών των μοριακών μηχανισμών, καθώς η γνώση αυτού του θέματος θα υποστηρίξει την εφαρμογή των αναστολέων NT5C2 όχι μόνο στον καρκίνο αλλά και σε παθολογίες όπως το μεταβολικό σύνδρομο, η παχυσαρκία και ο διαβήτης. φλεγμονή και ανοσοκαταστολή (Vijayan et al., 2017; Jacobson et al., 2019). Αντίθετα, σε ορισμένα κύτταρα ή όργανα, η χαμηλή δραστηριότητα NT5C2 που λαμβάνεται με σίγηση, δεν ήταν σε θέση να προκαλέσει σημαντική συσσώρευση AMP, δημιουργώντας κάποιες αμφιβολίες για τον μηχανισμό που συνδέει τη χαμηλή δραστηριότητα NT5C2 και τις μεταβολικές συνέπειές της. Θα είναι πολύ ενδιαφέρον η περαιτέρω διερεύνηση αυτών των μοριακών μηχανισμών, καθώς η γνώση αυτού του θέματος θα υποστηρίξει την εφαρμογή των αναστολέων NT5C2 όχι μόνο στον καρκίνο αλλά και σε παθολογίες όπως το μεταβολικό σύνδρομο, η παχυσαρκία και ο διαβήτης. φλεγμονή και ανοσοκαταστολή (Vijayan et al., 2017; Jacobson et al., 2019). Αντίθετα, σε ορισμένα κύτταρα ή όργανα, η χαμηλή δραστηριότητα NT5C2 που λαμβάνεται με σίγηση, δεν ήταν σε θέση να προκαλέσει σημαντική συσσώρευση AMP, δημιουργώντας κάποιες αμφιβολίες για τον μηχανισμό που συνδέει τη χαμηλή δραστηριότητα NT5C2 και τις μεταβολικές συνέπειές της. Θα είναι πολύ ενδιαφέρον η περαιτέρω διερεύνηση αυτών των μοριακών μηχανισμών, καθώς η γνώση αυτού του θέματος θα υποστηρίξει την εφαρμογή των αναστολέων NT5C2 όχι μόνο στον καρκίνο αλλά και σε παθολογίες όπως το μεταβολικό σύνδρομο, η παχυσαρκία και ο διαβήτης. θέτοντας κάποιες αμφιβολίες για τον μηχανισμό που συνδέει τη χαμηλή δραστηριότητα του NT5C2 και τις μεταβολικές συνέπειές του. Θα είναι πολύ ενδιαφέρον η περαιτέρω διερεύνηση αυτών των μοριακών μηχανισμών, καθώς η γνώση αυτού του θέματος θα υποστηρίξει την εφαρμογή των αναστολέων NT5C2 όχι μόνο στον καρκίνο αλλά και σε παθολογίες όπως το μεταβολικό σύνδρομο, η παχυσαρκία και ο διαβήτης. θέτοντας κάποιες αμφιβολίες για τον μηχανισμό που συνδέει τη χαμηλή δραστηριότητα του NT5C2 και τις μεταβολικές συνέπειές του. Θα είναι πολύ ενδιαφέρον η περαιτέρω διερεύνηση αυτών των μοριακών μηχανισμών, καθώς η γνώση αυτού του θέματος θα υποστηρίξει την εφαρμογή των αναστολέων NT5C2 όχι μόνο στον καρκίνο αλλά και σε παθολογίες όπως το μεταβολικό σύνδρομο, η παχυσαρκία και ο διαβήτης.

Συνεισφορές Συγγραφέων

Οι MC, MG-G και MT συνέλαβαν τη γνώμη και έγραψαν το προσχέδιο χειρογράφου. Η SA και η RP συνέλεξαν αναφορές και σχεδίασαν το σχήμα. Όλοι οι συγγραφείς συζήτησαν το περιεχόμενο.

Χρηματοδότηση

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από τοπικές επιχορηγήσεις του Πανεπιστημίου της Πίζας (ex60 20).

Σύγκρουση συμφερόντων

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη απουσία εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.

Γενετική ποικιλότητα στις αποκρίσεις αζωτούχων λιπασμάτων και εκπομπή αερίων Ν στο σύγχρονο σιτάρι

• ¹ Τμήμα Επιστήμης Φυτών, Rothamsted Research, Harpenden, Ηνωμένο Βασίλειο
• ² Computational and Analytical Sciences, Rothamsted Research, Harpenden, Ηνωμένο Βασίλειο
• ³ Sustainable Agriculture Sciences, Rothamsted Research, Harpenden, Ηνωμένο Βασίλειο
• ⁴ Department of Crop Improvement and Resilience, NIAB, Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο

Οι καλλιέργειες αφομοιώνουν το άζωτο (Ν) ως αμμώνιο μέσω της οδού συνθετάσης γλουταμίνης/γλουταμινικής συνθάσης (GS/GOGAT) που είναι κεντρικής σημασίας για την πρόσληψη Ν και δυνητικά αντιπροσωπεύει ένα λαιμό φιάλης για την αποτελεσματικότητα χρήσης λιπάσματος Ν. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογήσει εάν υπάρχει γενετική ποικιλότητα για ικανότητα αφομοίωσης Ν στο σιτάρι και θα μπορούσε να αξιοποιηθεί για αναπαραγωγή. Τα φυτά σίτου γρήγορα, μέσα σε 6 ώρες, ανταποκρίθηκαν στην εφαρμογή N με αύξηση της δραστηριότητας GS. Αυτό δεν συνοδεύτηκε από αύξηση της αφθονίας μεταγραφής γονιδίου GS και μια σύγκριση των μοντέλων πρωτεΐνης GS1 και GS2 αποκάλυψε υψηλό βαθμό διατήρησης της αλληλουχίας. Η ανταπόκριση Ν μεταξύ δέκα ποικιλιών σιταριού αξιολογήθηκε με μέτρηση της δραστικότητας του ενζύμου GS, του αμμωνίου των ιστών των φύλλων και με μια δοκιμασία δίσκου φύλλου ως υποκατάστατο για αποπλαστική αμμωνία. Με βάση αυτά τα δεδομένα, Μια ομάδα υψηλού GS που εμφανίζει μια συνολική θετική απόκριση στο N θα μπορούσε να διακριθεί από μια αναποτελεσματική ομάδα με χαμηλό GS. Οι επακόλουθες μετρήσεις εκπομπών αερίων επιβεβαίωσαν την εκπομπή αμμωνίας των φυτών ως απόκριση στην εφαρμογή Ν και αποκάλυψαν επίσης εκπομπή N2O όταν το Ν παρεχόταν ως νιτρικό, κάτι που συμφωνεί με την τρέχουσα κατανόησή μας ότι το N2O είναι υποπροϊόν της αναγωγής νιτρικών. Συνολικά, τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι υπάρχει περιθώριο για τη βελτίωση της ικανότητας αφομοίωσης Ν στο σιτάρι και ότι δικαιολογούνται περαιτέρω έρευνες για τη ρύθμιση και το ρόλο του GS-GOGAT στην εκπομπή NH3. Ομοίως, η εκπομπή του κλιματικού αερίου N2O πρέπει να μειωθεί και η μελλοντική έρευνα θα πρέπει να επικεντρωθεί στην αξιολόγηση της οδού της αναγωγάσης των νιτρικών στο σιτάρι και στη διερεύνηση των επιλογών διαχείρισης λιπασμάτων. Οι επακόλουθες μετρήσεις εκπομπών αερίων επιβεβαίωσαν την εκπομπή αμμωνίας των φυτών ως απόκριση στην εφαρμογή Ν και αποκάλυψαν επίσης εκπομπή N2O όταν το Ν παρεχόταν ως νιτρικό, κάτι που συμφωνεί με την τρέχουσα κατανόησή μας ότι το N2O είναι υποπροϊόν της αναγωγής νιτρικών. Συνολικά, τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι υπάρχει περιθώριο για τη βελτίωση της ικανότητας αφομοίωσης Ν στο σιτάρι και ότι δικαιολογούνται περαιτέρω έρευνες για τη ρύθμιση και το ρόλο του GS-GOGAT στην εκπομπή NH3. Ομοίως, η εκπομπή του κλιματικού αερίου N2O πρέπει να μειωθεί και η μελλοντική έρευνα θα πρέπει να επικεντρωθεί στην αξιολόγηση της οδού της αναγωγάσης των νιτρικών στο σιτάρι και στη διερεύνηση των επιλογών διαχείρισης λιπασμάτων. Οι επακόλουθες μετρήσεις εκπομπών αερίων επιβεβαίωσαν την εκπομπή αμμωνίας των φυτών ως απόκριση στην εφαρμογή Ν και αποκάλυψαν επίσης εκπομπή N2O όταν το Ν παρεχόταν ως νιτρικό, κάτι που συμφωνεί με την τρέχουσα κατανόησή μας ότι το N2O είναι υποπροϊόν της αναγωγής νιτρικών. Συνολικά, τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι υπάρχει περιθώριο για τη βελτίωση της ικανότητας αφομοίωσης Ν στο σιτάρι και ότι δικαιολογούνται περαιτέρω έρευνες για τη ρύθμιση και το ρόλο του GS-GOGAT στην εκπομπή NH3. Ομοίως, η εκπομπή του κλιματικού αερίου N2O πρέπει να μειωθεί και η μελλοντική έρευνα θα πρέπει να επικεντρωθεί στην αξιολόγηση της οδού της αναγωγάσης των νιτρικών στο σιτάρι και στη διερεύνηση των επιλογών διαχείρισης λιπασμάτων. πράγμα που συμφωνεί με την τρέχουσα κατανόησή μας ότι το N2O είναι ένα υποπροϊόν της αναγωγής νιτρικών αλάτων. Συνολικά, τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι υπάρχει περιθώριο για τη βελτίωση της ικανότητας αφομοίωσης Ν στο σιτάρι και ότι δικαιολογούνται περαιτέρω έρευνες για τη ρύθμιση και το ρόλο του GS-GOGAT στην εκπομπή NH3. Ομοίως, η εκπομπή του κλιματικού αερίου N2O πρέπει να μειωθεί και η μελλοντική έρευνα θα πρέπει να επικεντρωθεί στην αξιολόγηση της οδού της αναγωγάσης των νιτρικών στο σιτάρι και στη διερεύνηση των επιλογών διαχείρισης λιπασμάτων. πράγμα που συμφωνεί με την τρέχουσα κατανόησή μας ότι το N2O είναι ένα υποπροϊόν της αναγωγής νιτρικών αλάτων. Συνολικά, τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι υπάρχει περιθώριο για τη βελτίωση της ικανότητας αφομοίωσης Ν στο σιτάρι και ότι δικαιολογούνται περαιτέρω έρευνες για τη ρύθμιση και το ρόλο του GS-GOGAT στην εκπομπή NH3. Ομοίως, η εκπομπή του κλιματικού αερίου N2O πρέπει να μειωθεί και η μελλοντική έρευνα θα πρέπει να επικεντρωθεί στην αξιολόγηση της οδού της αναγωγάσης των νιτρικών στο σιτάρι και στη διερεύνηση των επιλογών διαχείρισης λιπασμάτων.

Εισαγωγή

Το άζωτο (Ν) είναι απαραίτητο για την ανάπτυξη των φυτών και είναι ο πρωταρχικός παράγοντας για την απόδοση της καλλιέργειας και την ποιότητα των σιτηρών. Μία από τις κύριες προκλήσεις για τη σύγχρονη γεωργία είναι η μείωση της χρήσης Ν-λιπασμάτων, διατηρώντας ή αυξάνοντας την απόδοση των σιτηρών (Hirel et al., 2011; Hawkesford, 2014). Επί του παρόντος, η ποσότητα του εφαρμοζόμενου λιπάσματος που απαιτείται για την επίτευξη της δυνητικής απόδοσης σιταριού στο Ηνωμένο Βασίλειο, η οποία υπολογίζεται σε 20 τόνους εκτάριο ^–1 , κυμαίνεται από 150 kg έως 350 kg ha ^–1.(Mitchell and Sheehy, 2018). Ωστόσο, γενικά λιγότερο από το μισό του εφαρμοζόμενου λιπάσματος N αφομοιώνεται από τις καλλιέργειες (Masclaux-Daubresse et al., 2010) και η απορροή περίσσειας N μολύνει τους υδάτινους δρόμους και προκαλεί εκπομπή αερίου αμμωνίας (NH3) και του ισχυρού νιτρώδους αερίου του θερμοκηπίου. οξείδιο (N2O) από μικροβιακές δραστηριότητες του εδάφους (Linquist et al., 2012; Gao et al., 2019).

Τα φυτά έχουν αναπτύξει εξελιγμένα και υψηλά ρυθμιζόμενα συστήματα πρόσληψης Ν. ^{Οι οικογένειες γονιδίων που κωδικοποιούν μεταφορείς NO3 –} και NH4 χαμηλής και υψηλής συγγένειας , αντίστοιχα, έχουν εντοπιστεί σε διαφορετικά είδη φυτών και βρίσκονται στις ρίζες, για πρωτογενή λήψη Ν και σε άλλα όργανα για εσωτερική κατανομή και αποθήκευση (για μια ανασκόπηση βλ. Li et al., 2017). Μόλις μπει στο εργοστάσιο, το NO3 ^– μειώνεται σε NH4 με νιτρική αναγωγάση (NR) και αναγωγάση νιτρωδών (NiR) (Campbell, 1988) η οποία στη συνέχεια αφομοιώνεται από τον κύκλο συνθετάσης γλουταμίνης-γλουταμινικής συνθάσης (GS-GOGAT), δημιουργώντας γλουταμίνη (Balotf et al., 2016). Ο κύκλος GS-GOGAT είναι επομένως κεντρικός στην ικανότητα των φυτών να αφομοιώνουν και να χρησιμοποιούν το Ν (π.χ. Bernard and Habash, 2009· Thomsen et al., 2014).

Τα γονίδια στο μονοπάτι GS-GOGAT έχουν μελετηθεί με κάποια λεπτομέρεια, αποκαλύπτοντας ότι η συνθετάση της γλουταμίνης εμφανίζεται σε δύο κύριες μορφές, η μία εντοπισμένη στο κυτταρόπλασμα (GS1) και η άλλη εντοπισμένη στον χλωροπλάτη (GS2) (García-Gutiérrez et al., 2018). Στα διπλοειδή φυτά, το GS1 κωδικοποιείται συνήθως από τρία έως πέντε γονίδια, τα οποία εκφράζονται κυρίως στους αγγειακούς ιστούς και εμπλέκονται στη δημιουργία γλουταμίνης για τη διακυτταρική μεταφορά Ν (Brugiére et al., 1999; Tabuchi et al., 2005; Cánovas et al., 20 Bernard et al., 2008). Αντίθετα, το GS2 κωδικοποιείται γενικά από ένα μόνο γονίδιο και βρίσκεται σε χλωροπλάστες και μιτοχόνδρια σε πράσινους ιστούς (Tingey et al., 1988· Taira et al., 2004). Η χλωροπλαστική ισομορφή GS2 αφομοιώνει το λίπασμα NH4 και NH4 generated by nitrate reduction and photorespiration in leaves, whereas the cytosolic GS1 isoform is the major form present in roots for primary N assimilation from soil (Lam et al., 1996; Ishiyama et al., 2004). GS1 is also the isoform mainly responsible for N remobilisation during leaf senescence and grain filling (Zhang Z. et al., 2017). In wheat, an initial study had identified ten GS cDNA sequences classified into four subfamilies (GS2, GS1, GSr, and GSe; Bernard et al., 2008). Gene names for the GS1 genes were subsequently updated to GS1;1, GS1;2, and GS1;3 (Wei et al., 2021a) and detailed gene expression and immunolocalisation studies of the proteins showed tissue-specific expression and differential N responsiveness of the individual genes (Wei et al., 2020, 2021b).

Μια σειρά φυτικών ειδών έχουν τροποποιηθεί για να υπερεκφράζουν το κυτοσολικό GS1, ακολουθώντας διαφορετικές στρατηγικές όσον αφορά τον χρησιμοποιούμενο προαγωγέα και την επιλογή διαγονιδίου (για ανασκόπηση βλέπε Thomsen et al., 2014· Li et al., 2017). Τα αποτελέσματα αυτών των μελετών ήταν ποικίλα, αλλά υπογράμμισαν τη σημασία του κυτοσολικού GS1 για την αποτελεσματική αφομοίωση του Ν, την ανάπτυξη των φυτών και τη συσσώρευση βιομάζας. Για παράδειγμα, στο κριθάρι έχει αποδειχθεί ότι η cis-γονιδιακή υπερέκφραση του HvGS1-1 βελτίωσε την απόδοση των κόκκων και την αποτελεσματικότητα χρήσης αζώτου (NUE), κάτι που είναι ενθαρρυντικό (Gao et al., 2019). Υπό το πρίσμα της σημασίας αυτής της οδού, υπάρχουν απροσδόκητα λίγες μελέτες που έχουν διερευνήσει εάν υπάρχει φυσική διακύμανση στη δραστηριότητα του ενζύμου GS. Στοιχεία για αυτό έχουν παρασχεθεί σε μελέτες σε ρύζι (Kumagai et al., 2011a,b) και ντομάτα (Sánchez-Rodríguez et al., 2011), και μια πρόσφατη μελέτη στο σκληρό σιτάρι έδειξε διαφορές στη δραστηριότητα του GS και στην έκφραση του γονιδίου GS σε γονότυπους με αντίθετη περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη κόκκου (Nigro et al., 2016). Στην παρούσα μελέτη, συμπληρώνουμε αυτά τα ευρήματα με μια συγκριτική μελέτη της δραστηριότητας του ενζύμου GS και της γονιδιακής έκφρασης ως απόκριση στο λίπασμα Ν σε δέκα γονότυπους σιταριού ψωμιού, παρέχοντας περαιτέρω στοιχεία ότι υπάρχει φυσική παραλλαγή που μπορεί να αξιοποιηθεί για αναπαραγωγή.

Ενώ το NH4 είναι απαραίτητο για την ανάπτυξη και την ανάπτυξη των φυτών, σε υψηλές μικρομοριακές συγκεντρώσεις είναι τοξικό (Britto and Kronzucker, 2002) και έχει προταθεί ότι η ανοχή σχετίζεται με την ικανότητα αφομοίωσης του Ν (Cruz et al., 2006). Η τοξικότητα του αμμωνίου μπορεί να οδηγήσει στην αναστολή της ανάπτυξης των ριζών και των βλαστών και στη χλώρωση των φύλλων, και έχει συσχετιστεί με ιοντικές ανισορροπίες, διαταραχή των βαθμίδων pH στις πλασματικές μεμβράνες και οξειδωτικό στρες (Gerendás et al., 1997; Britto and Kronzucker, 2002; Bittsánszky et al., 2015· Esteban et al., 2016· Li et al., 2017). Υψηλά επίπεδα ενδοκυτταρικής NH4 μπορεί επίσης να συσσωρευτεί μέσω εσωτερικών διεργασιών του φυτού, όπως η βιοσύνθεση λιγνίνης, η αποικοδόμηση πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων και η φωτοαναπνοή (Taira et al., 2004; Carvalho et al., 2011; Kumagai et al., 2011b; Bittsánszky et al., 2015· Melino et al., 2018), με τα δύο τελευταία να σχετίζονται ιδιαίτερα με τη γήρανση και το στρες, όπως η ξηρασία ή το υψηλό φως. Είναι σημαντικό ότι έχει ήδη αποδειχθεί ότι η δραστηριότητα του GS διακυβεύεται υπό το στρες ξηρασίας, για παράδειγμα, και επομένως είναι σημαντικό να εντοπιστούν γονότυποι που διατηρούν τη δραστηριότητα GS-GOGAT υπό πίεση για την πρόληψη της κυτταρικής βλάβης και τη διατήρηση της ανάπτυξης (Sánchez-Rodríguez et al., 2011).

Ενώ η σημασία της εκπομπής αερίου Ν από εντατικά γεωργικά εδάφη είναι ευρέως γνωστή και πρόσφατα κέρδισε εκ νέου την προσοχή σε σχέση με το εξελισσόμενο πεδίο των μελετών μικροβιώματος, είναι λιγότερο ευρέως γνωστό ότι η εκπομπή αερίου N εμφανίζεται επίσης από φυτά. Αποπλαστικό NH4 και η εκπομπή NH3 παρουσιάστηκε για πρώτη φορά πριν από περισσότερα από 20 χρόνια σε μελέτες στο κριθάρι (Mattsson and Schjoerring, 1996; Mattsson et al., 1997; Pearson et al., 1998), στο σιτάρι (Parton et al., 1988a,b; Morgan and Parton, 1989), ελαιοκράμβη (Husted and Schjoerring, 1995) και χόρτα (Heckathorn and DeLucia, 1995· Hanstein and Felle, 1999· Mattsson and Schjoerring, 2002· van Hove et al., 2002· Loubet, 2002, 2). , και πιο πρόσφατα επίσης στο ρύζι (Kumagai et al., 2011a). Οι πρώτες αναφορές για την εκπομπή N2O από τα φυτά προήλθαν από μελέτες στον καπνό (Goshima et al., 1999; Hakata et al., 2003) και στο σιτάρι (Smart and Bloom, 2001) και αυτό επιβεβαιώθηκε σε πιο πρόσφατες μελέτες στο σιτάρι (Baruah et al. ., 2012), καθώς και στο ρύζι (Gogoi and Baruah, 2012) και στα χόρτα (Bowatte et al., 2014). Επιπλέον, μια εκτενής μελέτη που διεξήχθη από τους Lenhart et al.

Συνολικά, υπάρχει επαρκής αιτιολόγηση για περαιτέρω διερεύνηση της ποικιλομορφίας της ικανότητας αφομοίωσης N στις καλλιέργειες και αυτό έχει αποκτήσει σημασία όσον αφορά τις εκπομπές αερίων που εμπλέκονται στην κλιματική αλλαγή. Σε αυτή τη μελέτη αξιολογήσαμε επομένως την αλληλική παραλλαγή στα γονίδια GS, τη δραστηριότητα του ενζύμου GS και την εκπομπή N-αερίου εντός του βρετανικού σιταριού ψωμιού για να διερευνήσουμε, σε μια ήδη εκλεκτή δεξαμενή βλαστικού πλάσματος, εάν υπάρχει γενετική ποικιλότητα που μπορεί να αξιοποιηθεί για τη βελτίωση της NUE και τη μείωση της N- εκπομπή αερίων. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται υποδεικνύουν ότι υπάρχουν θεμελιώδεις διαφορές στην ικανότητα αφομοίωσης του Ν και στη δραστηριότητα GS εντός του σύγχρονου σίτου ελίτ. Τα δεδομένα επιβεβαιώνουν επίσης ότι το σιτάρι εκπέμπει αέρια N ως απόκριση στην εφαρμογή αμμωνίας και νιτρικών λιπασμάτων και ότι η εκπομπή N2O συνδέεται με νιτρικά.

Υλικά και μέθοδοι

Φυτικό Υλικό και Συνθήκες Ανάπτυξης

Δέκα ποικιλίες σιταριού του Ηνωμένου Βασιλείου (Triticum aestivum L.) χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, συμπεριλαμβανομένων δύο ποικιλιών σιταριού ανοιξιάτικου τύπου (Cadenza και Paragon) και οκτώ ποικιλίες χειμερινού σίτου (Alchemy, Brompton, Claire, Hereward, Rialto, Robigus, Soissons, και XL-19). Οι ποικιλίες χειμερινού σιταριού επιλέχθηκαν επειδή χρησιμοποιήθηκαν ως γονείς για την ανάπτυξη ενός πληθυσμού «ελίτ MAGIC» (Mackay et al., 2014) και οι σπόροι παρασχέθηκαν από το NIAB, Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο. Οι σπόροι των ποικιλιών σιταριού είναι διαθέσιμοι στο Rothamsted Research, Harpenden, Ηνωμένο Βασίλειο.

Οι σπόροι αποστειρώθηκαν επιφανειακά με 100% EtOH για 2 λεπτά και 5% λευκαντικό για 15 λεπτά. Μετά από 5 φορές πλύση με αποστειρωμένο νερό, οι σπόροι βλάστησαν σε υγρό διηθητικό χαρτί σε θερμοκρασία δωματίου (RT) για 7 ημέρες πριν μεταφερθούν σε πλαστικά δοχεία (9 × 9 × 10 cm για τη μελέτη γενετικής ποικιλότητας, 13 × 10 × 11 cm για το πείραμα εκπομπής αερίων, (βλ. παρακάτω) που περιέχει μείγμα γλάστρας που αποτελείται από 75% τύρφη μεσαίας ποιότητας, 12% αποστειρωμένη πηλίδα, 3% μεσαίου βαθμού βερμικουλίτη, 10% κόκκο (5 mm κοσκινισμένο, χωρίς ασβέστη), 3,5 kg m -3 ^Osmocote Exact (σύνολο N 16%) (Προμηθευτής: Scotts UK Professional, Ipswich, Suffolk, Ηνωμένο Βασίλειο) και 0,5 kg m ^–3Σύνθετο λίπασμα PG (Προμηθευτής: Yara UK Ltd., Harvest House, Europarc, Grimsby, North East Lincolnshire). Για την εκπομπή N-αερίου χρησιμοποιήθηκε το ίδιο μείγμα γλάστρας αλλά χωρίς Osmocote (βλ. παρακάτω). Οι γλάστρες τοποθετήθηκαν σε πάγκους σε ένα θερμοκήπιο ελεγχόμενου περιβάλλοντος και τα φυτά αναπτύχθηκαν στους 22°C/16°C (ημέρα/νύχτα) με 16 ώρες φως. Για να διατηρηθεί η ένταση του φωτός πάνω από 400 μmol m ^–2 s ^–1 , συμπληρωματικό φως τροφοδοτήθηκε από φωτισμό SON-T όπως απαιτείται. Τα φυτά ποτίζονται καθημερινά από τον πυθμένα με νερό βρύσης.

Πείραμα μαθήματος N-Response Time

To assess temporal GS enzyme activity in response to N-fertiliser application, an initial time course experiment was conducted with the two spring wheat varieties Cadenza and Paragon. Plants were grown as described above in a completely randomised design. At the 2–3 tiller vegetative stage each pot was supplied with NH4NO3 equivalent to 150 kg N ha^–1 (0.345 g NH4NO3) and 250 kg N ha^–1 (0.575 g NH4NO3), respectively, dissolved in 50 ml distilled water.

The calculation was based on pot area (cm²)/ha * amount of N fertiliser * % of the N content of the fertiliser.

N was applied at 10 a.m. and the youngest fully expanded leaf from six replicate plants for each treatment were harvested at 2, 6, 24, and 30 h after N application and immediately frozen in liquid N and stored at −80°C for further analysis. Water was supplied to control plants which were always sampled in parallel.

Dry-Down Experiment

Για να εκτιμηθεί η επίδραση της καταπόνησης νερού στις αποκρίσεις Ν, διεξήχθη ένα πείραμα ξηράνσεως σε δοχείο με Cadenza και Paragon. Τα φυτά αναπτύχθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω και ποτίζονται καθημερινά από τον πυθμένα με νερό βρύσης. Στο στάδιο 3-4 των φυτών, το πότισμα διακόπηκε για ένα υποσύνολο των φυτών για να προκληθεί υδατική καταπόνηση. Σε μια πιλοτική μελέτη, η περιεκτικότητα σε νερό των φύλλων μετρήθηκε κατά την περίοδο ξηρασίας ως δείκτης υδατικής καταπόνησης. Για αυτό, τα δειγματοληπτικά φύλλα ζυγίστηκαν (W) πριν από την επώαση σε νερό βρύσης για 3-4 ώρες στο φως σε RT. Μετά το χτύπημα των φύλλων τα ξηρά φύλλα ζυγίστηκαν (TW) και τα δείγματα ξηράνθηκαν σε φούρνο 80°C για 24 ώρες και προσδιορίστηκε το ξηρό βάρος (DW). Η σχετική περιεκτικότητα σε νερό υπολογίστηκε ως RWC (%) = [(W-DW)/ (TW-DW)] × 100. Για τα επόμενα πειράματα, συλλέχθηκαν δείγματα στις 72 ώρες μετά το τέλος του ποτίσματος,

Πείραμα γενετικής ποικιλότητας

Οκτώ ποικιλίες χειμερινού σιταριού (βλέπε παραπάνω), εκτός από τις Paragon και Cadenza, αναπτύχθηκαν σε ένα τυχαιοποιημένο σχέδιο πλήρους μπλοκ με έξι επαναλήψεις για κάθε επεξεργασία στο θερμοκήπιο όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα φυτά σε βλαστική κατάσταση (φυτά ηλικίας 4-5 εβδομάδων) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το ισοδύναμο 250 kg N ha ^-1παρέχονται ως NH4NO3 (0,575 g ανά δοχείο) και ουρία (0,264 g ανά δοχείο), αντίστοιχα, διαλυμένα σε 50 ml απιονισμένου νερού. Απιονισμένο νερό χορηγήθηκε στις εγκαταστάσεις ελέγχου. Τα φυτά υποβλήθηκαν σε επεξεργασία στις 10 π.μ. και το νεότερο πλήρως διογκωμένο φύλλο μεμονωμένων φυτών συγκομίστηκε πριν από (0 h) και στις 6 και 30 ώρες μετά την εφαρμογή Ν. Τα φυτά ελέγχου δειγματοληπτούνταν πάντα παράλληλα. Λήφθηκαν δείγματα για τη δοκιμασία αμμωνίου φύλλου δίσκου (βλέπε παρακάτω) και μεταφέρθηκαν απευθείας σε ρυθμιστικό. Το υπόλοιπο φύλλο καταψύχθηκε σε υγρό Ν και αποθηκεύτηκε στους -80°C για αναλύσεις της δραστηριότητας του GS και ποσοτικοποίηση του αμμωνίου των ιστών (βλ. παρακάτω).

Πείραμα πεδίου

Η τοποθεσία του αγρού βρισκόταν στο Πειραματικό Αγρόκτημα Rothamsted (Harpenden, Ηνωμένο Βασίλειο) και χρησιμοποιούσε τη μακροπρόθεσμη Δοκιμή Ποικιλομορφίας του Δικτύου Γενετικής Βελτίωσης Σιτάρι (WGIN), η οποία ήταν στο 16ο έτος τη στιγμή αυτού του πειράματος (2019). Το πείραμα διαμορφώθηκε ως ένα πλήρως τυχαιοποιημένο σχέδιο χωρισμένης επιφάνειας, με τρεις επαναλήψεις. Οικόπεδα (1,8 × 9 m) σπάρθηκαν στις 10/09/2018 και χρησιμοποιήθηκαν τυπικά πρωτόκολλα αγροκτημάτων για την προστασία των καλλιεργειών. Εφαρμόστηκαν τρία επίπεδα γονιμοποίησης Ν σε τρεις διαιρέσεις, που ανέρχονται σε συνολικές εποχιακές δόσεις Ν ισοδύναμες με 100 (N1), 200 (N2) και 350 (N3) kg N ha –1, ^{αντίστοιχα} . Για την παρούσα μελέτη, δύο επιλεγμένες ποικιλίες (Cadenza και Paragon) δειγματολήφθηκαν από τα τρία επαναλαμβανόμενα οικόπεδα N1 και N3, ακριβώς πριν από (T0) και σε 48 ώρες μετά την εφαρμογή του δεύτερου διαχωρισμού Ν (50 kg N ha^–1 for N1; 250 kg N ha^–1 for N3). Both plots had previously received 50 kg N in the first split application (February) and received a final, third split application of 50 kg N in May. Leaf samples of six randomly selected plants from each plot were immediately frozen in liquid N and stored at −80°C for further analysis.

Measuring N-Gas Emission Using a Picarro Gas Analyser

Τρεις επιλεγμένοι γονότυποι (Cadenza, Paragon και Claire) αναπτύχθηκαν υπό ελεγχόμενες συνθήκες όπως περιγράφεται παραπάνω σε ένα τυχαιοποιημένο σχέδιο πλήρους μπλοκ για τη μέτρηση της εκπομπής αερίου Ν χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή αερίων θερμοκηπίου Picarro G2508 (Picarro Inc., Santa Clara, CA, Ηνωμένες Πολιτείες) . Σπορόφυτα μιας εβδομάδας μεταμοσχεύθηκαν σε γλάστρες (13 × 10 × 11 cm) με μείγμα γλάστρας (βλ. παραπάνω) χωρίς πρόσθετα θρεπτικά συστατικά. Μετά από 24 ώρες, τα φυτά τροφοδοτήθηκαν με ένα τροποποιημένο διάλυμα Letcombe σύμφωνα με τους Masters-Clark et al. (2020). Για την επεξεργασία χαμηλού Ν, 0,325 ml ΚΝΟ3 (1,6 Μ) προσφέρθηκαν σε κάθε δοχείο και 3,25 ml για την επεξεργασία υψηλού Ν. Κάθε δοχείο έλαβε την ίδια ποσότητα P (3,25 ml, 0,17 M KH2PO4) και μικροθρεπτικά συστατικά (Masters-Clark et al., 2020). Τα φυτά διατηρήθηκαν καλά ποτισμένα με νερό βρύσης. Για τη μέτρηση αερίου,^–1Το N παρέχεται είτε ως KNO3 είτε ως NH4NO3. Δόθηκε νερό στους ελέγχους. Η επιφάνεια του εδάφους κάθε γλάστρας καλύφθηκε με αλουμινόχαρτο και μεμβράνη προσκόλλησης πριν τοποθετηθούν οι διάφανοι θάλαμοι Picarro από πλεξιγκλάς και σφραγιστούν με ταινία. Ως έλεγχος του εδάφους, χρησιμοποιήθηκαν γλάστρες από τις οποίες αφαιρέθηκε η υπέργεια φυτική βιομάζα για να ληφθούν υπόψη τυχόν εκπομπές που προέρχονται από τις ρίζες ή/και το μικροβίωμα του εδάφους. Αυτές οι γλάστρες αντιμετωπίστηκαν με τον ίδιο τρόπο όπως οι γλάστρες με φυτά. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε σε έξι επαναλήψεις για κάθε γονότυπο και θεραπεία. Το όργανο Picarro ρυθμίστηκε ώστε να μετρά δεκαέξι θαλάμους για 3:49 λεπτά το καθένα διαδοχικά και επανειλημμένα για 24 ώρες. Τα δεδομένα εξόδου από το G2508 ήταν κατά μέσο όρο κάθε 2 δευτερόλεπτα ως ξηρό μοριακό κλάσμα σε ppb για το αέριο NH3 και ppm για το N2O. Ο ρυθμός ροής μεταξύ του G2508 και του δοχείου επώασης και του θαλάμου ήταν 250 mL min^–1 με χρήση εξωτερικής αντλίας κενού χαμηλής διαρροής. Στο τέλος του πειράματος, η υπέργεια βιομάζα ξηράνθηκε σε φούρνο στους 80°C για 24 ώρες για να προσδιοριστεί το ξηρό βάρος, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση των μέγιστων εκπομπών αερίων NH3 και N2O.

Πραγματοποιήθηκε ένα δεύτερο πείραμα για να συγκριθούν το Cadenza και το Paragon με ένα ελίτ σιτάρι από ένα περιβάλλον συγκρίσιμα χαμηλού N και για αυτό χρησιμοποιήθηκε η ποικιλία Mace (AGT, Αυστραλία). Το πείραμα διεξήχθη όπως περιγράφηκε παραπάνω εκτός από το ότι τα φυτά αναπτύχθηκαν υπό συνθήκες υψηλού Ν σε μείγμα γλάστρας συμπληρωμένο με Osmocote (βλ. παραπάνω). Τα φυτά υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ισοδύναμο 250 kg N ha ^–1 που παρέχεται ως NH4NO3. Δόθηκε νερό στους ελέγχους.

Πραγματοποιήθηκε ένα τρίτο πείραμα για να διερευνηθεί εάν η εκπομπή αερίου N2O προέρχεται από αναγωγή νιτρικών και/ή αφομοίωση αμμωνίας. Για αυτό, τα φυτά Cadenza αναπτύχθηκαν σε συνθήκες χαμηλού N όπως περιγράφεται παραπάνω και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ισοδύναμο 250 kg N ha ^-1 που παρέχεται ως ουρία και KNO3 αντίστοιχα με και χωρίς 150 μM θειικού βολφραμίου αναστολέα νιτρικής αναγωγάσης (NI). Δόθηκε νερό στους ελέγχους.

Δοκιμασία ενζύμου συνθετάσης γλουταμίνης

Η συνολική (συνδυασμένη GS1 και GS2) εκχυλίσσιμη δραστηριότητα GS προσδιορίστηκε σε 100 mg αλεσμένου υλικού φρέσκων φύλλων που εκχυλίστηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα 1 mL που περιέχει 25 mM TRIS–HCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2, 0,2 g πολυβενυλοπυρρολιδόνης και 2 mM λευπεπτίνη, ρΗ 7,6. Η δραστηριότητα GS μετρήθηκε σύμφωνα με τους O’Neal και Joy (1974) με επώαση 50 μl εκχυλισμάτων φύλλων σε μέσο ανάλυσης που περιείχε 600 mM γλουταμικό, 45 mM υδροχλωρική υδροξυλαμίνη, 150 mM MgSO4*7H2O, 30 mM A, και EDTA-60Na για 30 λεπτά στους 30°C σε επωαστήρα αναδευτήρα. Η ενζυμική αντίδραση τερματίστηκε με 300 μl διαλύματος διακοπής (0,67 Μ FeCl3, 0,2 Μ TCA, 0,7 Μ HCl). Μετά από φυγοκέντρηση (5 λεπτά, 13.000 χ g) η οπτική πυκνότητα των υπερκειμένων μετρήθηκε στα 540 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο Jenway 6715 UV/Vis.

Μετρήσεις αμμωνίου φύλλου-δίσκου

Για την παρούσα μελέτη, ένα πρωτόκολλο για την εκχύλιση αποπλαστικού αμμωνίου (Husted and Schjoerring, 1995) τροποποιήθηκε και αναφερόμαστε σε αυτή τη μέθοδο ως δοκιμασία αμμωνίου «φύλλου-δίσκος».

Για αυτό, τέσσερις δίσκοι φύλλων (διάμετρος 5 mm) από τη μέση ενός πλήρως διογκωμένου φύλλου κόπηκαν με διάτρηση και αμέσως βυθίστηκαν σε 1 ml ισοτονικού διαλύματος σορβιτόλης (0,28 Μ) σε σωλήνα Eppendorf. Τα δείγματα επωάστηκαν στους 4°C για 24 ώρες πριν από τη διήθηση υπό κενό σε ξηραντήρα (DURAN, DN 150) για 2 λεπτά σε πίεση 4 atm. Σε αντίθεση με το δημοσιευμένο πρωτόκολλο, οι δίσκοι φύλλων φυγοκεντρήθηκαν εντός του διαλύματος σορβιτόλης (2.000 × g, 5 λεπτά, 4°C) και χρησιμοποιήθηκαν δείγματα (10 μl) του υπερκειμένου για τη μέτρηση της συγκέντρωσης NH4 χρησιμοποιώντας το κιτ Megazyme ^rapid Ammonia (Κ-ΑΜΙΑΡ 18/04). Αυτή η ανάλυση βασίζεται στην αναγωγική αμίνωση του 2-οξογλουταρικού με γλουταμική αφυδρογονάση (GDH) και NADPH. Οι δοκιμές πραγματοποιούνταν πάντα με δύο τεχνικά αντίγραφα και η συγκέντρωση αμμωνίου κανονικοποιήθηκε στο βάρος του φύλλου-δίσκου.

Η απουσία κυτταροπλασματικής μόλυνσης του εκχυλίσματος δίσκου φύλλου με κυτταρόπλασμα επιβεβαιώθηκε με μέτρηση της δραστικότητας του ενζύμου GS (βλέπε παρακάτω) και της δραστικότητας του ενζύμου κυτταροζολικής γλυκόλυσης G6PDH σύμφωνα με τους Lohr και Waller (1974). Εν συντομία, η δραστηριότητα του G6PDH μετράται σε ένα φασματοφωτόμετρο μετά την αναγωγή του NADP σε διάλυμα που περιέχει 66 mM KH2PO4/K2HPO4 (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 300 mM NADP, 2 mM 6-φωσφορική γλυκόζη και 106Pl εκχυλίσματα ιστού φύλλων σε τελικό όγκο 300 μl. Η δραστικότητα G6PDH στα δείγματα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας μια τυπική καμπύλη για NADPH στα 340 nm (Spectra 340PC αναγνώστης πλακών). Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν σε δύο τεχνικά αντίγραφα.

Ποσοτικοποίηση αμμωνίου, νιτρικού, γλουταμίνης και ολικής πρωτεΐνης στον ιστό των φύλλων

Για να προσδιοριστεί η συγκέντρωση NH4 στον ιστό των φύλλων, 100 mg πλήρως διογκωμένων δειγμάτων φύλλων αλέστηκαν σε υγρό άζωτο και επωάστηκαν σε 1 ml 0,05M H2SO4 σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Το ομογενοποίημα φυγοκεντρήθηκε στα 13.000 × g για 15 λεπτά σε RT και το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για να ποσοτικοποιηθεί το NH4 χρησιμοποιώντας το κιτ αμμωνίας Megazyme rapid (K-AMIAR 04/18) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Η περιεκτικότητα σε νιτρικά άλατα στα φύλλα προσδιορίστηκε σε υδατικά εκχυλίσματα 100 mg αλεσμένου ιστού φύλλων σύμφωνα με τους Zhao και Wang (2017). Τα δείγματα αναμίχθηκαν με 100 μl απιονισμένου νερού και έβρασαν στους 100°C για τουλάχιστον 20 λεπτά. Απιονισμένο νερό (0,1 ml) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Μετά από φυγοκέντρηση στα 15.871 × g για 10 λεπτά, το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε νέο σωλήνα και προστέθηκαν 40 μl σαλικυλικού οξέος-θειικού οξέος. Η αντίδραση επωάστηκε σε RT για 20 λεπτά πριν προστεθούν 0,95 ml διαλύματος NaOH 8% (w/v) και οι σωλήνες αφέθηκαν να ψυχθούν σε RT για 20-30 λεπτά. Η τιμή OD410 κάθε δείγματος μετρήθηκε σε φασματοφωτόμετρο και χρησιμοποιήθηκε νερό ως τυφλό. Η συγκέντρωση νιτρικών υπολογίστηκε ως Y = CV/W [Y: περιεκτικότητα σε νιτρικά (μg/g); C: συγκέντρωση νιτρικών που υπολογίστηκε με OD410 χρησιμοποιώντας μια εξίσωση παλινδρόμησης από την τυπική καμπύλη (μg/ml). V: συνολικός όγκος του εκχυλισθέντος δείγματος (ml). W: βάρος δείγματος (g)].

Η γλουταμίνη εκχυλίστηκε από κατεψυγμένα, αλεσμένα δείγματα φύλλων 50 mg με 0,5 ml 80% EtOH για 3 ώρες στους 40°C σε θερμαντικό μπλοκ και φυγοκεντρήθηκε στα 10.000 χ g για 15 λεπτά σε ΘΔ. Το υπερκείμενο υγρό (10 μl) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε L-γλουταμίνη των φύλλων χρησιμοποιώντας το κιτ L-glutamine/ammonia rapid της Megazyme (K-GLNAM 04/17). Τα δείγματα κανονικοποιήθηκαν στα 100 mg FW.

Η συγκέντρωση της συνολικής διαλυτής πρωτεΐνης στα φύλλα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Bradford με πρότυπο BSA (Bradford, 1976).

Γονίδια συνθετάσης γλουταμίνης σε πέντε γονιδιώματα σίτου

Οι γονιδιωματικές αλληλουχίες των γονιδίων GS1 και GS2 σιταριού ανακτήθηκαν αρχικά από το γονιδίωμα αναφοράς της κινεζικής Spring (IWGSC, INSDC Assembly GCA_900519105.1; Ιούλιος 2018) που διατίθεται στο Ensembl Plants. ¹ Οι αριθμοί προσχώρησης παρέχονται στον Πίνακα 1. Οι εκπρόσωποι των διαφορετικών ομολόγων GS1 και GS2 χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για μια αναζήτηση BLASTp στο Ensembl Plants για να διασφαλιστεί ότι όλα τα γονίδια GS και οι ομοιολόγοι είχαν ταυτοποιηθεί. Αυτή η αναζήτηση αποκάλυψε ένα πρόσθετο ομοιόλογο GS1 χαμηλής εμπιστοσύνης (LC) στο χρωμόσωμα 6D. Η χρωμοσωμική θέση των μεμονωμένων αλληλουχιών προήλθε από το Ensembl Plants. Οι γονιδιωματικές αλληλουχίες των αντιπροσωπευτικών ομοιολόγων της κινεζικής Spring GS1 και GS2 χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για μια αναζήτηση BLASTn των διαθέσιμων γονιδιωματικών ικριωμάτων τεσσάρων ποικιλιών σίτου (Cadenza, Paragon, Robigus και Claire) ²και ένα τετραπλοειδές σκληρό σιτάρι (Kronos) (εκδόσεις ακολουθίας 2018-02-19). ³Τα αναγνωρισμένα ικριώματα που περιέχουν γονίδιο GS ​​(Συμπληρωματικός Πίνακας 1) ευθυγραμμίστηκαν με τη γονιδιωματική αλληλουχία των αντίστοιχων γονιδιακών αλληλουχιών GS Chinese Spring χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο LASTZ του λογισμικού Geneious 10.2.3 και τις ευθυγραμμισμένες περιοχές με κάποιες πλευρικές περιοχές 5′ και 3′ εξήχθησαν. Τα μοντέλα γονιδίων προβλέφθηκαν ευθυγραμμίζοντας τις εξαγόμενες αλληλουχίες ικριώματος με την αντίστοιχη γονιδιωματική αλληλουχία της κινεζικής Spring, το μεγαλύτερο cDNA και τις αντίστοιχες περιοχές κωδικοποίησης (CDR) που ανακτήθηκαν από την Ensembl Plants. Η εκχύλιση των υποτιθέμενων CDR, η μετάφραση σε πρωτεΐνη και οι ευθυγραμμίσεις αλληλουχιών χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο MAFFT διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το Geneious 10.2.3. Μια σύγκριση των προβλεπόμενων αλληλουχιών πρωτεΐνης για τη δημιουργία ενός κυκλικού δέντρου έγινε στο Geneious. Πρόσθετα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης προήλθαν από τη βάση δεδομένων έκφρασης σίτου. ⁴

Πίνακας 1. Υποτιθέμενα γονίδια συνθετάσης γλουταμίνης (GS1 και GS2) από το γονιδίωμα αναφοράς Chinese Spring.

Ποσοτική RT-PCR

Ολικό RNA εκχυλίστηκε από κατεψυγμένα, αλεσμένα δείγματα φύλλων 50 mg χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΡΙζόλης (Invitrogen Cat Νο. 15596-026) (Chomczynski and Sacchi, 1987). Η ακεραιότητα του RNA επιβεβαιώθηκε σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 2% (β/ο) και η συγκέντρωση RNA ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο ND-1000 (NanoDrop Technologies, Ηνωμένες Πολιτείες). Η σύνθεση cDNA πραγματοποιήθηκε με 2 μg ολικού RNA ανά δείγμα χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση Invitrogen Superscript III με εκκινητές προσαρμογέα dT (Invitrogen, Ηνωμένο Βασίλειο) σε αντίδραση 20 μl σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η ποιότητα του cDNA επαληθεύτηκε με ενίσχυση PCR του γονιδίου ακτίνης (για αλληλουχίες εκκινητών βλέπε Πίνακα 2).

Πίνακας 2. Αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιούνται για ανάλυση qPCR.

Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των μεταγραφών γονιδίων, χρησιμοποιήθηκε το SYBR ^{® Green Jump Start™ Taq Ready Mix™ (Sigma-Aldrich, Ηνωμένο Βασίλειο) στο σύστημα PCR Real Time της Applied Biosystems 7500.} Κάθε αντίδραση 25 μl περιείχε 0,5 μl cDNA και 10 μΜ εμπρός και ανάστροφο εκκινητές, αντίστοιχα.

Για το σχεδιασμό εκκινητών, διεξήχθησαν λεπτομερείς συγκριτικές αναλύσεις αλληλουχιών νουκλεοτιδίων των προαναφερθεισών αλληλουχιών για τον εντοπισμό περιοχών ειδικών για γονίδιο και ομοιολόγο και τα ζεύγη εκκινητών τοποθετήθηκαν χειροκίνητα σε επιλεγμένες περιοχές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για τους σκοπούς αυτής της μελέτης, σχεδιάστηκαν εκκινητές στοχεύοντας περιοχές σε υψηλό βαθμό διατηρημένες εντός των γονιδίων GS2 και GS1, αντίστοιχα, με ανόπτηση και ενίσχυση των τριών ομολόγων GS2 μαζί, καθώς και των τριών γονιδίων GS1 και των αντίστοιχων ομοιολόγων τους σε συνδυασμό. Η αποτελεσματικότητα τουλάχιστον τριών ζευγών εκκινητών δοκιμάστηκε σε σειρές αραίωσης cDNA και η μέση απόδοση εκκινητών υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη γραμμική φάση όλων των μεμονωμένων καμπυλών ενίσχυσης αντίδρασης (Ramakers et al., 2003), που υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη συσκευασία LinRegPCR (Tuomi et al. , 2010). Τρία γονίδια αναφοράς οικιακής διατήρησης (Πίνακας 2) χρησιμοποιήθηκαν για την κανονικοποίηση της σχετικής ποσοτικοποίησης (NRQ) της έκφρασης (NE). Το NRQ του NE υπολογίστηκε σε σχέση με τις τιμές CT, την αποτελεσματικότητα εκκινητή (E) του γονιδίου στόχου (X) και το κανονικοποιητικό γονίδιο αναφοράς (N) ως κανονικοποιημένη σχετική έκφραση NRE χρησιμοποιώντας τον τύπο: NRE = (EX)- CT,X/(EN)CT,N σύμφωνα με τους Rieu και Powers (2009).

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική σημασία αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ANOVA και Student’s t-test στο Genstat 20th Edition (VSNi) και στο Microsoft Excel. Και για τα δύο, τα πειράματα ξηρασίας και γενετικής ποικιλότητας δεν συμπεριλήφθηκαν αποκλειστικοί όροι. Για τη δοκιμή πεδίου χρησιμοποιήθηκε το μπλοκ δομής μπλοκ/ολόκληρο το οικόπεδο/το οικόπεδο για να αντικατοπτρίζει τη δομή διαχωρισμού τεμαχίων της εφαρμογής Ν σε ολόκληρα οικόπεδα. Η γενετική ποικιλότητα και οι δοκιμές πεδίου αποτελούνταν από την τριμερή δομή παραγοντικής θεραπείας γονότυπος×θεραπεία×χρόνος. Το πείραμα ξηρασίας αποτελούνταν από τη δομή επεξεργασίας [βασική γραμμή/(χρόνος×θεραπεία)]×γονότυπος, όπου η βασική γραμμή είναι ενδεικτική του πρώτου χρονικού σημείου που λήφθηκε δειγματοληψία πριν από την εφαρμογή οποιασδήποτε επεξεργασίας. Όπου ενδείκνυται, οι μεταβλητές απόκρισης μετασχηματίστηκαν για να εξασφαλιστεί η ομοιογένεια της διακύμανσης, Συγκεκριμένα, η συγκέντρωση του αμμωνίου φύλλου-δίσκου αναλύθηκε στην κλίμακα της τετραγωνικής ρίζας και το αμμώνιο των ιστών αναλύθηκε στην κλίμακα του φυσικού λογαρίθμου. Μικρά επίπεδα έλλειψης σε αυτές τις τρεις μεταβλητές υπήρχαν στα τρία πειράματα και εκτιμήθηκαν επαναληπτικά μέσω της ANOVA. Το Student’s t-test εφαρμόστηκε για να ελεγχθεί η σημασία των διαφορών μεταξύ των δεδομένων από Cadenza και Paragon στο πείραμα της χρονικής πορείας και στην ανάλυση γονιδιακής έκφρασης. Για το φύλλο ΝΟ3 Το Student’s t-test εφαρμόστηκε για να ελεγχθεί η σημασία των διαφορών μεταξύ των δεδομένων από Cadenza και Paragon στο πείραμα της χρονικής πορείας και στην ανάλυση γονιδιακής έκφρασης. Για το φύλλο ΝΟ3 Το Student’s t-test εφαρμόστηκε για να ελεγχθεί η σημασία των διαφορών μεταξύ των δεδομένων από Cadenza και Paragon στο πείραμα της χρονικής πορείας και στην ανάλυση γονιδιακής έκφρασης. Για το φύλλο ΝΟ3^–και μετρήσεις γλουταμίνης, πραγματοποιήθηκε ανάλυση παλινδρόμησης και οι στατιστικές F που αναφέρονται είναι οι διαδοχικές στατιστικές F που σχετίζονται με την προσθήκη όρων στον χρόνο παραγγελίας, τη θεραπεία, τον γονότυπο και τις σχετικές αλληλεπιδράσεις υψηλότερης τάξης. Δοκιμάστηκαν διαφορετικές σειρές προσαρμογής και παρόλο που τα ποσοτικά αποτελέσματα παρουσίασαν οριακή απόκλιση, τα συμπεράσματα παρέμειναν ποιοτικά ίδια. Για τη συγκριτική ανάλυση της απόκρισης Ν σε δέκα γονότυπους, οι μέσες τιμές βασίστηκαν στον μετασχηματισμό δεδομένων sqrt (ακατέργαστη αμμωνία φύλλου-δίσκος δεδομένων) και log2 [LFoldChange = log2 (μέσος όρος θεραπείας/μάρτυρας)]. Για το πείραμα Picarro, η ANOVA χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των εκπομπών από το φυτό έναντι του εδάφους χρησιμοποιώντας τα ακατέργαστα δεδομένα. Για να συγκριθούν οι εκπομπές μεταξύ των γονότυπων και των αποτελεσμάτων της θεραπείας, πραγματοποιήθηκε ANOVA στα κανονικοποιημένα δεδομένα με δομή επεξεργασίας που αποτελείται από: Γονότυπος*(Trt_type/Treatment)*N.επίπεδο. Για να εξασφαλιστεί η ομοιογένεια της διακύμανσης, όλες οι μεταβλητές απόκρισης των δεδομένων μέγιστων εκπομπών μετατράπηκαν πρώτα σε log.

Αποτελέσματα

Χρονική Απόκριση της Γλουταμινικής Συνθετάσης στην Εφαρμογή Ν

Για να εκτιμηθεί η απόκριση της συνθετάσης γλουταμίνης (GS) σε εφαρμογή υψηλού N διεξήχθη ένα πείραμα χρονικής πορείας χρησιμοποιώντας τις ποικιλίες ανοιξιάτικου σίτου του Ηνωμένου Βασιλείου Cadenza και Paragon στο βλαστικό στάδιο που αναπτύχθηκε σε πλήρως γονιμοποιημένο μείγμα γλάστρας (Εικόνες 1Α, Β). Σημαντικές διαφορές στη δραστηριότητα του ενζύμου GS παρατηρήθηκαν με την πάροδο του χρόνου (F3,66 = 16,65, p lt; 0,001), με αυτή τη χρονική τάση να ποικίλλει τόσο με τη θεραπεία με Ν (F6,66 = 2,72, p = 0,02) όσο και με τον γονότυπο (F3,66 = 3,13, p = 0,031) Υπό συνθήκες ελέγχου (μηδέν επιπλέον N), η δραστηριότητα GS ήταν παρόμοια και στους δύο γονότυπους σε όλα τα χρονικά σημεία με δραστηριότητα GS περίπου 60 μmol GHA mg FW –1 h –1 NH4 ( ^{Εικόνες} 1A ^, B). Η εφαρμογή του ισοδύναμου 150 kg N ha ^–1(ως NH4NO3) αύξησε σημαντικά τη δραστηριότητα GS στις 2 ώρες και στις 30 ώρες στο Paragon (Εικόνα 1Α) ενώ δεν υπήρχε σημαντική απόκριση GS στο Cadenza σε αυτό το επίπεδο Ν (Εικόνα 1Β). Η εφαρμογή των υψηλότερων δόσεων N250 είχε σημαντική θετική επίδραση στη δραστηριότητα του GS στο Paragon στις 6 ώρες και στο Cadenza στις 30 ώρες, αυξάνοντας τη δραστηριότητα του GS σε περίπου 90 και 100 μmol GHA mg FW –1 ώρα ^–1 , ^{αντίστοιχα} .

Σχήμα 1. Χρονική απόκριση της συνθετάσης γλουταμίνης σίτου στο λίπασμα Ν υπό ελεγχόμενες συνθήκες και συνθήκες αγρού. Η απόκριση της ενζυμικής δραστηριότητας της συνθετάσης γλουταμίνης (GS) μετρήθηκε σε δύο γονότυπους σιταριού ψωμιού που αναπτύχθηκαν σε πλήρως γονιμοποιημένο μείγμα γλάστρας (λίπασμα βραδείας αποδέσμευσης Osmocote). Η δραστηριότητα GS σε δείγματα φύλλων Cadenza (A) και Paragon (B) μετρήθηκε σε τέσσερα χρονικά σημεία μετά την εφαρμογή NH4NO3, που ισοδυναμούν με 150 kg N ha ^–1 (N150) και 250 kg ha ^–1 (N250), αντίστοιχα. Εφαρμόστηκε νερό σε φυτά ελέγχου (Ν-0) και μετρήθηκε παράλληλα. Κάθε τιμή αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή ± SE τεσσάρων βιολογικών αντιγράφων. Οι ίδιοι γονότυποι ελήφθησαν δείγματα από ένα μακροχρόνιο πείραμα πεδίου με οικόπεδα προσαρμοσμένα σε χαμηλά (100 kg N ha^–1 ) και υψηλή (350 kg N ha ^–1 ) συνολική εποχιακή εφαρμογή N (βλ. κείμενο για λεπτομέρειες). Η δραστηριότητα GS (C) , το αμμώνιο ιστού (D) και το αμμώνιο ανάλυσης δίσκου φύλλου (Ε) μετρήθηκαν σε δείγματα φύλλων που συλλέχθηκαν πριν από (0 h) και στις 48 ώρες μετά τη δεύτερη κατάτμηση λιπάσματος NH4SO4 ισοδύναμη με 50 kg N ha ^{– 1} (οικόπεδο χαμηλού N) και 250 kg N ha ^–1 (high-N οικόπεδο), αντίστοιχα. Κάθε τιμή αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή ± SE έξι βιολογικών αντιγράφων. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των μέσων τιμών (p lt; 0,05).

Αποκρίσεις φυτών στην εφαρμογή λιπασμάτων N στο πεδίο

Για την επικύρωση των αποτελεσμάτων από το πείραμα σε γλάστρες, η απόκριση σε διαφορετικά επίπεδα εφαρμογής λιπάσματος Ν αναλύθηκε σε φυτά Cadenza και Paragon στο βλαστικό στάδιο που αναπτύχθηκαν σε ένα μακροχρόνιο πείραμα πεδίου με χαμηλά και υψηλά οικόπεδα N (βλ. ενότητα «Υλικά και μέθοδοι ” για λεπτομέρειες). Για την αξιολόγηση των αποκρίσεων Ν, δειγματοληψία φυτών πριν και 48 ώρες μετά την εφαρμογή Ν και αναλύθηκαν ως προς τη δραστηριότητα του ενζύμου GS και τον ιστό NH4 , καθώς και για το NH4 ^{του δίσκου φύλλου}(Εικόνες 1Γ–Ε). Μια σημαντική αλλαγή στη δραστηριότητα του GS παρατηρήθηκε με την πάροδο του χρόνου (F1,117 = 43,62, p lt; 0,001). Στο Cadenza, η δραστηριότητα GS πριν από την εφαρμογή Ν ήταν παρόμοια στα οικόπεδα χαμηλού-Ν και υψηλού-Ν και σημαντική αύξηση στη δραστηριότητα GS μετά την εφαρμογή λιπάσματος παρατηρήθηκε μόνο σε φυτά που αναπτύχθηκαν στο οικόπεδο υψηλού-Ν (Εικόνα 1C). Αντίθετα, η δραστηριότητα GS στο Paragon πριν από την εφαρμογή N ήταν ήδη σημαντικά υψηλότερη στις γραφικές παραστάσεις υψηλού N και σημαντικά αυξήθηκε περαιτέρω μετά την εφαρμογή N και στις δύο γραφικές παραστάσεις, χαμηλού N και υψηλού N (έως 68,81 μmol GHA g FW ^–1 ώρα ^–1 ; Εικόνα 1Γ).

Σε αντίθεση με τις παρατηρούμενες αλλαγές στη δραστηριότητα του ενζύμου GS, η συγκέντρωση NH4 στον ιστό δεν ανταποκρίθηκε στην εφαρμογή λιπάσματος Ν (F1,115 = 2,39, p = 0,125). Ωστόσο, ενώ ο ιστός NH4 ήταν παρόμοιος (μεταξύ 1,49 και 1,72 μmol g ^–1 ) και στους δύο γονότυπους υπό συνθήκες χαμηλού N, το Paragon είχε σημαντικά υψηλότερη συγκέντρωση αμμωνίου στους ιστούς υπό συνθήκες υψηλού N (2,11 μmol g ^–1 FW) σε σύγκριση με φυτά που αναπτύσσονται σε οικόπεδα χαμηλού Ν (1,49 μmol g ^–1 ) (Εικόνα 1Δ). Είναι ενδιαφέρον ότι το αμμώνιο που εκχυλίστηκε από φύλλα δίσκου, που χρησιμοποιείται εδώ ως υποκατάστατο για πιθανές απώλειες πτητικών NH3, αυξήθηκε σημαντικά (F1,128 = 31,85, p lt; 0,001) ως απόκριση στην εφαρμογή N στο οικόπεδο υψηλού N στην Cadenza (από 1,82 σε 3,10 μmol g ^–1) και στις δύο γραφικές παραστάσεις υψηλού και χαμηλού N στο Paragon, αν και παρέμεινε συγκριτικά χαμηλότερο στο τελευταίο (μέγιστο 2,73 μmol g ^–1 ) (Εικόνα 1Ε).

Αλληλική παραλλαγή και έκφραση γονιδίων συνθετάσης γλουταμίνης στο σιτάρι

Οι συνθετάσες γλουταμίνης αποτελούν μια οικογένεια πολλαπλών γονιδίων στο σιτάρι (Εικόνα 2Α) και για τους σκοπούς αυτής της μελέτης οι πληροφορίες αλληλουχίας έχουν ενημερωθεί με βάση πρόσφατες εκδόσεις του γονιδιώματος αναφοράς της κινεζικής Άνοιξης (IWGSC RefSeq v1.0; International Wheat Genome Sequencing Consortium ( IWGSC) et al., 2018) και συμπληρώθηκε με πρωτεϊνικά μοντέλα που βασίζονται σε διαθέσιμες γονιδιωματικές αλληλουχίες ικριώματος πέντε ποικιλιών σίτου (Εικόνα 2 και Συμπληρωματικός Πίνακας 1). Στην κινεζική άνοιξη, το γονίδιο GS2 βρίσκεται στην ομάδα χρωμοσωμάτων 2, δύο γονίδια GS1 (GS1;2 και GS1;3) βρίσκονται στην ομάδα χρωμοσώματος 4 και ένα τρίτο γονίδιο GS1 (GS1;1) βρίσκεται στην ομάδα χρωμοσώματος 6 ( Εικόνα 2Β).

Εικόνα 2. Σύγκριση γονιδίων συνθετάσης γλουταμίνης σε έξι ποικιλίες σίτου. Αλληλουχίες των γονιδίων σίτου GS1 και GS2 του γονιδιώματος αναφοράς της κινεζικής Spring εξήχθησαν από το Ensembl Plants (https://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum) και χρησιμοποιήθηκαν ως ερώτημα και πρότυπο για την εξαγωγή γονιδιωματικών αλληλουχιών από δημόσια διαθέσιμα ικριώματα και σε προβλέψτε μοντέλα πρωτεϊνών GS1 και GS2 σε τέσσερις ποικιλίες σιταριού ψωμιού (Cadenza, Paragon, Claire και Robigus) και ένα σκληρό σιτάρι (Kronos) (βλ. κείμενο για λεπτομέρειες, Συμπληρωματικός Πίνακας 1). Μια σύγκριση των μοντέλων πρωτεΐνης παρουσιάζεται στο δέντρο που δημιουργήθηκε στο Geneious (A) . Τα αναγνωριστικά γονιδίων και οι χρωμοσωμικές θέσεις των γονιδίων στο γονιδίωμα αναφοράς της κινεζικής Spring φαίνονται στο (Β). Ο υψηλός βαθμός διατήρησης των γονιδίων στις έξι ποικιλίες που αναλύθηκαν φαίνεται στην ευθυγράμμιση στο (C) (βλ. Συμπληρωματικά Σχήματα 1-3 για λεπτομέρειες). Τα διαθέσιμα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης (http://www.wheatexpression.com) δείχνουν μια προτιμησιακή έκφραση του GS2 στα φύλλα και την πρόσθετη έκφραση των γονιδίων GS1 σε ρίζες, καρφιά και κόκκους (D) . Σημειώστε ότι τα γονίδια GS1;3 εμφανίζουν ένα ξεχωριστό πρότυπο έκφρασης και είχαν τον υψηλότερο αριθμό αλλαγών αμινοξέων (C) (http://www.wheatexpression.com; Ramírez-González and Borrill, 2018).

Χρησιμοποιώντας τις γονιδιωματικές αλληλουχίες της κινεζικής Spring ως ερώτημα, οι γονιδιωματικές αλληλουχίες GS1 και GS2 που είναι διαθέσιμες μέσω του Decypher ταυτοποιήθηκαν σε τέσσερις ποικιλίες σιταριού ψωμιού (Cadenza, Paragon, Robigus και Claire), καθώς και στην τετραπλοειδή ποικιλία σκληρού σίτου Kronos. Για την πρόβλεψη των πρωτεϊνικών μοντέλων, οι δομές γονιδιωματικού ιντρονίου-εξονίου της κινεζικής Spring επιτέθηκαν στη συνέχεια στις συναρμολογημένες γονιδιωματικές αλληλουχίες και τα εξόνια εξήχθησαν και μεταφράστηκαν σε υποτιθέμενες πρωτεϊνικές αλληλουχίες χρησιμοποιώντας Geneious (βλ. ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι» για λεπτομέρειες). Λεπτομέρειες για τα ικριώματα σίτου από τα οποία ανακτήθηκαν οι αλληλουχίες και τα ονόματα γονιδίων παρέχονται στον Πίνακα 1 και στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1.

Μια σύγκριση των προβλεπόμενων πρωτεϊνικών μοντέλων στις έξι ποικιλίες σιταριού που αναλύθηκαν αποκάλυψε πολύ υψηλό βαθμό διατήρησης με 98-100% ταυτότητα αλληλουχίας σε όλο το μήκος της πρωτεΐνης (Εικόνα 2C και βλέπε συμπληρωματικά σχήματα 1-3 για ευθυγραμμίσεις πλήρους μεγέθους). Ο υψηλότερος βαθμός παραλλαγής αλληλουχίας παρατηρήθηκε για το γονίδιο TaGS1;3 στο χρωμόσωμα 4 με δεκατρείς υποκαταστάσεις αμινοξέων (Εικόνες 2Α, Γ). Με βάση τα διαθέσιμα δεδομένα έκφρασης ⁵Το GS2 εκφράζεται κυρίως σε φύλλα (Εικόνα 2D) σε συμφωνία με τον εντοπισμό του στον χλωροπλάστε και τον ρόλο του στη φωτοαναπνευστική επανααφομοίωση του Ν. Τα κυτταροπλασματικά γονίδια GS1 εκφράζονται κυρίως σε ρίζες και καρφιά/κόκκο σύμφωνα με τον ρόλο τους στην πρωτογενή αφομοίωση του Ν στις ρίζες και στην επανακινητοποίηση του Ν κατά τη γήρανση και το γέμισμα των κόκκων (Εικόνα 2Δ). Ενώ οι ομοιολόγοι TaGS1;1 στο χρωμόσωμα 6 και TaGS1;2 ομοιολόγοι στο χρωμόσωμα 4 εκφράζονται επίσης σε φύλλα, το πιο μεταβλητό γονίδιο του χρωμοσώματος 4 TaGS1;3 φαίνεται να μην εκφράζεται στα φύλλα (Εικόνα 2D).

Για να καταστεί δυνατή η ανάλυση γονιδιακής έκφρασης, διεξήχθησαν λεπτομερείς συγκρίσεις αλληλουχιών DNA μεταξύ των έξι γονότυπων και, για τους σκοπούς αυτής της μελέτης, σχεδιάστηκαν εκκινητές που συνδέονται ειδικά με τους τρεις ομολόγους GS2, καθώς και ειδικούς για το GS1 εκκινητές που συνδέονται με όλους τους ομοιολόγους του τα τρία γονίδια GS1 (για αλληλουχίες εκκινητών βλέπε Πίνακα 2). Με βάση την ανταπόκριση στη δραστηριότητα GS στους διαφορετικούς γονότυπους, η ανταπόκριση Ν των γονιδίων GS αξιολογήθηκε σε τρεις επιλεγμένους γονότυπους (Cadenza, Paragon, Claire), που αναπτύχθηκαν υπό συνθήκες πλήρους N, στο βλαστικό στάδιο πριν και στα 6 και 30 h μετά την εφαρμογή N (NH4NO3, ισοδύναμο 250 kg N ha ^–1). Στα αναλυθέντα δείγματα φύλλων, η συνδυασμένη έκφραση των γονιδίων GS1 ήταν πολύ χαμηλότερη από την έκφραση των ομολόγων GS2 και δεν έδειξε σημαντική απόκριση Ν (Εικόνες 3Α, Β). Σε αντίθεση με την προσδοκία μας, οι αυξήσεις στην έκφραση του γονιδίου GS2 μετά την εφαρμογή Ν ήταν επίσης σε μεγάλο βαθμό μη σημαντικές (Εικόνα 3Β) αν και υπήρχε ασθενής (r = 0,4459) συσχέτιση μεταξύ της δραστηριότητας GS και της έκφρασης του γονιδίου GS2 (βλ. ένθεση στο Σχήμα 3Β).

Σχήμα 3. Ανάλυση έκφρασης γονιδίων GS1 και GS2 σε απόκριση σε έλλειμμα Ν και νερού. Για αναλύσεις γονιδιακής έκφρασης, σχεδιάστηκαν ειδικοί εκκινητές που ενισχύουν ειδικά τα γονίδια GS1 και τα γονίδια GS2, αντίστοιχα (βλ. Εικόνα 2). Η έκφραση των τριών γονιδίων GS1 και των αντίστοιχων ομολόγων τους (Α) και του γονιδίου GS2 με τα τρία ομοιόλογά του (Β) ποσοτικοποιήθηκε σε δείγματα φύλλων από τους τέσσερις ενδεικνυόμενους γονότυπους σίτου στις 6 ώρες και 30 μετά την εφαρμογή NH4NO3 ισοδύναμο 250 kg N ha ^{– 1} (Ν250) και σε εγκαταστάσεις ελέγχου που έχουν υποστεί επεξεργασία με νερό (Ν-0). Κάθε τιμή αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή ± SE τεσσάρων βιολογικών αντιγράφων. Το ένθετο στο (Β)δείχνει τη συσχέτιση της έκφρασης του γονιδίου GS και της δραστικότητας του ενζύμου GS (τα αντίστοιχα δεδομένα δραστηριότητας GS φαίνονται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 4). Η απόκριση της έκφρασης των γονιδίων GS1 (C) και GS2 (D) σε μια κατεργασία ξηράνσεως αναλύθηκε στις 72 ώρες μετά τη διακοπή νερού. Τα καλά ποτισμένα (WW) φυτά δειγματοληπτήθηκαν παράλληλα. Κάθε τιμή αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή ± SE τεσσάρων βιολογικών αντιγράφων. Στο πείραμα αποξήρανσης, η δραστηριότητα του ενζύμου GS (E) και η περιεκτικότητα σε αμμώνιο των ιστών των φύλλων (F)μετρήθηκαν παράλληλα στις 0 ώρες και στις 72 ώρες μετά την παρακράτηση νερού. Το ένθετο δείχνει αρνητική συσχέτιση αμμωνίου ιστού και δραστηριότητας GS. Κάθε τιμή αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή ± SE έξι βιολογικών αντιγράφων. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των μέσων τιμών (p lt; 0,05) κάθε θεραπείας.

In order to corroborate lack of transcriptional regulation of GS genes, gene expression in Cadenza and Paragon was assessed in response to water stress. As had been overserved in the previous experiment, under water stress, GS1 transcript abundance was about 10-times lower compared to GS2 in both genotypes, however, GS1 transcript abundance significantly increased in response to water stress (F11 = 7.921, p lt; 0.02) whilst GS2 transcript abundance was significantly reduced (F11 = 17.660, p lt; 0.001) (Figures 3C,D). The parallel analysis of GS enzyme activity showed a significant difference between genotypes (F1,67 = 9.13 p = 0.004) with Paragon having higher GS activity on average (92.8 μmol GHA g FW^–1 h^–1) than Cadenza (76.9 μmol GHA g FW^–1 h^–1) (Figure 3E). In response to the dry-down treatment, GS enzyme activity significantly decreased in both genotypes compared to the well-watered controls by the end of the experiment, at 72 h after withholding water (Figure 3F). In agreement with that, leaf tissue NH4 and GS activity were negatively correlated (r = 0.486) and increased under water stress (see inlay in Figure 3F).

Genetic Diversity in Wheat for Plant N-Fertiliser Responses

^{Με βάση την παρατηρούμενη θετική απόκριση της δραστηριότητας GS και την αύξηση του NH4} του δίσκου φύλλου στους δύο αναλυθέντες γονότυπους ανοιξιάτικου σίτου Cadenza και Paragon, αυτή η μελέτη επεκτάθηκε στο χειμερινό σιτάρι. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, το περιβάλλον στόχος για αυτή τη μελέτη είναι το εντατικό σύστημα του Ηνωμένου Βασιλείου και επομένως επιλέξαμε οκτώ ιδρυτές ενός ελίτ πληθυσμού MAGIC (Alchemy, Brompton, Claire, Hereward, Rialto, Robigus, Soissons και Xl-19; NIAB Elite MAGIC , Mackay et al., 2014). Τα φυτά αναπτύχθηκαν σε συνθήκες πλήρους N και στο στάδιο της βλάστησης 3-4 φύλλων τροφοδοτήθηκαν με το ισοδύναμο 250 kg N ha ^-1 , είτε ως διαλυτοποιημένο NH4NO3 είτε ως ενζυμική δραστηριότητα ουρίας και GS, ιστός φύλλων και δίσκος φύλλου NH4 μετρήθηκαν στις 6 και 30 ώρες μετά την εφαρμογή Ν. Τα φυτά ελέγχου τροφοδοτήθηκαν με νερό και αναλύθηκαν παράλληλα (Εικόνα 4 και Συμπληρωματικός Πίνακας 2). Το NH4NO3 συμπεριλήφθηκε σε αυτή τη μελέτη για να εκτιμηθεί εάν η αφομοίωση του Ν μπορεί να είναι υψηλότερη όταν τα φυτά χρησιμοποιούν και τα δύο συστήματα, το εγγενές σύστημα πρόσληψης αμμωνίου και νιτρικών αλάτων. Ωστόσο, δεν ανιχνεύθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των πηγών Ν υπό τις πειραματικές συνθήκες που εφαρμόστηκαν σε αυτή τη μελέτη. Σε αντίθεση. παρατηρήθηκε ισχυρή σημαντική επίδραση του χρόνου στη δραστηριότητα GS (F1,296 = 34,46, p lt; 0,001) με αυτό το αποτέλεσμα να διαφέρει μεταξύ των θεραπειών (F2,296 = 10,59, p lt; 0,001). Τόσο η συγκέντρωση NH4 στο δίσκο φύλλου όσο και στους ιστούς φύλλων διέφεραν σημαντικά μεταξύ των χρόνων, της επεξεργασίας και του γονότυπου με σημαντικές αλληλεπιδράσεις τριών κατευθύνσεων (F18,295 = 1,80, p = 0,024 και F18,288 = 4,11, p lt; 0,001).

Σχήμα 4. Διαφορική απόκριση δέκα γονότυπων σίτου σε λιπάσματα Ν. Δέκα ελίτ γονότυποι σίτου του Ηνωμένου Βασιλείου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το ισοδύναμο 250 kg N ha ^-1 που εφαρμόστηκε είτε ως NH4NO3 είτε ως ουρία και μετρήθηκε η απόκριση της δραστηριότητας GS (A) , του αμμωνίου ιστού φύλλου (B) και του αμμωνίου δίσκου φύλλου (C). στις 6 και 30 ώρες μετά τη Ν εφαρμογή. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν μετασχηματισμένες log2 σχετικές αλλαγές σε σύγκριση με φυτά ελέγχου που έχουν υποστεί επεξεργασία με νερό (μέσες τιμές έξι επαναλήψεων). Τα δεδομένα υπολογίστηκαν ως LFold_Change = log2 (θεραπεία/μέσος όρος ελέγχου). Οι μέσες τιμές των πραγματικών δεδομένων για την ομάδα high-GS και low-GS, αντίστοιχα, δίνονται στο (D–F). Οι γραμμές σφαλμάτων αντιπροσωπεύουν τυπικά σφάλματα. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων ήταν σημαντικές στο p lt; 0,001. Cad, Cadenza; Par, Paragon; Soi, Soissons; Bro, Brompton; Alc, Alchemy; Her, Hereward; Cl, Claire; XL-19, XL-19; Rob, Robigus; Ρία, Ριάλτο. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων ήταν σημαντικές σε ***p lt; 0,001.

Συνολικά, τα δεδομένα ήταν μεταβλητά και δύσκολο να ερμηνευθούν, ωστόσο, δύο σημαντικά διακριτές ομάδες μπορούσαν να διακριθούν, τόσο στην απόλυτη δραστηριότητα GS (F1,296 = 52,85, p lt; 0,001) όσο και στη σχετική αλλαγή στη δραστηριότητα GS [ακατέργαστα δεδομένα/F1 ,296 = 11,22 (δεδομένα log2); p lt; 0,001] με βάση μια ANOVA δεδομένων μεταβολής μετασχηματισμένων log2 και πραγματικών δεδομένων (Εικόνες 4A,D και Συμπληρωματικός Πίνακας 2). Αυτή η διαφοροποίηση βασίζεται κυρίως στην υψηλότερη δραστηριότητα GS που υπάρχει στην «ομάδα υψηλού GS» (μέσος όρος 76,2 μmol GHA h ^–1 FW ^–1 ) σε σύγκριση με την «ομάδα χαμηλού GS» (μέσος όρος 63,8 μmol GHA h ^–1 FW ^{– 1}) (Εικόνα 4Δ). Ομοίως, η αλλαγή log2 φορές σε απόκριση στην εφαρμογή N ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ της ομάδας υψηλού GS (μέση αλλαγή log2 φορές 0,09375) και της ομάδας χαμηλού GS (μέση αλλαγή log2 φορές -0,08875) (Εικόνα 4Α). Αυτή η ομαδοποίηση υποστηρίχθηκε επίσης από τη συγκέντρωση NH4 ιστού [F1,296 = 13,01 (ακατέργαστα δεδομένα)/F1,296 = 45,29 (δεδομένα log 2). ^{p lt; 0,001] και δεδομένα NH4} φύλλου δίσκου [F1,296 = 12,97 (sqrt πρωτογενή δεδομένα)/F1,296 = 14,9 (δεδομένα log 2); p lt; 0,001], τα οποία ήταν και τα δύο σημαντικά υψηλότερα στην ομάδα υψηλού GS (Εικόνες 4B,C,E,F).

Το μοτίβο που προέκυψε από την ανάλυση αυτού του πολύπλοκου συνόλου δεδομένων αποκάλυψε μια συνολική θετική απόκριση Ν της ομάδας υψηλού GS, δηλαδή γενικά τους έξι γονότυπους σε αυτήν την ομάδα (Paragon, Cadenza, Soissons, XL-19, Robigus και Rialto) είχε μια ιδιοσυστατικά υψηλότερη δραστικότητα GS που έτεινε να ανταποκρίνεται θετικά στην εφαρμογή Ν (Εικόνες 4Α, Δ). Αντίθετα, τα δεδομένα υποδηλώνουν μια πιθανή ανασταλτική επίδραση της εφαρμογής Ν στη δραστηριότητα GS στην ομάδα χαμηλού GS (Claire, Hereward, Alchemy, Brompton, Σχήματα 4Α, Δ). Ομοίως, η συγκέντρωση NH4 στους ιστούς στην ομάδα υψηλού GS αυξήθηκε μετά την εφαρμογή N και ήταν ιδιοσυστατικά υψηλότερη (μέση τιμή 1,1 μmol g ^–1 NH4 ) σε σύγκριση με την ομάδα χαμηλής GS (μέση τιμή 0,89 μmol g ^–1 NH4 ) (Εικόνες 5Β,Ε). Αντίθετα με αυτό, το φυλλικό δίσκο NH4 , ως αντιπρόσωπος για πιθανές απώλειες Ν μέσω του πτητικού αερίου NH3, αυξήθηκε στην ομάδα χαμηλού GS (Εικόνες 4C, F). Ωστόσο, αν και στην ομάδα υψηλού GS ο δίσκος των φύλλων NH4 δεν αυξήθηκε ως απόκριση στο Ν, ήταν συνολικά υψηλότερος σε αυτήν την ομάδα (μέσος όρος 5,5 μmol g ^–1 NH4 ) σε σύγκριση με την ομάδα με χαμηλό GS (4,5 μmol g ^–1 NH4 ) (Εικόνα 4F).

Σχήμα 5. Εκπομπή αμμωνίας και αερίου N2O ως απόκριση στην εφαρμογή Ν στο σιτάρι. Τρεις ποικιλίες σιταριού αντιπροσωπευτικές της ομάδας υψηλού GS (Cadenza, Paragon) και της ομάδας χαμηλού GS (Claire) καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες χαμηλού και υψηλού N, αντίστοιχα, και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το ισοδύναμο 250 kg N ha-1 που εφαρμόζεται είτε ^ως NH4NO3 ή KNO3 αμέσως πριν από τις μετρήσεις αερίου. Εφαρμόστηκε νερό σε φυτά ελέγχου που μετρήθηκαν παράλληλα. Για τον έλεγχο του εδάφους, αποκόπηκε ο υπέργειος φυτικός ιστός, αλλά οι ρίζες διατηρήθηκαν (βλ. κείμενο για λεπτομέρειες). Οι εκπομπές αερίων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή αερίων (Picarro G2508, Ηνωμένες Πολιτείες) σε περίοδο 24 ωρών. Μέγιστο NH3 (A) και N2O (B)Οι εκπομπές από τα φυτά ήταν σημαντικά υψηλότερες από τις εκπομπές υποβάθρου από το έδαφος. Εμφανίζονται αντιπροσωπευτικά επεξεργασμένα δεδομένα Picarro για την εκπομπή NH3 (C) και N2O (D) , με τη μέγιστη εκπομπή NH3 να εμφανίζεται νωρίτερα από τη μέγιστη εκπομπή N2O (E) . Η επίδραση των συνθηκών ανάπτυξης και της επεξεργασίας με Ν στη μέγιστη εκπομπή NH3 και N2O υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τα συνδυασμένα δεδομένα των τριών γονότυπων που δείχνουν υψηλότερες εκπομπές από φυτά που λιμοκτονούν με Ν (F,G) . Οι γονοτυπικές διαφορές μεταξύ των φυτών που αναπτύσσονται υπό συνθήκες χαμηλού N φαίνονται στο (Η,Ι) . Τα φυτά Cadenza που αναπτύχθηκαν κάτω από συνθήκες χαμηλού N υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ουρία και KNO3, με και με αναστολέα νιτρικής αναγωγάσης (NI), παρουσιάζοντας την υψηλότερη εκπομπή N2O στην επεξεργασία KNO3(J) . Τα δεδομένα προέρχονται από έξι επαναλήψεις για κάθε γονότυπο και θεραπεία. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των μέσων τιμών (p lt; 0,05) κάθε θεραπείας.

Για την περαιτέρω διερεύνηση των παρατηρούμενων γονοτυπικών διαφορών, επιλέχθηκαν τρεις γονότυποι για τον επιπρόσθετο προσδιορισμό των αλλαγών στην περιεκτικότητα σε νιτρικό άλας και L-γλουταμίνη των φύλλων σε απόκριση στην εφαρμογή NH4NO3. Η Claire επιλέχθηκε ως εκπρόσωπος του ομίλου low-GS και οι Cadenza και Paragon ως εκπρόσωποι του ομίλου high-GS. Τα συνδυασμένα δεδομένα τριών επιλεγμένων γονότυπων έδειξαν σημαντική αύξηση στην περιεκτικότητα σε L-γλουταμίνη, NO3 ^– και NH4 στον ιστό των φύλλων , καθώς και στη δραστηριότητα GS, ως απόκριση στην εφαρμογή N (Συμπληρωματικά Σχήματα 4A–D). ^{Από τους τρεις γονότυπους, η Claire είχε τη χαμηλότερη δραστηριότητα GS και τη χαμηλότερη NH4} δίσκου φύλλου , καθώς και τη χαμηλότερη L-γλουταμίνη και NH4 ^ιστών, αν και οι τελευταίες διαφορές δεν ήταν σημαντικές (Συμπληρωματικά σχήματα 4F–J). Συνολικά, υπήρξε θετική συσχέτιση της δραστηριότητας του GS με την περιεκτικότητα σε L-γλουταμίνη των φύλλων (r = 0,58), καθώς και με NH4 ^{ιστού και NH4} του δίσκου φύλλου (r = 0,54, r = 0,56). Το συνολικό περιεχόμενο διαλυτών πρωτεϊνών των δειγμάτων αναλύθηκε επίσης αλλά δεν έδειξε καμία αλλαγή σε απόκριση στην εφαρμογή Ν στα δύο χρονικά σημεία (6 και 30 ώρες) που αναλύθηκαν (τα δεδομένα δεν φαίνονται).

Εκπομπές N αερίων από φυτά που καλλιεργούνται σε συνθήκες χαμηλού και υψηλού N

^{Για να επιβεβαιωθούν τα δεδομένα NH4} του δίσκου φύλλου και να επιβεβαιωθεί ότι τα φυτά σιταριού στην πραγματικότητα εκπέμπουν αέριο NH3, αναλύθηκαν γονότυποι από την ομάδα υψηλής GS (Cadenza και Paragon) και την ομάδα χαμηλής GS (Claire) χρησιμοποιώντας ένα αέριο Picarro σε πραγματικό χρόνο αναλυτής. Για αυτό το πείραμα, τα φυτά αναπτύχθηκαν υπό συνθήκες υψηλού και χαμηλού Ν, με την τελευταία επεξεργασία να μειώνει σημαντικά το ξηρό βάρος των φυτών σε όλους τους γονότυπους κατά περίπου 50% (Συμπληρωματικό Σχήμα 5). Τα φυτά τροφοδοτήθηκαν με ισοδύναμο 250 kg N ha ^–1είτε ως NH4NO3 είτε ως KNO3 το πρωί, και η εκπομπή αερίων μετρήθηκε σε περίοδο 24 ωρών. Οι εκπομπές NH3, καθώς και N2O, παρουσίασαν σημαντικές διαφορές (F181 = 5,803, p lt; 0,05; F150 = 17,6975, p lt; 0,001, αντίστοιχα) μεταξύ των φυτών και των εδαφικών ελέγχων, με υψηλότερες μέγιστες εκπομπές από φυτά με υψηλό Ν και χαμηλό Ν συνθήκες (Εικόνες 5Α, Β). Η μέγιστη εκπομπή αερίου NH3 σημειώθηκε περίπου 5-6 ώρες μετά την εφαρμογή N, ενώ η μέγιστη εκπομπή N2O σημειώθηκε αργότερα, περίπου 15 ώρες μετά την εφαρμογή N (Εικόνες 5C-E). Αντιπροσωπευτικά δεδομένα εκπομπών NH3 και N2O που παράγονται από επεξεργασμένα δεδομένα Picarro (Paragon που αναπτύχθηκε σε συνθήκες χαμηλού N) φαίνονται στα Σχήματα 5C,D. Η εκπομπή N2O ήταν συνολικά υψηλότερη και εντός του εύρους ppm, ενώ η εκπομπή αερίου NH3 ήταν στην περιοχή ppb.

Ανεξάρτητα από την επεξεργασία με Ν, η μέγιστη εκπομπή NH3 ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των φυτών που αναπτύχθηκαν υπό συνθήκες υψηλού Ν και χαμηλού Ν, με τα φυτά χαμηλού Ν να παρουσιάζουν υψηλότερη εκπομπή NH3 (F1,0289 = 26,4939, p lt; 0,001· Εικόνα 5F). Ομοίως, η μέγιστη εκπομπή N2O ήταν σημαντικά υψηλότερη από φυτά που αναπτύχθηκαν σε συνθήκες χαμηλού N (F0,7262 = 32,8576, p lt; 0,001, Εικόνα 5G). Στα συνδυασμένα δεδομένα των τριών γονότυπων που αναλύθηκαν, παρατηρήθηκε σημαντική επίδραση της επεξεργασίας με Ν στις εκπομπές N2O σε φυτά που αναπτύχθηκαν σε συνθήκες χαμηλού N2O, με σημαντικά υψηλότερη εκπομπή N2O και μετά την εφαρμογή NH4NO3 και KNO3 σε σύγκριση με τον μάρτυρα που είχε υποστεί επεξεργασία με νερό. φυτά (Εικόνα 5G). Η εκπομπή N2O ήταν υψηλότερη όταν εφαρμόστηκε KNO3 (F0,7262 = 6,0957, p lt; 0,05), σε συμφωνία με την τρέχουσα κατανόησή μας ότι το N2O είναι ένα υποπροϊόν της νιτρικής αναγωγάσης. Στα συνδυασμένα δεδομένα, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην εκπομπή NH3 μεταξύ των φυτών που έλαβαν Ν και των εγκαταστάσεων ελέγχου νερού (Εικόνα 5ΣΤ). Ωστόσο, τα δεδομένα εκπομπών NH3 που μετασχηματίστηκαν σε λογαριθμικό έλεγχο έδειξαν γονοτυπικές διαφορές, με σημαντικά υψηλότερη εκπομπή από την αντιπροσωπευτική ποικιλία Claire με χαμηλή ομάδα GS, σε σύγκριση με την Cadenza και την Paragon (Εικόνα 5Η). Ομοίως, η εκπομπή N2O ήταν σημαντικά υψηλότερη στο Claire (Εικόνα 5I). Αυτό παρατηρήθηκε μόνο σε φυτά που αναπτύχθηκαν υπό συνθήκες χαμηλού Ν αλλά όχι σε φυτά που αναπτύχθηκαν υπό συνθήκες υψηλού Ν (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Για να διερευνηθεί περαιτέρω η επίδραση της πηγής Ν στην εκπομπή αερίων, τα φυτά Cadenza που αναπτύχθηκαν υπό συνθήκες χαμηλού Ν υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ουρία και KNO3, με και χωρίς προσθήκη του αναστολέα νιτρικής αναγωγάσης βολφραμίου, αντίστοιχα. Σε συμφωνία με την προσδοκία,

Για την αξιολόγηση της πρόσληψης Ν και της αφομοίωσης των τριών γονότυπων υπό συνθήκες ανάπτυξης χαμηλού N και υψηλού N, συλλέχθηκαν δείγματα φύλλων του προηγούμενου πειράματος στο τέλος της μέτρησης αερίου (στις 24 ώρες μετά την εφαρμογή Ν) και αναλύθηκαν για δραστηριότητα GS , και ιστός και δίσκος φύλλου NH4 (Εικόνα 6). Η ανάλυση των συνδυασμένων δεδομένων έδειξε σημαντικά (F0,59 = 0,16, p lt;0,01) υψηλότερη περιεκτικότητα σε NH4 ιστού σε φυτά που αναπτύχθηκαν σε συνθήκες χαμηλού N, αν και στα συνδυασμένα δεδομένα δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στη δραστηριότητα GS ή στα φύλλα δίσκος NH4 (Figures 6A,C,E). However, when comparing the genotypes individually, GS activity in Claire was variable in response to NH4NO3 and was significantly lower compared to Cadenza and Paragon when N was supplied as KNO3 (Figure 6B). All genotypes showed a significant increase in tissue NH4 after N application, and this was most pronounced when N was supplied as NH4NO3 (Figure 6D). Under the experimental conditions applied, there was no significant difference between the genotypes in leaf tissue NH4 (Figure 6D), however, in contrast leaf-disc NH4 ήταν σημαντικά χαμηλότερος στο Claire σε σύγκριση με τους άλλους δύο γονότυπους, μετά από αμφότερους, την εφαρμογή NH4NO3 και KNO3 (Εικόνα 6F). Αυτό συμφωνεί με τα δεδομένα από τη μελέτη ποικιλότητας (Εικόνα 4ΣΤ) που δείχνει ένα συνολικό χαμηλότερο φυλλικό δίσκο NH4 στην ομάδα χαμηλού GS.

Σχήμα 6. Διαφορική απόκριση Ν σε φυτά που αναπτύσσονται υπό συνθήκες υψηλού και χαμηλού Ν. Επιλεγμένοι γονότυποι, Cadenza, Paragon και Claire, αναπτύχθηκαν κάτω από συνθήκες χαμηλού N και υψηλού N μέχρι το στάδιο 3-4 του τρυπανιού και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το ισοδύναμο 250 kg N ha-1 ως NH4NO3 και KNO3, ^{αντίστοιχα} . Το νερό χρησιμοποιήθηκε για τα φυτά ελέγχου. Η δραστηριότητα GS (Α) , ο ιστός των φύλλων NH4 (C) και ο δίσκος φύλλου NH4 (E) μετρήθηκαν και συγκρίθηκαν μεταξύ φυτών χαμηλού Ν και υψηλού Ν. Η επίδραση διαφορετικών επεξεργασιών στη δραστηριότητα του ενζύμου GS (B) , στον ιστό των φύλλων NH4 (D) και στο φυλλικό δίσκο NH4 (F)συγκρίθηκε μεταξύ των τριών γονότυπων. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των μέσων τιμών (p lt; 0,05) κάθε θεραπείας.

Ένα πρόσθετο πείραμα Picarro διεξήχθη για να συγκριθούν οι ποικιλίες του Ηνωμένου Βασιλείου με σιτάρι από διαφορετική αγρο-οικολογική ζώνη και για αυτό, η αυστραλιανή ελίτ ποικιλία Mace (Wyalkatchem/Stylet), η οποία έχει αποδειχθεί ότι αποδίδει καλά σε διαφορετικά αυστραλιανά περιβάλλοντα (SARDI Crop Harvest Report, 2015), συμπεριλήφθηκε σε αυτή τη μελέτη. Αξίζει να σημειωθεί ότι σε σύγκριση με το Ηνωμένο Βασίλειο, τα συστήματα σίτου στην Αυστραλία είναι σχετικά χαμηλής εισροής N και χαμηλής απόδοσης, υποδηλώνοντας ότι οι αποκρίσεις N στο Mace μπορεί να είναι διαφορετικές σε σύγκριση με τα Cadenza και Paragon, τα οποία είναι προσαρμοσμένα σε υψηλά επίπεδα N. Σε συμφωνία με αυτό, τα δεδομένα δείχνουν ότι στις 24 ώρες μετά την εφαρμογή N, ο Mace είχε σημαντικά χαμηλότερη δραστηριότητα GS, καθώς και χαμηλότερο ιστό φύλλου και NH4 περιεκτικότητα σε σύγκριση με τις ποικιλίες του Ηνωμένου Βασιλείου (Συμπληρωματικά σχήματα 6A–C). Ομοίως, οι εκπομπές αερίων NH3 και N2O ήταν επίσης σημαντικά χαμηλότερες στο Mace (Συμπληρωματικά Σχήματα 6D, E) υποδηλώνοντας ότι το σύστημα αφομοίωσης Ν στο σιτάρι είναι πράγματι πλαστικό και υπόκειται στις επιλογές των κτηνοτρόφων.

Συζήτηση

Ο κύριος στόχος αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογήσει τις άμεσες και βραχυπρόθεσμες αποκρίσεις του σίτου στην εφαρμογή λιπάσματος Ν στο βλαστικό στάδιο και να δει εάν υπάρχει διακύμανση στην ικανότητα αφομοίωσης Ν που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη βελτίωση της αφομοίωσης του Ν-λιπάσματος .

Οι γονότυποι του σιταριού διαφέρουν ως προς την απόκρισή τους στα λιπάσματα N

An initial time course experiment was conducted to assess whether and how rapidly GS activity in wheat responds to N-fertiliser application and if genotypic differences could be observed. The data showed that the spring wheat variety Paragon was overall more responsive to N compared with Cadenza, i.e., GS activity increased as early as 6 h after N application and also responded to lower N doses. The subsequent extended study, including the two spring wheat varieties and eight winter wheat varieties, confirmed that genotypic differences do exist, though there was considerable variation within the data. However, in response to N application, two significantly distinct groups, a high-GS group and low-GS group, could be distinguished. Members of the high-GS group (including both, Cadenza and Paragon) showed a constitutively higher and more N-responsive GS activity and glutamine content in response to N compared to the low GS-group, but also an increased tissue NH4 level. An increase in tissue NH4 concentration when GS activity is high may seem counterintuitive, however, this has also been described in rice by Kumagai et al. (2011a) suggesting that plants store excess NH4 in the leaf when N uptake exceeds the N-assimilation capacity, likely in the vacuoles (Howitt and Udvardi, 2000). The response to N-fertiliser application was markedly different in genotypes constituting the low-GS group, compared with the high-GS group, with the former showing negative regulation of GS activity, no or little increase in tissue NH4 and low glutamine content. This, in conjunction with the observed increase in leaf-disc NH4 , suggests overall poor N assimilation capacity and potentially high N losses in this group.

A negative response of leaf GS activity to N-fertiliser application has previously been reported from durum wheat (Nigro et al., 2016) and bread wheat (Zhang M. et al., 2017). This was only observed in high-grain protein genotypes; however, the high-grain protein genotypes had an overall higher GS activity, similar to the constitutive differences between bread wheat genotypes reported here.

Recent detailed studies in wheat (Wei et al., 2020) showed an increase in GS2 protein in leaves in response to both, NH4 and NO3^– application and this was confirmed by an in-gel GS activity assay showing increased GS2 activity in response to both N sources. In agreement with that, there was no significant differences between N sources in the genotypes analysed in the present study. Interestingly, Wei et al. showed that, in contrast to GS2, GS1 expression and activity showed differential N responses with a positive NH4 response in roots and a positive NO3 in shoots (Wei et al., 2020).

Regulation of Glutamine Synthetase Is Complex, and Genes Are Highly Conserved

It has been shown that the response of GS activity to high leaf tissue NH4 differs among plant species. Studies in lupin and mustard have found that high NH4 tissue concentration was inhibitory (Ratajczak et al., 1981; Schmidt and Mohr, 1989), whilst it was stimulatory in sugar beet, mustard and pine (Vollbrecht et al., 1989; Mäck and Tischner, 1990). It was suggested that one of the underlying reasons for these conflicting reports may be related to the plant carbon (C) to N ratio, e.g., plants with low C:N ratios might lead to a deficiency in N-acceptor carbon skeletons. The complex interplay and potential limitation of C in N metabolism has been studied intensively in relation to the alanine aminotransferase (AlaAT) pathway in various crops (e.g., McAllister et al., 2012; Tiong et al., 2021).

In order to study the expression of the GS genes, we have extracted the sequences of the wheat GS1 and GS2 genes from available, but as yet unannotated, genome sequences from five wheat varieties, in addition to the available Chinese Spring reference genome. The models are therefore putative and will need to be experimentally validated. However, comparison of the predicted protein sequences revealed a near 100% sequence conservation between genotypes across the entire protein and there was no non-synonymous change that could explain differences in GS activities between the high-GS and low-GS activity group. GS enzymes are composed of eight monomers assembled into a complex, high-molecular holoenzyme and given its essential function, this high degree of conservation within wheat and across species is not surprising (Kumada et al., 1993; Bernard et al., 2008; Thomsen et al., 2014; Yang et al., 2016).

Analysis of GS gene expression showed an approximately six-fold higher expression of GS2 in leaves, which is in agreement with other studies in wheat (Bernard et al., 2008; Zhang M. et al., 2017; Wei et al., 2020) and rice (Zhao and Shi, 2006). Although GS2 expression was higher than GS1 overall in Cadenza and Paragon, which also had the highest GS activity, observed positive transcriptional changes after N application were largely not significant; suggesting that constitutive differences might be more relevant than N-triggered changes. Other studies report similar findings, with expression of GS genes being higher in an N-efficient compared to an N-inefficient genotype regardless of N treatment (Tian et al., 2015) and an overall higher expression was also observed in high grain-N genotypes compared with low grain-N genotypes (Nigro et al., 2016; Zhang M. et al., 2017).

There are very few studies in cereals that have assessed dynamic changes in GS gene expression that allow comparison with the short-term responses assessed here. The earliest analysis of N responses in wheat we could find was conducted at 10 days post fertiliser application showing an increase in GS transcript abundance (Nigro et al., 2019). Zhang Z. et al. (2017) monitored TaGS1 and TaGS2 transcript level in two wheat genotypes, grown under low- and high-N conditions, throughout development and in different tissues. The data showed a steep increase in leaf GS2 expression at the jointing stage and this was higher under high N, whereas GS1 expression was highest at 14 days post-anthesis, in agreement with their roles in N-assimilation and N-remobilisation, respectively. The detailed studies in wheat reported by Wei et al. (2020) were conducted with plants grown for 12 days under a range of different steady-stated N concentrations but nevertheless revealed interesting details on the differential regulation of GS1 and GS2 by different N sources, as mentioned above. Strikingly, the authors showed that GS2 is highly expressed in roots whilst they were unable to detect the corresponding protein, suggesting negative post-transcriptional regulation of TaGS2 in roots.

A study in rice assessed GS1 and GS2 gene expression at 6 h after N application to N-starved plants and the authors report an increase in the low-abundance OsGln1;1 gene, however, in agreement with our data the highly expressed OsGln1;2 gene, as well as OsGln2 were not responsive to N application at 6 h (Zhao and Shi, 2006). In another study in rice, GS gene expression in roots in response N-fertiliser application was analysed, showing a significant increase in transcripts of OsGln1;2, which is the most abundant GS gene in roots, in response to NH4 but not to NO3^–. In contrast, expression of another GS1 isoform (OsGln1;1) decreased in response to both N sources, whilst GS2 remained unchanged (low expression in roots). The analysed GOGAT genes were all significantly suppressed (Zhao and Shi, 2006). In a time-course experiment in wheat conducted with plants grown at two different N levels revealed little differences in GS1 and GS2 expression though in flag leaves, GS2 expression was higher under high N conditions (Wei et al., 2021b). In an RNA-seq study in durum wheat GS1 and GS2 expression in leaves did not respond to long-term N starvation, however, GS1 expression in roots increased consistent with its role in N uptake (Curci et al., 2017). Taken together, data on the transcriptional regulation of GS genes in response to N are inconsistent, and other factors need to be considered, such as post-transcriptional regulation and homeolog-specific expression (Wei et al., 2020), as well as post-translational regulation (Finnemann and Schjoerring, 2000; Swarbreck et al., 2008).

In contrast to the inconclusive role of transcriptional regulation in response to N, our dry-down experiment showed a significant upregulation of GS1 and downregulation of GS2 demonstrating that GS genes, in principle, can be regulated at the transcriptional level. Downregulation of GS2 was also observed in durum wheat exposed to osmotic stress, however, GS1 expression and GS activity remained unchanged in the three analysed genotypes (Jallouli et al., 2019). In fact, high GS expression has been implicated with a beneficial role under drought stress in a recent study with simultaneous overexpression of GS1;1 and GS2 (James et al., 2018), and had previously been observed in naturally drought-tolerant rice (Singh and Ghosh, 2013). GS activity was also responsive to salinity stress and specifically increased in the oldest of three analysed leaves, possibly related to N remobilisation under stress (Carillo et al., 2008).

N Fertiliser Application Leads to N-Gas Emission

Volatilisation of NH3 occurs when NH4 -generating processes exceed the re-assimilation capacity (Sutton et al., 1995) and was first described in relation to photorespiration in soybean (Weiland and Stutte, 1985) and spring wheat (Morgan and Parton, 1989). Since then it has been reported in barley (Mattsson et al., 1998), rice (Kumagai et al., 2011a,b), and many other species (see introduction), including Lolium and Bromus grass (Mattsson and Schjoerring, 2002). In the latter study, a significant correlation between high leaf tissue NH4 and apoplastic NH4 concentration was observed. From the apoplast, NH4 can be emitted as NH3 gas via stomata (Husted and Schjoerring, 1995; Pearson et al., 1998; Mattsson and Schjoerring, 2002). Likewise, in rice high NH3 emission was observed at high tissue NH4 concentrations and this was associated with genotypic differences observed between japonica rice and an aus-type landrace, which had low GS activity (Kumagai et al., 2011a).

These studies prompted us to assess if the observed differences in GS activity and leaf tissue NH4 between the high GS-group and the low-GS group was associated with emission of NH3.

Due to the physico-chemical properties of NH3 gas it is difficult to measure emission directly from plants, and specialised equipment is required (Schjoerring et al., 1992). However, it has been suggested that tissue NH4 concentration can be used to estimate the NH3 compensation point because it often increases proportionally to apoplastic NH4 Mattsson and Schjoerring (2002) and Sutton et al. (2009) found that NH3 emission was closely correlated with NH4 concentration in leaf tissue. Therefore, we used the leaf-disc assay where NH4 is extracted from fresh, intact leaf-discs as a proxy for apoplastic NH4 (see section “Materials and Methods” for details). In agreement with the above-mentioned studies, we found that leaf-disc NH4 was significantly higher in the high-GS group, which also had a significantly higher leaf tissue NH4 . However, contrary to the expectation, there was no obvious increase in leaf-disc NH4 after N application, although tissue NH4 increased in this group. This suggests that genotypes in the high-GS group are indeed better able to assimilate and store excess NH4 in contrast to the low-GS group. In the latter group, the N storage and assimilation capacity was possibly exceeded as indicated by lack of increase in leaf tissue NH4 and low glutamine content. The increase in leaf-disc NH4 might thus be a way to prevent accumulation of toxic cellular NH4 levels.

Based on these indicative data, a follow-up study was conducted using a Picarro gas analyser to quantify NH3 as well as N2O gas emission. Cadenza and Paragon were selected as representatives of the high-GS group and Claire as a representative of the low-GS group.

Our current understanding of the roles of plants in N2O emission is still controversial with field-based studies suggesting that N2O is in fact produced by soil microorganisms and simply diffuses through plants (Chang et al., 1998; Rusch and Rennenberg, 1998; Baruah et al., 2010; Machacova et al., 2013; Bowatte et al., 2014; Wen et al., 2017). However, other studies using a range of different plant species and conducted under sterile conditions provided convincing evidence that the N2O gas indeed is derived from a plant-inherent process, and not from the soil microbiome or microbes present on leaves (Goshima et al., 1999; Hakata et al., 2003; Lenhart et al., 2019). Although the underlying mechanisms remain to be elucidated in detail, there is evidence that N2O can be produced from nitric oxide (NO) in the mitochondria of plants under hypoxic conditions (for a review see Timilsina et al., 2020) and this is also relevant in the context that NO acts as a second messenger in plants (for recent reviews see Astier et al., 2018; Gupta et al., 2020). However, more relevant in relation to this study is the finding that N2O emission was specifically measured only when NO3^– was applied as the N source, but not with NH4 or glycine (Lenhart et al., 2019).

The data presented here are in support of the findings that N gas emission originates from plants since there was a significant difference between pots with plants and control pots, from which the above-ground plant tissue was removed immediately before the gas measurement. Since the roots were retained in the controls and similar microbiomes should be present in all pots, differences in gas emissions can be ascribed to activities from leaves. Overall, after N application, emission was higher in plants that had been grown under N-starvation conditions, suggesting that, within the duration of the experiments, the N-assimilation and -storage capacity in N-starved plants was insufficient, leading to higher N-gas emission. This is in agreement with the study from Schjoerring and Mattsson (2001) who reported higher NH3 losses from winter wheat that had received 75% of a standard N dose, compared to fully fertilised plants.

Likewise, differences between the genotypes included in this study were only observed in plants grown under N deficiency where NH3 and N2O emission was significantly higher in the low-GS genotype Claire compared to Paragon and Cadenza. However, analysis of the Australian variety Mace, which had low GS activity and also low gas emission, suggests that N gas emission is not simply a matter of GS activity.

Thus, more detailed comparative studies on N-gas emission in plants is clearly needed to establish the underlying mechanisms. However, the presented data are in support of studies by others that N-gas emission does occur from plants and that this is a response to N fertiliser application. Importantly, in this study we have found that emission of N2O is related to nitrate fertiliser application since it was not observed when N was applied as urea and was significantly reduced in the presence a nitrate reductase inhibitor, which is in agreement with the study by Lenhart et al. (2019) and our current understanding that N2O originates from plant NO3^– reduction. The role of N2O emission from plants in climate change has been realised (e.g., Smart and Bloom, 2001; Gogoi and Baruah, 2012; Lenhart et al., 2019) and needs to be addressed as a matter of urgency. The data presented here suggest that genotypic differences do exist that can be exploited for breeding and that N management and fertiliser choices would provide opportunities to reduce N2O emission from cropping systems.

Conclusion

The data presented here are showing that natural variation of GS activity exists in wheat and that genotypes respond differently to N-fertiliser application. There is thus an opportunity to exploit this natural variation for breeding. However, for this it will be important to better understand the underlying mechanisms of post-transcriptional and post-translational regulation of GS enzyme activity. It will also be important to establish to what extend GS activity is directly relevant for preventing N-gas emission and if other factors, such as e.g., NH4 and NO3^– storage capacity play important roles. This is not only relevant in relation to developing novel approaches towards enhancing crop N-fertiliser use efficiency, but even more so for the reduction of emission of the potent greenhouse gas N2O. Our data indicate that N2O emission is higher when N is applied to N-starved plants which warrants further investigations into the NO3^– uptake and assimilation pathways in plants, however, it also opens opportunities for addressing this by fertiliser management options and fertiliser choices.

Data Availability Statement

The original contributions presented in the study are included in the article/Supplementary Material, further inquiries can be directed to the corresponding author.

Author Contributions

SH was leading the project. MO conducted the glasshouse experiments. KH carried out the statistical analysis. AR conducted the field experiments. IC provided access to the Picarro instrument. DH and AT-B analysed the Picarro data. SH and MO wrote the manuscript. All authors contributed to the article and approved the submitted version.

Funding

Rothamsted Research receives strategic funding from the Biotechnology and Biological Sciences Research Council of the United Kingdom. We acknowledge support through the Designing Future Wheat (DFW) Strategic Programme (BB/P016855/1). The field experiment was supported by the United Kingdom Department for Environment, Food and Rural Affairs funding of the Wheat Genetic Improvement Network (CH1090). We also acknowledge support of MO and SH through the project “Novel Fertiliser Formulations and Management for African Agriculture” in collaboration with the Mohammed VI Polytechnic University, Morocco, funded by the Office Chérifien des Phosphates (OCP group).

Conflict of Interest

The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest.

Publisher’s Note

All claims expressed in this article are solely those of the authors and do not necessarily represent those of their affiliated organizations, or those of the publisher, the editors and the reviewers. Any product that may be evaluated in this article, or claim that may be made by its manufacturer, is not guaranteed or endorsed by the publisher.

Acknowledgments

We would like to thank our RRes colleagues Rowan Mitchell and Andy Phillips for their help retrieving the scaffold GS gene sequences.

Supplementary Material

The Supplementary Material for this article can be found online at: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2022.816475/full#supplementary-material

cytosolic 5′-nucleotidases I and II, AMP-activated kinase (AMPK), Purine cycle, Body Weight, Muscle Contraction,Triticum aestivum L, nitrogen fertilizer, N 2 O greenhouse gas, genetic diversity, glutamine synthetase, drought