Συνδυασμένη χρήση Τεχνικών Πολλαπλής Ενδαγγειακής Απεικόνισης στο Οξύ Στεφανιαίο Σύνδρομο

• ¹ Τμήμα Καρδιαγγειακής Ιατρικής, Ιατρικό Πανεπιστήμιο Wakayama, Wakayama, Ιαπωνία
• ² Τμήμα Καρδιαγγειακής Ιατρικής, Δημοτικό Νοσοκομείο Naga, Kinokawa, Ιαπωνία
• ³ Τμήμα Καρδιαγγειακής Ιατρικής, Shingu Municipal Hospital, Shingu, Ιαπωνία
• ⁴ School of Biomedical Engineering, Biomedical Instrument Institute, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China
• ⁵ Τομέας Καρδιολογίας, Κέντρο Καρδιάς, Γενικό Νοσοκομείο Cheng Hsin, Ταϊπέι, Ταϊβάν
• ⁶ Καρδιολογικό Τμήμα, Κινεζικό Γενικό Νοσοκομείο PLA, Πεκίνο, Κίνα
• ⁷ Τομέας Καρδιολογίας, Ιατρικό Κέντρο Asan, Πανεπιστήμιο Ulsan College of Medicine, Σεούλ, Νότια Κορέα

Οι πρόσφατες πρόοδοι στις τεχνικές ενδαγγειακής απεικόνισης κατέστησαν δυνατή την αξιολόγηση των υπαίτιων βλαβών του οξέος στεφανιαίου συνδρόμου (ACS) στο κλινικό περιβάλλον. Το ενδοαγγειακό υπερηχογράφημα (IVUS) είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη τεχνική ενδαγγειακής απεικόνισης που παρέχει εικόνες διατομής των στεφανιαίων αρτηριών. Το IVUS μπορεί να εκτιμήσει το φορτίο της πλάκας και την αναδιαμόρφωση του αγγείου. Η οπτική τομογραφία συνοχής (OCT) είναι μια τεχνική ενδαγγειακής απεικόνισης υψηλής ανάλυσης (10 μm) που χρησιμοποιεί εγγύς υπέρυθρο φως. Το OCT μπορεί να αναγνωρίσει βασικά χαρακτηριστικά του αθηρώματος, όπως ο λιπιδικός πυρήνας και το λεπτό ινώδες κάλυμμα. Η φασματοσκοπία κοντινού υπέρυθρου (NIRS) μπορεί να ανιχνεύσει τη λιπιδική σύνθεση αναλύοντας τις ιδιότητες απορρόφησης κοντά στο υπέρυθρο των στεφανιαίων πλακών. Το NIRS παρέχει ένα χημειόγραμμα του τοιχώματος της στεφανιαίας αρτηρίας, το οποίο επιτρέπει τον συγκεκριμένο ποσοτικό προσδιορισμό της συσσώρευσης λιπιδίων. Αυτές οι τεχνικές ενδαγγειακής απεικόνισης μπορούν να απεικονίσουν ιστολογικά χαρακτηριστικά ρήξης πλάκας, διάβρωσης της πλάκας και ασβεστοποιημένου όζου σε αλλοιώσεις του ACS. Ωστόσο, καμία μεμονωμένη τεχνική απεικόνισης δεν είναι τέλεια και η καθεμία έχει τα αντίστοιχα δυνατά σημεία και περιορισμούς. Σε αυτήν την ανασκόπηση, συνοψίζουμε τις επιπτώσεις της συνδυασμένης χρήσης πολλαπλών τεχνικών ενδοαγγειακής απεικόνισης για την αξιολόγηση της παθολογίας του ACS και την καθοδήγηση της ειδικής θεραπείας για τη βλάβη.

Εισαγωγή

Αρκετές μελέτες αυτοψίας έχουν αποκαλύψει την παθολογία των ενοχικών βλαβών του οξέος στεφανιαίου συνδρόμου (ACS). Το ACS προκαλείται από τρεις κύριους μηχανισμούς: ρήξη πλάκας, διάβρωση πλάκας και ασβεστοποιημένο οζίδιο. Η ρήξη της πλάκας είναι ο πιο συνηθισμένος (55–60%) μηχανισμός για το ACS (1). Η ρήξη της πλάκας έχει συνήθως έναν εκτεταμένο λιπιδικό πυρήνα που περιέχει μεγάλους αριθμούς κρυστάλλων χοληστερόλης και ένα λεπτό ινώδες κάλυμμα (lt;65 μm) που διεισδύεται από αφρώδη μακροφάγα. Η διάβρωση της πλάκας εντοπίζεται στο 30-35% του ACS (1). Το μεγαλύτερο μέρος της διάβρωσης της πλάκας συμβαίνει σε περιοχές πάχυνσης του εσωτερικού χιτώνα, με ελάχιστες ή καθόλου ενδείξεις λιπιδίου. Ο ασβεστοποιημένος όζος εντοπίζεται στο 2-7% του ACS (1). Ο ασβεστοποιημένος όζος είναι μια πλάκα με θρόμβους αυλού που εμφανίζει ασβεστοειδείς όζους να προεξέχουν στον αυλό μέσω ενός διαταραγμένου λεπτού ινώδους καλύμματος.

Οι πρόσφατες πρόοδοι στις τεχνικές ενδαγγειακής απεικόνισης κατέστησαν δυνατή την αξιολόγηση των υπαίτιων βλαβών του ACS στο κλινικό περιβάλλον. Στις αρχές της δεκαετίας του 1990, το ενδοαγγειακό υπερηχογράφημα (IVUS) έγινε κλινικά διαθέσιμο, επιτρέποντας τη μορφολογική αξιολόγηση των τοιχωμάτων των στεφανιαίων αρτηριών. Στα μέσα της δεκαετίας του 2000, αναπτύχθηκε η οπτική τομογραφία συνοχής (OCT) και η υψηλή της ανάλυση επιτρέπει πιο ακριβείς παρατηρήσεις της στεφανιαίας αθηροσκλήρωσης. Στα τέλη της δεκαετίας του 2000, εφαρμόστηκε κλινικά η φασματοσκοπία εγγύς υπέρυθρη (NIRS), η οποία επιτρέπει τη διάγνωση της σύνθεσης της πλάκας. Αυτές οι τεχνικές ενδαγγειακής απεικόνισης μπορούν να απεικονίσουν ιστολογικά χαρακτηριστικά ρήξης πλάκας, διάβρωσης της πλάκας και ασβεστοποιημένου όζου σε αλλοιώσεις του ACS (2).

IVUS

Το IVUS είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη τεχνική ενδαγγειακής απεικόνισης στον κόσμο. Το IVUS παρέχει εικόνες διατομής των στεφανιαίων αρτηριών. Το IVUS μπορεί να αναγνωρίσει τη ρήξη της πλάκας και τον ασβεστοποιημένο οζίδιο, αλλά όχι τη διάβρωση της πλάκας. Η ρήξη πλάκας αναγνωρίζεται ως έλκος με εσοχή στην πλάκα που ξεκινά από το όριο αυλού-έσω χιτώνα (3, 4). Οι βλάβες με ρήξη πλάκας συνήθως έχουν μεγάλο φορτίο πλάκας με θετική αγγειακή αναδιαμόρφωση και εμφανίζουν υποηχοϊκή πλάκα με ακουστική σκιά που προέρχεται από τον λιπιδικό πυρήνα (η λεγόμενη εξασθενημένη πλάκα) (5). Η αδρή ανάλυση (100–200 μm) του IVUS δεν μπορεί να προσδιορίσει την παρουσία ή την απουσία μικρής ρήξης, επομένως αυτή η τεχνική δεν μπορεί να διαγνώσει τη διάβρωση της πλάκας. Ο ασβεστοποιημένος όζος αναγνωρίζεται από ένα κυρτό σχήμα της επιφάνειας του αυλού με φωτεινή ηχώ, ογκώδες σχήμα, ακανόνιστη επιφάνεια, και ακουστική σκίαση (6). Οι βλάβες με ασβεστοποιημένο οζίδιο έχουν συχνά εκτεταμένο φύλλο ασβεστίου.

ΟΚΤ

Το OCT είναι μια τεχνική ενδαγγειακής απεικόνισης υψηλής ανάλυσης (10 μm) που χρησιμοποιεί εγγύς υπέρυθρο φως. Η OCT είναι η πιο αξιόπιστη τεχνική για την αξιολόγηση της πολύπλοκης μορφολογίας των ενόχων βλαβών ACS, αν και αυτή η τεχνική απαιτεί ορισμένες περίπλοκες διαδικασίες όπως η ενδοστεφανιαία έγχυση σκιαγραφικού για την αφαίρεση των ερυθρών αιμοσφαιρίων για λήψη εικόνας. Το OCT μπορεί να αναγνωρίσει τον πυρήνα λιπιδίων (χαρακτηρίζεται από περιοχές φτωχού σήματος με διάχυτα όρια), λεπτό ινώδες κάλυμμα (χαρακτηρίζεται από ομοιογενείς, πλούσιες σε σήμα περιοχές) και ασβεστοποίηση (χαρακτηρίζεται από καλά οριοθετημένες, φτωχές σε σήμα περιοχές με αιχμηρά όρια) σε αθηροσκληρωτικά πλάκες (7). Η ρήξη πλάκας ορίζεται ως η διάσπαση του λεπτού ινώδους καλύμματος με μια διαυγή κοιλότητα που σχηματίζεται μέσα στην πλάκα (8). Οι βλάβες με ρήξη πλάκας συχνά έχουν μακροφάγα (που ορίζονται από πλούσια σε σήμα, διακριτές ή συρρέουσες περιοχές στίξης με σκίαση), αγγεία αγγείων (που ορίζονται από φτωχά σήματα, καλά οριοθετημένα κενά μέσα στην πλάκα), κρύσταλλοι χοληστερόλης (που ορίζονται ως λεπτές, γραμμικές περιοχές υψηλής έντασης σήματος εντός της λιπιδικής πλάκας) και επουλωμένες πλάκες (καθορισμένες ως πλάκες με 1 ή περισσότερες στρώσεις με διαφορετική οπτική πυκνότητα) (9, 10). Η διάβρωση της πλάκας αναγνωρίζεται από την παρουσία προσκολλημένου θρόμβου που επικαλύπτει μια άθικτη (δηλ. απουσία διάρρηξης του ινώδους καλύμματος) πλάκας χωρίς επιφανειακό λιπίδιο ή ασβεστοποίηση (11). Η απουσία ενδοθηλιακών κυττάρων είναι ένα βασικό παθολογικό κριτήριο για τη διάβρωση, ωστόσο η ανάλυση του τρέχοντος OCT δεν μπορεί να ανιχνεύσει μεμονωμένα ενδοθηλιακά κύτταρα. Δεδομένου ότι οι μετρήσεις OCT της διάβρωσης της πλάκας διαφέρουν από τον παθολογικό ορισμό, ο όρος “διάβρωση που προέρχεται από την OCT” χρησιμοποιείται αντί για διάβρωση. Ο ασβεστοποιημένος όζος ορίζεται από τη διάσπαση του ινώδους καλύμματος που ανιχνεύεται πάνω από μια ασβεστοποιημένη πλάκα που χαρακτηρίζεται από προεξέχουσα ασβεστοποίηση (11). Τα περισσότερα ασβεστοποιημένα οζίδια έχουν επιφανειακά εντοπισμένη μεγάλη ασβεστοποίηση. Σε αλλοιώσεις του ACS, μια μεγάλη ποσότητα θρόμβου μπορεί να προκαλέσει ισχυρή εξασθένηση του εγγύς υπέρυθρου φωτός και να παρεμποδίσει την ακριβή αξιολόγηση OCT της μορφολογίας της πλάκας.

NIRS

Το NIRS μπορεί να αναγνωρίσει τη λιπιδική σύνθεση αναλύοντας τις ιδιότητες απορρόφησης κοντά στο υπέρυθρο των στεφανιαίων πλακών. Το NIRS παρέχει ένα χημειογράφημα του τοιχώματος της στεφανιαίας αρτηρίας, το οποίο επιτρέπει την ανίχνευση του λιπιδικού πυρήνα και την ειδική ποσοτικοποίηση της συσσώρευσης λιπιδίων που μετράται ως δείκτης επιβάρυνσης πυρήνα λιπιδίων (LCBI) και μέγιστο LCBI σε οποιοδήποτε τμήμα 4 mm (maxLCBI4mm). Σε αντίθεση με το IVUS και το OCT, το NIRS μπορεί να μετρήσει με ακρίβεια το λιπιδικό συστατικό ακόμη και παρουσία θρόμβων. Το NIRS είναι επί του παρόντος διαθέσιμο ως συνδυαστικός καθετήρας με IVUS. Το NIRS μπορεί να αντισταθμίσει την έλλειψη ικανότητας του IVUS να ανιχνεύει τη διάβρωση της πλάκας. Η διάβρωση της πλάκας έχει σημαντικά χαμηλότερο maxLCBI4mm από τη ρήξη της πλάκας και τον ασβεστοποιημένο οζίδιο (12, 13). Η βέλτιστη τιμή αποκοπής για maxLCBI4mm για τη διαφοροποίηση μεταξύ της διάβρωσης της πλάκας και άλλων τύπων πλάκας είναι ~400 (12). Με την αξιολόγηση της κοιλότητας της πλάκας, του κυρτού ασβεστίου,

Πολυτροπική απεικόνιση

Οι πληροφορίες που λαμβάνονται από πολλαπλές τεχνικές απεικόνισης μπορούν να αλληλοσυμπληρώνονται. Στην πραγματικότητα, εκτός από τη μορφολογική αξιολόγηση, ο χαρακτηρισμός του ιστού της πλάκας είναι χρήσιμος για τη διαφοροποίηση της ρήξης της πλάκας, της διάβρωσης της πλάκας και του ασβεστοποιημένου όζου (Πίνακας 1). Η ρήξη της πλάκας αναγνωρίζεται από τη διάρρηξη του ινώδους καλύμματος και την ενδοπλάκα κοιλότητα στο IVUS/OCT, την εξασθενημένη πλάκα στο IVUS, τη μεγάλη λιπιδική πλάκα στο OCT και το υψηλό maxLCBI4mm (gt;400) στο NIRS (Εικόνα 1-I). Η διάβρωση της πλάκας αναγνωρίζεται από το άθικτο ινώδες κάλυμμα και την ινωτική πλάκα στο OCT και το χαμηλό maxLCBI4mm (lt;400) στο NIRS (Εικόνα 1-II). Το ασβεστοποιημένο οζίδιο αναγνωρίζεται από το κυρτό ασβέστιο και το μεγάλο φύλλο ασβεστίου στο IVUS/OCT και το ενδιάμεσο maxLCBI4mm στο NIRS (Εικόνα 1-III).

Πίνακας 1 . Διαγνωστικά κριτήρια για ρήξη πλάκας, διάβρωση και ασβεστοποιημένα οζίδια.

Εικόνα 1 . Πολυτροπική απεικόνιση ρήξης πλάκας, διάβρωσης πλάκας και ασβεστοποιημένου όζου. Ρήξη πλάκας (Ι) Η αγγειογραφία δείχνει απόφραξη του εγγύς LAD, της ένοχης βλάβης του STEMI (A) . Το IVUS παρουσιάζει εξέλκωση (βέλος) με εσοχή στην επιφάνεια εξασθενημένης πλάκας (αστερίσκος) (B,D) . Το NIRS προσδιορίζει μεγάλη περιεκτικότητα σε λιπίδια (maxLCBI4mm = 920) (B–D) . Το OCT αποκαλύπτει ρήξη πλάκας που χαρακτηρίζεται από διάρρηξη ινώδους καλύμματος (κεφαλή βέλους) και σχηματισμό κοιλότητας (αστέρι) μέσα στην πλάκα (Ε) . Διάβρωση πλάκας (II) Η αγγειογραφία δείχνει σοβαρή στένωση στη μέση LCX, την ενοχική βλάβη του STEMI (F) . Το IVUS καταδεικνύει την απουσία έλκους κατά πλάκας (G,I). Το NIRS προσδιορίζει μια μικρή περιεκτικότητα σε λιπίδια (maxLCBI4mm = 129) (G–I) . Το OCT αποκαλύπτει διάβρωση πλάκας που χαρακτηρίζεται από την παρουσία προσκολλημένου θρόμβου (αστερίσκος) που επικαλύπτει μια άθικτη ινωτική πλάκα (αστέρια) (J) . Ασβεστοποιημένο οζίδιο (II) Η αγγειογραφία δείχνει σοβαρή στένωση και ελάττωμα ενδοαυλικής πλήρωσης στη μέση RCA, την ενοχική βλάβη του non-STEMI (K) . Το IVUS δείχνει ένα κυρτό ασβέστιο με ακανόνιστη επιφάνεια (βέλος) και μεγάλο επιφανειακό ασβέστιο (αστερίσκοι) (L,N) . Το NIRS προσδιορίζει μια μέτρια περιεκτικότητα σε λιπίδια (maxLCBI4mm = 208) (L–N) . Το OCT αποκαλύπτει ασβεστοποιημένο οζίδιο που χαρακτηρίζεται από ένα προεξέχον ασβέστιο με θρόμβους (κεφαλή βέλους) και μεγάλο επιφανειακό ασβέστιο (αστέρια) (O). IVUS, ενδοαγγειακό υπερηχογράφημα; LAD, αριστερή πρόσθια κατιούσα αρτηρία. LCBI, δείκτης επιβάρυνσης πυρήνα λιπιδίων. LCX, αριστερή κυκλική αρτηρία. NIRS, φασματοσκοπία κοντά στο υπέρυθρο. OCT, οπτική τομογραφία συνοχής. RCA, δεξιά στεφανιαία αρτηρία. STEMI, Έμφραγμα του μυοκαρδίου με ανάσπαση του τμήματος ST.

Αντίκτυπος στη στρατηγική θεραπείας

Πληροφορίες από πολλαπλές τεχνικές απεικόνισης επηρεάζουν τις στρατηγικές διαδερμικής στεφανιαίας παρέμβασης (PCI) και τη διαστρωμάτωση κινδύνου στο ACS. Η ρήξη της πλάκας διατρέχει υψηλό κίνδυνο βραδείας ροής ή μη επαναρροής, περιφερικού εμβολισμού και μικροαγγειακής απόφραξης που σχετίζεται με PCI (14–16). Αυτό συμβαίνει γιατί οι βλάβες με ρήξη πλάκας είναι πλούσιες σε θρόμβους και λιπιδικούς πυρήνες που μπορεί να είναι εμβολικές πηγές. Μια προοπτική τυχαιοποιημένη ελεγχόμενη δοκιμή με χρήση IVUS έδειξε ότι η χρήση συσκευής απομακρυσμένης προστασίας ήταν αποτελεσματική στην πρόληψη της αργής ροής κατά τη διάρκεια της PCI για εξασθενημένες πλάκες (17). Η διάβρωση της πλάκας έχει καλύτερη πρόγνωση μετά από PCI σε σύγκριση με τη ρήξη της πλάκας (18, 19). Η στρατηγική χωρίς στεντ μπορεί να είναι μια επιλογή για τη διάβρωση της πλάκας εάν ληφθεί επαρκής αυλός μόνο με αναρρόφηση θρόμβου. Μια προοπτική παρατήρηση OCT έδειξε ότι η πλειοψηφία (92. Το 5%) των ασθενών με ACS που προκαλείται από διάβρωση της πλάκας που αντιμετωπίστηκαν με διπλή αντιαιμοπεταλιακή θεραπεία χωρίς στεντ παρέμειναν απαλλαγμένοι από μείζονα ανεπιθύμητο καρδιαγγειακό επεισόδιο κατά τη διάρκεια της περιόδου παρακολούθησης 1 έτους (20). Ο ασβεστοποιημένος όζος σχετίζεται με την υποέκταση του στεντ που είναι ένας πολύ γνωστός προγνωστικός παράγοντας κακής κλινικής έκβασης. Ένα μητρώο PCI καθοδηγούμενο από OCT αποκάλυψε ότι η ελάχιστη περιοχή stent μετά την PCI ήταν σημαντικά μικρότερη σε ασβεστοποιημένο οζίδιο από ό,τι στη ρήξη πλάκας και στη διάβρωση της πλάκας, με το μισό ασβεστοποιημένο οζίδιο να έχει δείκτη επέκτασης stent (υπολογισμένο με την ελάχιστη περιοχή stent / περιοχή αυλού αναφοράς x 100) lt;80% (21). Απαιτείται περαιτέρω έρευνα για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας πιο επιθετικών διαδικασιών όπως η περιστροφική αθηρεκτομή, η στεφανιαία αγγειοπλαστική με λέιζερ excimer και η ενδοαγγειακή λιθοτριψία κρουστικών κυμάτων για ασβεστοποιημένα οζίδια.

Περιορισμοί

Κάθε τεχνική ενδαγγειακής απεικόνισης έχει τους εγγενείς περιορισμούς της. Το IVUS έχει αδρή ανάλυση που είναι ανεπαρκής για την ανίχνευση ρήξης λεπτών ινωδών καλυμμάτων και μικρών ελκών στην επιφάνεια της πλάκας. Το OCT έχει μικρό οπτικό πεδίο και μικρό βάθος απεικόνισης που συχνά αποκλείουν την αξιολόγηση του φορτίου της πλάκας και του μοτίβου αναδιαμόρφωσης. Το NIRS δεν είναι σε θέση να αναγνωρίσει τα ινώδη καλύμματα, επιπλέον της έλλειψης ικανότητας μορφολογικής αξιολόγησης.

Μελλοντικές Προοπτικές

Για να ξεπεραστούν οι περιορισμοί κάθε τεχνικής απεικόνισης, έχουν αναπτυχθεί νέες προσπάθειες για μεθοδολογίες σύντηξης δεδομένων και σχέδια για υβριδικούς καθετήρες διπλού καθετήρα. Η συνδυασμένη απεικόνιση IVUS-OCT παρέχει μια συντηκτική εικόνα OCT με υψηλή ανάλυση για την επιφάνεια της πλάκας και IVUS με μεγάλο βάθος απεικόνισης (22). Η συνδυασμένη απεικόνιση IVUS-OCT επιτρέπει μια ολοκληρωμένη απεικόνιση της στεφανιαίας αθηρωματικής πλάκας. Η συνδυασμένη απεικόνιση NIRS-OCT επιτρέπει την ανίχνευση του λιπιδικού πυρήνα με φασματοσκοπία και δομικά χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένου του πάχους του καλύμματος, με OCT (23). Η συνδυασμένη απεικόνιση NIRS-OCT θα διευκολύνει την αναγνώριση του ινοαθηρώματος με λεπτό πώμα, το οποίο αναγνωρίζεται ως πρόδρομος της ρήξης της πλάκας.

συμπέρασμα

Αυτή τη στιγμή, δεν υπάρχει καμία ενιαία τεχνική απεικόνισης που να είναι τέλεια για την αξιολόγηση της αθηροσκλήρωσης. Ο συνδυασμός πολλαπλών τεχνικών απεικόνισης παρέχει πολλές πληροφορίες για τη μορφολογία και τη σύνθεση της αθηροσκλήρωσης. Η λεπτομερής στεφανιαία αξιολόγηση με πολλαπλές τεχνικές απεικόνισης επιτρέπει την καλύτερη κατανόηση της παθολογίας του ACS και καθοδηγεί τη θεραπεία ειδικής βλάβης.

Συνεισφορές Συγγραφέων

Ο Τ.Κ έγραψε το χειρόγραφο. Οι KT, YI και YS συνέλεξαν εικόνες IVUS, OCT και NIRS. Οι ST, T-PT, YC και D-WP εξέτασαν και αναθεώρησαν το χειρόγραφο. Όλοι οι συγγραφείς ενέκριναν το τελικό χειρόγραφο.

Χρηματοδότηση

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε εν μέρει από το JSPS KAKENHI Grant Number JP19K12846.

Σύγκρουση συμφερόντων

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη απουσία εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.

Σημείωση εκδότη

Όλοι οι ισχυρισμοί που εκφράζονται σε αυτό το άρθρο είναι αποκλειστικά εκείνοι των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραιτήτως αυτούς των συνδεδεμένων οργανισμών τους ή του εκδότη, των εκδοτών και των κριτικών. Οποιοδήποτε προϊόν μπορεί να αξιολογηθεί σε αυτό το άρθρο ή ισχυρισμός που μπορεί να προβληθεί από τον κατασκευαστή του, δεν είναι εγγυημένο ή εγκεκριμένο από τον εκδότη.

Η Αναπτυξιακή Ανάλυση Μεταγραφωμάτων Σπόρων Mimulus αποκαλύπτει λειτουργικές ομάδες έκφρασης γονιδίων και τέσσερα εντυπωμένα γονίδια που εκφράζονται στο ενδοσπέρμιο

• ¹ Τμήμα Φυτικής και Μικροβιακής Βιολογίας, North Carolina State University, Raleigh, NC, Ηνωμένες Πολιτείες
• ² Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Duke, Durham, NC, Ηνωμένες Πολιτείες
• ³ GreenUPorto, Κέντρο Έρευνας Αειφόρου Αγροτροφικής Παραγωγής, Τμήμα Βιολογίας, Σχολή Θετικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο του Πόρτο, Πόρτο, Πορτογαλία
• ⁴ Τμήμα Βιολογίας, Κρατικό Πανεπιστήμιο του Σαν Ντιέγκο, Σαν Ντιέγκο, Καλιφόρνια, Ηνωμένες Πολιτείες
• ⁵ Τμήμα Βιολογίας, Berea College, Berea, KY, Ηνωμένες Πολιτείες

Η διπλή γονιμοποίηση του θηλυκού γαμετόφυτου ξεκινά την εμβρυογένεση και την ανάπτυξη του ενδοσπερμίου στους σπόρους μέσω της ενεργοποίησης γονιδίων που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση των κυττάρων, στη διαμόρφωση των οργάνων και στην ανάπτυξη. Ένα υποσύνολο γονιδίων που εκφράζονται στο ενδοσπέρμιο εμφανίζουν αποτυπωμένη έκφραση και η σωστή ισορροπία της γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των γονικών αλληλόμορφων είναι κρίσιμη για τη σωστή ανάπτυξη του ενδοσπερμίου και των σπόρων. Χρησιμοποιούμε μια ανάλυση μεταγραφικών χρονοσειρών για να εντοπίσουμε γονίδια που σχετίζονται με βασικές αλλαγές στην ανάπτυξη των σπόρων, συμπεριλαμβανομένων γονιδίων που σχετίζονται με τη σύνθεση δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος, τον μιτωτικό κυτταρικό κύκλο, την οργάνωση της χρωματίνης, τη σύνθεση αυξίνης, τον μεταβολισμό των λιπαρών οξέων και την ωρίμανση των σπόρων. Συσχετίζουμε αυτά τα γονίδια με μορφολογικές αλλαγές στους σπόρους Mimulus. Εντοπίζουμε επίσης τέσσερις μεταγραφές που εκφράζονται με ενδοσπέρμιο που εμφανίζουν εντυπωμένη (πατρική) προκατάληψη έκφρασης. Η αποτυπωμένη κατάσταση αυτών των τεσσάρων γονιδίων διατηρείται σε άλλα ανθοφόρα φυτά, υποδηλώνοντας ότι είναι λειτουργικά σημαντικά στην ανάπτυξη του ενδοσπερμίου. Η μελέτη μας διερευνά τη γονιδιακή ρυθμιστική δυναμική σε ένα είδος με εξαρχής ανάπτυξη κυτταρικού ενδοσπερμίου, διευρύνοντας την ταξινομική εστίαση της βιβλιογραφίας στην έκφραση γονιδίων στους σπόρους. Επιπλέον, είναι η πρώτη που επικυρώνει γονίδια με αποτυπωμένη έκφραση ενδοσπερμίου στο Mimulus guttatus και θα ενημερώσει μελλοντικές μελέτες σχετικά με τα γενετικά αίτια της αποτυχίας των σπόρων σε αυτό το σύστημα μοντέλου.

Εισαγωγή

Με την εμφάνισή τους στην Πρώιμη Κρητιδική περίοδο, τα φυτά που φέρουν σπόρους διαφοροποιήθηκαν γρήγορα, εκτοπίζοντας παλαιότερες γενεαλογίες φυτών και αποικίζοντας σχεδόν κάθε χερσαίο βιότοπο (Lidgard and Crane, 1988, Crane and Lidgard, 1989, Magallón and Castillo, 1989). Μεταξύ των πολλών παραγόντων που επέτρεψαν την ταχεία άνοδό τους στην κυριαρχία ήταν η εμφάνιση των σπόρων, μια σημαντική εξελικτική και αναπαραγωγική καινοτομία που απελευθερώνει τα αγγειακά φυτά από την εξάρτηση από το νερό για γαμετοφυτική διασπορά και επιτρέπει στην επόμενη σποροφυτική γενιά να καθυστερήσει τη βλάστηση έως ότου οι συνθήκες είναι ευνοϊκές για ανάπτυξη και αναπαραγωγή. Οι σπόροι του αγγειόσπερμου σχηματίζονται με μια μοναδική διαδικασία που ονομάζεται διπλή γονιμοποίηση.

Μετά από διπλή γονιμοποίηση, οι σπόροι του αγγειόσπερμου υφίστανται διαδικασίες κυτταρικής διαφοροποίησης, διαμόρφωσης και ανάπτυξης. Η πρώιμη εμβρυογένεση καθιερώνει το βασικό σχέδιο σώματος βλαστών-ριζών, μετά από το οποίο ο εμβρυϊκός ιστός και τα κύρια όργανα του εμβρύου σχηματίζονται με μορφογένεση (West and Harada, 1993, Jürgens et al., 1994). Η ανάπτυξη του ενδοσπερμίου στα σύγχρονα φυτά μπορεί να χαρακτηριστεί από τρεις κύριους τύπους: ab initio κυτταρική, όπου κάθε πυρηνική διαίρεση συνοδεύεται από κυτταρική διαίρεση. πυρηνική, όπου μια συγκυτιακή φάση ελεύθερης πυρηνικής διαίρεσης ακολουθείται από σχηματισμό κυτταρικού τοιχώματος. και helobial, όπου μια αρχική διαίρεση του πρωτεύοντος κυττάρου ενδοσπερμίου καταλήγει σε δύο περιοχές, τουλάχιστον μία από τις οποίες θα παρουσιάζει ελεύθερη πυρηνική ανάπτυξη (Friedman, 1994· Friedman, 2001). Η ανάπτυξη κυτταρικού ενδοσπερμίου βρίσκεται σε πολλές βασικές γενεαλογίες αγγειοσπέρματος (Friedman, 2001) και πολλές διαφορετικές ομάδες αστεριδών, και πιθανότατα έχει εξελιχθεί πολλές φορές ανεξάρτητα (Geeta, 2003). Καθώς ο σπόρος ωριμάζει, το ενδοσπέρμιο θα συσσωρεύει αποθέματα αποθήκευσης για τη διατροφική υποστήριξη του ώριμου εμβρύου. Μόλις σχηματιστεί πλήρως, το ώριμο έμβρυο θα εισέλθει σε μια περίοδο αναπτυξιακής διακοπής ως προετοιμασία για λήθαργο.

Η συντονισμένη ανάπτυξη μεταξύ των ιστών των σπόρων είναι κρίσιμη για τη διασφάλιση της φυσιολογικής ανάπτυξης και παίζει σημαντικό ρόλο στον προσδιορισμό του μεγέθους των ώριμων σπόρων (Garcia et al., 2003; Ingouff et al., 2006; Sechet et al., 2018) και πρόσφατες βελτιώσεις στο Η μεταγραφική έχει βελτιώσει σημαντικά τις γνώσεις μας για τη δυναμική της γονιδιακής έκφρασης που εμπλέκεται (Belmonte et al., 2013). Στο Arabidopsis, πολλά γονίδια είναι ειδικά για τους σπόρους, συμπεριλαμβανομένων των μεταγραφικών παραγόντων (TFs) που ρυθμίζουν τα γονιδιακά δίκτυα που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση των κυττάρων και την αποθήκευση θρεπτικών συστατικών (Le et al., 2010; Chen et al., 2014; Yi et al., 2019). Ένα υποσύνολο γονιδίων που εκφράζονται στο ενδοσπέρμιο εμφανίζουν αποτυπωμένη έκφραση, ένα επιγενετικό φαινόμενο κατά το οποίο τα αλληλόμορφα εκφράζονται διαφορικά ανάλογα με τη γονική προέλευσή τους (Grossniklaus et al., 1998; Hsieh et al., 2011; Luo et al., 2011; Waters et al., 2013; Florez-Rueda et al., 2016; Zhang et al., 2016; Lafon-Placette et al., 2018).

Μέχρι σήμερα, οι περισσότερες μελέτες για την έκφραση γονιδίων στους σπόρους έχουν επικεντρωθεί σε μια ταξινομικά στενή ομάδα ειδών με πυρηνικό ενδοσπέρμιο, όπως το Arabidopsis και καλλιέργειες από την οικογένεια Poaceae. Υπάρχει έλλειψη μελετών που να απεικονίζουν τη μεταγραφική δυναμική των σπόρων με την ανάπτυξη κυτταρικού ενδοσπερμίου παρά την επικράτηση αυτού του αναπτυξιακού φαινοτύπου. Γεμίζουμε αυτό το κενό χαρακτηρίζοντας τη δυναμική της γονιδιακής έκφρασης που σχετίζεται με την ανάπτυξη των σπόρων στο Mimulus, έναν αστερίδιο που εμφανίζει εξαρχής ανάπτυξη κυτταρικού ενδοσπερμίου. Εκτελούμε ένα πείραμα προσδιορισμού αλληλουχίας RNA χρονοσειράς για να απεικονίσουμε τα κύρια μεταγραφικά συμβάντα που σχετίζονται με την πρώιμη ανάπτυξη των σπόρων. Η δουλειά μας έχει δύο βασικούς στόχους: πρώτον, εστιάζοντας σε ένα φυλογενετικά αποκλίνον είδος με ανάπτυξη κυτταρικού ενδοσπερμίου, θα χρησιμεύσει ως πηγή δεδομένων που θα επιτρέψει συγκριτικές μελέτες της γονιδιακής έκφρασης σε φυτά σπόρων. Δεύτερον, επειδή η βιωσιμότητα των υβριδικών σπόρων είναι ένα κοινό αποτέλεσμα του υβριδισμού και μπορεί να είναι μια κύρια αιτία ειδογένεσης σε φυτά, συμπεριλαμβανομένου του Mimulus, ο χαρακτηρισμός της μεταγραφικής δυναμικής των κανονικά αναπτυσσόμενων σπόρων θα παρέχει το πλαίσιο για μελλοντικές μελέτες σχετικά με αλλαγές γονιδιακής έκφρασης που σχετίζονται με τη θνησιμότητα των υβριδικών σπόρων. Οι αποτυπωμένοι τόποι μπορεί να διαδραματίσουν βασικό ρόλο στη σωστή ανάπτυξη του ενδοσπερμίου (Grossniklaus et al., 1998) και η απόκλιση στην κατάσταση αποτύπωσης των γονιδίων έχει συνδεθεί με την ταχεία εμφάνιση αναπαραγωγικών φραγμών μεταξύ ακόμη και στενά συγγενών ειδών (Florez-Rueda et al. , 2016· Lafon-Placette et al., 2018) συμπεριλαμβανομένου του Mimulus (Kinser et al., 2018). Έτσι, αν και ο σχεδιασμός της μελέτης μας απαγορεύει τη συστηματική διαλογή για εντυπωμένους τόπους, εξετάζουμε τα δεδομένα μας για γονίδια που εμφανίζουν πατρικά αποτυπωμένη έκφραση στο ενδοσπέρμιο, καθώς τέτοια γονίδια έχουν εμπλακεί στην εμφάνιση μη βιωσιμότητας των υβριδικών σπόρων. Εντοπίζουμε γονίδια των οποίων η έκφραση παρουσιάζει σημαντικές χρονικές αλλαγές που σχετίζονται με βασικές αναπτυξιακές μετατοπίσεις και χαρακτηρίζουμε τα μοτίβα συνέκφρασης και τις βιολογικές τους λειτουργίες χρησιμοποιώντας ομαδοποίηση K-means και αναλύσεις εμπλουτισμού γονιδιακής οντολογίας. Εντοπίζουμε επίσης και επικυρώνουμε τέσσερα γονίδια (ATRX5, MBD13, DnaJ, BGAL11) που είναι πατρικά αποτυπωμένα και των οποίων τα ομόλογα είναι αποτυπωμένα σε άλλα φυτά, αλλά δεν συνδέονται με αποτυχία υβριδικού ενδοσπερμίου στο Mimulus (Kinser et al., 2018) ή άλλο taxa (Hatorangan et al., 2016; Florez-Rueda et al., 2016; Lafon-Placette et al., 2018).

Υλικά και μέθοδοι

Εξετάσαμε υβριδικούς σπόρους από μια συμβατή διασταύρωση μεταξύ δύο μελών του συμπλέγματος M. guttatus: ενός ετήσιου M. guttatus προσαρμοσμένο σε σερπεντίνη και του Mimulus pardalis, ενός προαιρετικά αυτόνομου ετήσιου που είναι πλήρως αλληλεπιδραστικό με το διασταυρούμενο M. guttatus. Ο σπόρος M. pardalis συλλέχτηκε το 2005 κοντά στο ορυχείο Star-Excelsior στην Copperopolis, CA (−120.856W, 38.153N). Ο σπόρος M. guttatus συλλέχτηκε το 2008 από το φυσικό καταφύγιο Donald and Sylvia McLaughlin στο Lake County, CA (−122.415W, 38.861N). Οι ενδογαμικές σειρές από κάθε πληθυσμό σχηματίστηκαν από τουλάχιστον πέντε γενιές αυτοαναπαραγωγής και ονομάζονται SEC39 (M. pardalis) και CSS4 (M. guttatus), οδηγώντας σε μια προσδοκία μέγιστης ετεροζυγωτίας 3% σε επίπεδο γονιδιώματος σε κάθε γραμμή. Όλα τα άτομα που χρησιμοποιούνται εδώ για μορφολογικές αναλύσεις καθώς και για προσδιορισμό αλληλουχίας DNA και RNA προέρχονται από αυτές τις ενδογαμικές γραμμές. Επιλέξαμε αυτούς τους δύο πληθυσμούς επειδή είναι αλληλεπιδράσεις (με βάση την προηγούμενη αδημοσίευτη εργασία μας και τους Macnair και Cumbes (1989)) αλλά αρκετά γενετικά διακριτοί ώστε να μας επιτρέψει να διακρίνουμε την αλληλική προέλευση των γονιδιακών SNP και, επομένως, να αναζητήσουμε γονίδια που δυνητικά εμφανίζουν M. guttatus-bias. Όλοι οι σπόροι στρωματοποιήθηκαν εν ψυχρώ για 10 ημέρες στους 4°C πριν μεταφερθούν σε θάλαμο ανάπτυξης σε 18-ωρες ημέρες, 21°C και 30% σχετική υγρασία. Οι διασταυρώσεις και οι αυτο-επικονιάσεις πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Oneal et al., 2016). Όλοι οι σπόροι στρωματοποιήθηκαν εν ψυχρώ για 10 ημέρες στους 4°C πριν μεταφερθούν σε θάλαμο ανάπτυξης σε 18-ωρες ημέρες, 21°C και 30% σχετική υγρασία. Οι διασταυρώσεις και οι αυτο-επικονιάσεις πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Oneal et al., 2016). Όλοι οι σπόροι στρωματοποιήθηκαν εν ψυχρώ για 10 ημέρες στους 4°C πριν μεταφερθούν σε θάλαμο ανάπτυξης σε 18-ωρες ημέρες, 21°C και 30% σχετική υγρασία. Οι διασταυρώσεις και οι αυτο-επικονιάσεις πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Oneal et al., 2016).

Ιστολογία σπόρων

Χαρακτηρίσαμε τη μορφολογία και την αναπτυξιακή οντογένεση των αυτοφυών και υβριδικών σπόρων των M. pardalis και M. guttatus προκειμένου να παρέχουμε ένα αναπτυξιακό πλαίσιο για την ανάλυση χρονοσειρών της γονιδιακής έκφρασης. Όλοι οι καρποί συλλέχθηκαν από λουλούδια που είχαν αφαιρεθεί 1-3 ημέρες πριν από τη γονιμοποίηση. Χρησιμοποιήσαμε LR-white embedding για να απεικονίσουμε και να κατηγοριοποιήσουμε τη μορφολογική εξέλιξη της ανάπτυξης των σπόρων. Οι ωοθήκες και οι καρποί συλλέχθηκαν στις 0, 2, 4, 6 και 8 ημέρες μετά την επικονίαση (DAP) και σταθεροποιήθηκαν σε κενό σε διάλυμα 2% παραφορμαλδεΰδης, 2,5% γλουταραλδεΰδης και 0,001% Tween 20 σε 0,025 M PBS (pH ), στη συνέχεια επωάστηκε όλη τη νύχτα στους 4°C. Ο ιστός πλύθηκε με 0,025 Μ PBS για 20 λεπτά, στη συνέχεια αφυδατώθηκε σε μια σειρά αιθανόλης (25%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90% και 3χ 100%). LR-white (London Resin Company Ltd, Λονδίνο, Η.Β.) ο εμποτισμός πραγματοποιήθηκε με επώαση για 12 ώρες σε αυξανόμενη συγκέντρωση ρητίνης (10%, 25%, 50%, 75%, 90% και 2x 100%). Τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε κάψουλες ζελατίνης και αφέθηκαν να πολυμεριστούν για 48 ώρες σε φούρνο 56°C. Οι τομές των 2 μικρών ελήφθησαν με Ultramicrotome Leica EM UC7, τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες και χρωματίστηκαν με 1% μπλε τολουιδίνης ακολουθούμενο από 1% σαφρανίνη.

Προετοιμασία Βιβλιοθηκών και Αλληλουχία αγγελιαφόρου RNA

Για τους σκοπούς της μεταγραφικής ανάλυσης, το συνολικό RNA εξήχθη από ωάρια και αναπτύχθηκαν υβριδικοί σπόροι από τη διασταύρωση SEC39 x CSS4 (σε όλη αυτή την εργασία, ο μητρικός γονέας αναφέρεται πρώτος σε διασταυρούμενες σημειώσεις). Ετοιμάσαμε μόνο μία κατεύθυνση αυτής της διασταύρωσης για μεταγραφική ανάλυση λόγω ενός σημαντικού επιπέδου προζυγωτικής στειρότητας στην κατεύθυνση διασταύρωσης CSS4 x SEC39, η οποία περιόρισε το RNA που είναι διαθέσιμο για προσδιορισμό αλληλουχίας. Τα ωάρια/σπόροι απελευθερώθηκαν από την ωοθήκη/τον καρπό ανακινώντας απαλά σε σωλήνες μικροφυγοκέντρου που περιείχαν 300 μl παγωμένου ρυθμιστικού απομόνωσης [1X ρυθμιστικό διάλυμα First-Strand Invitrogen, 1 mM διθειοθρεϊτόλη (DTT) και 4% RNaseOUT]. Στη συνέχεια προστέθηκε ΤΡΙζόλη (αναλογία 3:1 ρυθμιστικού διαλύματος ΤΡΙζόλης: απομόνωσης). Χρησιμοποιήσαμε το Pure Link RNA Mini Kit (Invitrogen), τροποποιώντας το ως εξής: Τα συλλεχθέντα ωάρια και οι σπόροι σε διάλυμα αλέστηκαν απαλά με γουδοχέρια σφαιριδίων σε σωλήνες Eppendorf για 2-4 λεπτά και στη συνέχεια αναμίχθηκαν με 240 μl χλωροφορμίου. Το διάλυμα ανακινήθηκε έντονα με το χέρι για 15 δευτερόλεπτα, στη συνέχεια επωάστηκε για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια φυγοκέντρησε στα 12.000 g για 15 λεπτά στους 4°C για να διαχωριστούν οι φάσεις. Το ολικό RNA απομονώθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με κιτ Dnase I χωρίς DNA TURBO (Ambion) για απομάκρυνση μολυσμένου DNA. Το μικτό διάλυμα στη συνέχεια περιστράφηκε στα 10.000 g για 1,5 λεπτό για να συλλεχθεί το ανώτερο στρώμα του RNA. Σημειώνουμε ότι αυτή η μέθοδος διαχωρισμού με το χέρι ωοθυλακίων/σπόρων από τους καρπούς με διαμήκη τομή μπορεί να έχει οδηγήσει κατά λάθος σε μικρή ποσότητα ιστού που συνεισφέρει ο πλακούντας στα δείγματά μας. Το διάλυμα ανακινήθηκε έντονα με το χέρι για 15 δευτερόλεπτα, στη συνέχεια επωάστηκε για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια φυγοκέντρησε στα 12.000 g για 15 λεπτά στους 4°C για να διαχωριστούν οι φάσεις. Το ολικό RNA απομονώθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με κιτ Dnase I χωρίς DNA TURBO (Ambion) για απομάκρυνση μολυσμένου DNA. Το μικτό διάλυμα στη συνέχεια περιστράφηκε στα 10.000 g για 1,5 λεπτό για να συλλεχθεί το ανώτερο στρώμα του RNA. Σημειώνουμε ότι αυτή η μέθοδος διαχωρισμού με το χέρι ωοθυλακίων/σπόρων από τους καρπούς με διαμήκη τομή μπορεί να έχει οδηγήσει κατά λάθος σε μικρή ποσότητα ιστού που συνεισφέρει ο πλακούντας στα δείγματά μας. Το διάλυμα ανακινήθηκε έντονα με το χέρι για 15 δευτερόλεπτα, στη συνέχεια επωάστηκε για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια φυγοκέντρησε στα 12.000 g για 15 λεπτά στους 4°C για να διαχωριστούν οι φάσεις. Το ολικό RNA απομονώθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με κιτ Dnase I χωρίς DNA TURBO (Ambion) για απομάκρυνση μολυσμένου DNA. Το μικτό διάλυμα στη συνέχεια περιστράφηκε στα 10.000 g για 1,5 λεπτό για να συλλεχθεί το ανώτερο στρώμα του RNA. Σημειώνουμε ότι αυτή η μέθοδος διαχωρισμού με το χέρι ωοθυλακίων/σπόρων από τους καρπούς με διαμήκη τομή μπορεί να έχει οδηγήσει κατά λάθος σε μικρή ποσότητα ιστού που συνεισφέρει ο πλακούντας στα δείγματά μας. στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με TURBO Dnase I Kit (Ambion) για την αφαίρεση μολυσμένου DNA. Το μικτό διάλυμα στη συνέχεια περιστράφηκε στα 10.000 g για 1,5 λεπτό για να συλλεχθεί το ανώτερο στρώμα του RNA. Σημειώνουμε ότι αυτή η μέθοδος διαχωρισμού με το χέρι ωοθυλακίων/σπόρων από τους καρπούς με διαμήκη τομή μπορεί να έχει οδηγήσει κατά λάθος σε μικρή ποσότητα ιστού που συνεισφέρει ο πλακούντας στα δείγματά μας. στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με TURBO Dnase I Kit (Ambion) για την αφαίρεση μολυσμένου DNA. Το μικτό διάλυμα στη συνέχεια περιστράφηκε στα 10.000 g για 1,5 λεπτό για να συλλεχθεί το ανώτερο στρώμα του RNA. Σημειώνουμε ότι αυτή η μέθοδος διαχωρισμού με το χέρι ωοθυλακίων/σπόρων από τους καρπούς με διαμήκη τομή μπορεί να έχει οδηγήσει κατά λάθος σε μικρή ποσότητα ιστού που συνεισφέρει ο πλακούντας στα δείγματά μας.

Δημιουργήσαμε και καθορίσαμε την αλληλουχία συνολικά 20 βιβλιοθηκών αλληλουχίας RNA (βλ. Πίνακα 1 για λεπτομέρειες). Χρησιμοποιήσαμε τέσσερα μητρικά φυτά (SEC39) και πέντε δότες γύρης (CSS4) για να δημιουργήσουμε υβριδικούς σπόρους ηλικίας 2, 4, 6 και 8 ημερών μετά την επικονίαση (DAP). Λόγω της δυσκολίας απομόνωσης επαρκούς RNA για προσδιορισμό αλληλουχίας, τα ωάρια προήλθαν από επτά μητρικά φυτά. Οι υβριδικές δεξαμενές σπόρων που δημιουργήθηκαν από ένα μητρικό φυτό αποτελούσαν ένα βιολογικό αντίγραφο. Επειδή τα μητρικά μας φυτά ήταν πολύ συγγενικά, οι αλληλικές διαφορές μεταξύ των αντιγράφων θα πρέπει να είναι ελάχιστες. Αυτή η προσδοκία επιβεβαιώνεται από τα δεδομένα γονιδιωματικής αλληλουχίας (βλ. παρακάτω), τα οποία υποδεικνύουν ότι στο CSS4, το 0,115% των καλυμμένων εξωνικών θέσεων είναι ετερόζυγες, ενώ στο SEC39, το 0,04% των καλυμμένων εξωνικών θέσεων είναι ετερόζυγες. Ο αριθμός ακεραιότητας RNA (RIN) για όλα τα δείγματα gt; 7,8, όπως προσδιορίζεται από έναν Agilent 2100 Bioanalyzer. Είκοσι βιβλιοθήκες συμπληρωματικών DNA (cDNA) ειδικών κλώνων παρασκευάστηκαν από περίπου 100 ng ολικού RNA από το Εργαστήριο Γονιδιωματικής Επιστήμης του Πανεπιστημίου της Βόρειας Καρολίνας χρησιμοποιώντας ένα κιτ προετοιμασίας βιβλιοθήκης NEB Ultra Directional Library για Illumina και στη συνέχεια αναλύθηκε η αλληλουχία σε ένα Illumina NextSeq 500. Μέσο μέγεθος του Τα θραύσματα cDNA ήταν περίπου 380 bp.

Πίνακας 1 Βιολογικά αντίγραφα ωαρίων SEC39 και υβριδικών σπόρων SEC39 x CSS4.

Στρατηγική ευθυγράμμισης αλληλουχιών RNA

Ο γνωστός κατά ζεύγη πολυμορφισμός στο σύμπλεγμα M. guttatus κυμαίνεται από 0,033 έως 0,065 (Brandvain et al., 2014; Gould et al., 2017), αυξάνοντας την προοπτική μεροληψίας από τη χαρτογράφηση αναγνώσεων RNA στο γονιδίωμα αναφοράς M. guttatus, το οποίο είναι πιθανό να είναι διαφορετική από τις γραμμές που χρησιμοποιούνται εδώ. Για να μειώσουμε τον αριθμό των αναγνώσεων που απορρίπτονται κατά τη χαρτογράφηση, χρησιμοποιήσαμε μια προσέγγιση χαρτογράφησης γονιδιώματος ψευδοαναφοράς, χαρτογραφώντας τις αναγνώσεις του RNA μας σε γονιδιώματα γονικής ψευδοαναφοράς που δημιουργήσαμε από δεδομένα αλληλουχίας DNA ολόκληρου του γονιδιώματος από κάθε γονική αμιγή γραμμή. Τα δεδομένα αλληλουχίας ελήφθησαν από DNA που εξήχθη από ιστό οφθαλμών από έναν μητρικό γονέα και έναν δότη γύρης χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού γονιδιώματος DNA του φυτού GeneJET (Thermo Fisher Scientific). Οι βιβλιοθήκες Illumina προετοιμάστηκαν από την Εγκατάσταση Αλληλουχίας Γονιδιώματος του Πανεπιστημίου Duke χρησιμοποιώντας το κιτ προετοιμασίας βιβλιοθήκης Nano DNA Illumina TruSeq, στη συνέχεια έγινε η αλληλουχία σε μια μηχανή Illumina HiSeq 4000, δημιουργώντας αναγνώσεις ζεύξης 150 bp. Καταργήσαμε τους προσαρμογείς και τις αναγνώσεις χαμηλής ποιότητας με το Trimmomatic (Bolger et al., 2014) και αντιστοιχίσαμε τις υπόλοιπες αναγνώσεις χρησιμοποιώντας το bwa mem (http://bio-bwa.sourceforge.net), διατηρώντας μόνο τις σωστά συζευγμένες αναγνώσεις. Η μέση κάλυψη ήταν 38x και 32x για τα CSS4 και SEC39, αντίστοιχα. Οι παραλλαγές κλήθηκαν χρησιμοποιώντας GATK3.7 και φιλτραρίστηκαν σκληρά με βάση την ποιότητα-προς-βάθος (lt; 2,0), την προκατάληψη κλώνου (gt; 60,0), την ποιότητα χαρτογράφησης (lt; 20,0), το άθροισμα κατάταξης ποιότητας χαρτογράφησης (lt; 12,5) και την κατάταξη θέσης ανάγνωσης τεστ αθροίσματος (lt; −8,0). Καταργήσαμε επίσης παραλλαγές με χαμηλή κάλυψη (lt; 4) και υψηλή κάλυψη (gt; 2 SD από τη μέση τιμή). Δημιουργήσαμε γονιδιώματα ψευδοαναφοράς που ενσωμάτωσαν τις φιλτραρισμένες παραλλαγές μας χρησιμοποιώντας το πακέτο ModTools (Huang et al., 2014). Χρησιμοποιήσαμε κρεβάτια (Neph et al.,

Αντιστοιχίσαμε τις αναγνώσεις RNA σε κάθε γονική ψευδοαναφορά χρησιμοποιώντας τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις του ευθυγραμμιστή STAR με επίγνωση ματίσματος, επιτρέποντας μέγιστο αριθμό αναντιστοιχιών σε σχέση με το μήκος ανάγνωσης 0,04 (Dobin et al., 2013). Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε τη σωλήνωση πέτο/ζαρτιέρες (Huang et al., 2014; Crowley et al., 2015) για να φιλτράρουμε τις αναγνώσεις με βάση τη θέση και την ποιότητα χαρτογράφησης. Για κάθε ανάγνωση, το lapels καθορίζει τη θέση αντιστοίχισής του στη μητρική και πατρική ψευδο-αναφορά, συγκρίνει τις ιδιότητες χαρτογράφησης σε καθεμία (όπως καθορίζεται από τον αριθμό των αναντιστοιχιών) και στη συνέχεια επιλέγει τη θέση αντιστοίχισης με την υψηλότερη ποιότητα. Για τη μελέτη μας, διατηρήθηκαν αναγνώσεις που χαρτογραφήθηκαν μοναδικά μόνο σε ένα γονιδίωμα γονιδίου, ενώ σε αναγνώσεις που χαρτογραφήθηκαν και στα δύο γονιδιακά γονιδιώματα εκχωρήθηκαν οι συντεταγμένες με την υψηλότερη ποιότητα χαρτογράφησης. Μόνο σωστά ζευγαρωμένο,

Ανάλυση χρονοσειρών των αλλαγών της γονιδιακής έκφρασης με την ανάπτυξη

Δημιουργήσαμε μετρήσεις γονιδίων στις φιλτραρισμένες ευθυγραμμίσεις με πέτο/ζαρτιέρες χρησιμοποιώντας το featureCounts (Liao et al., 2014). Πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση βασικών συνιστωσών (PCA) εκτιμήσεων κανονικοποιημένης γονιδιακής έκφρασης από τις 20 βιβλιοθήκες RNA χρησιμοποιώντας τη συνάρτηση PlotPCA του DESeq2, χρησιμοποιώντας τα 500 πιο μεταβλητά γονίδια (Love et al., 2014). Πήραμε δύο προσεγγίσεις για την ανακάλυψη γονιδίων που εκφράστηκαν διαφορετικά κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των σπόρων. Αρχικά, συνδυάσαμε πολλαπλές συγκρίσεις ανά ζεύγη (0 έναντι 2 DAP, 2 έναντι 4 DAP, 4 έναντι 6 DAP και 6 έναντι 8 DAP) σε ένα γενικευμένο γραμμικό μοντέλο στο edgeR, εκτελώντας μια δοκιμή αναλογίας πιθανότητας για τον προσδιορισμό της σημασίας με ποσοστό ψευδούς ανακάλυψης (FDR) 0,01. Τα δεδομένα μετρήσεων περικόπηκαν ο μέσος όρος των τιμών Μ (TMM) που κανονικοποιήθηκαν και μόνο γονίδια με μεγαλύτερη από 1 μέτρηση ανά εκατομμύριο σε τουλάχιστον τρία δείγματα διατηρήθηκαν (Chen et al., 2016). Δεύτερον, χρησιμοποιήσαμε το Next maSigPro, ένα πρόγραμμα που χρησιμοποιεί μια δοκιμασία πολυωνυμικής παλινδρόμησης ελαχίστου τετραγώνου και αναλογίας λογαριθμικής πιθανότητας για την ανίχνευση γονιδίων που παρουσιάζουν σημαντικές αλλαγές στην έκφραση με την πάροδο του χρόνου (Conesa et al., 2006; Nueda et al., 2014). Στη συνέχεια, το maSigPro επιλέγει το καλύτερο μοντέλο με βάση την καλή εφαρμογή χρησιμοποιώντας μια συσχετιστική αποκοπή (δηλ. R² τιμή) παρέχεται από τον χρήστη. Τέτοια μοντέλα χρονοσειρών είναι μια βελτίωση σε σχέση με την εκτέλεση πολλαπλών συγκρίσεων κατά ζεύγη (Spies et al., 2019), ειδικά όταν δειγματοληπτούνται πολλά χρονικά σημεία. Το επόμενο maSigPro περιλαμβάνει εφέ παρτίδας στο μοντέλο παλινδρόμησης. Θεωρήσαμε ότι κάθε μητρικός γονέας είναι μια παρτίδα, δίνοντάς μας επτά συνολικά παρτίδες: τέσσερις μητρικοί γονείς κατανεμήθηκαν σε 0-8 DAP και τρεις επιπλέον παρτίδες που αντιστοιχούν στα τρία συγκεντρωμένα δείγματα από το 0 DAP. Πραγματοποιήσαμε πολυωνυμική παλινδρόμηση με R ²0,6 και ο Benjamini-Hochberg διόρθωσε το FDR του 0,01. Θεωρήσαμε την επικάλυψη μεταξύ του edgeR και της ανάλυσης χρονοσειράς Next maSigPro ως το σύνολο των γονιδίων που εκφράστηκαν διαφορικά κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των σπόρων. Όλες οι περαιτέρω κατάντη αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε αυτά τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (DEGs). Επικυρώσαμε την απομόνωση RNA, τη χαρτογράφηση και την κανονικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης πραγματοποιώντας ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο (qRT-PCR) με ανεξάρτητα συλλεγμένα, τριπλούν δείγματα RNA από μη γονιμοποιημένα ωάρια και ολόκληρους υβριδικούς σπόρους από ένα νέο σύνολο τριών μητρικών φυτών και τριών δότες γύρης σε ένα υποσύνολο έξι γονιδίων (βλ. Εικόνα S1 για λεπτομέρειες) και συγκρίνοντας τις τάσεις τους με την μεταγραφική ανάλυση. Τα πρότυπα χρονικής έκφρασης qRT-PCR και των έξι γονιδίων ταίριαζαν στενά με τα πρότυπα έκφρασης που βασίζονται στο RNA-seq.

Για να αποκαλύψουμε τις τάσεις στους όρους γονιδιακής οντολογίας (GO) των DEGs, εκτελέσαμε τον αλγόριθμο ομαδοποίησης Hartigan και Wong K-means (Hartigan and Wong, 1979) στα θραύσματα ανά κιλοβάση μεταγραφής ανά εκατομμύριο (FPKM) τιμών όλων των DEG. Χρησιμοποιήσαμε 20 συστάδες (όπως καθορίζεται από τη στατιστική του χάσματος), με 100 τυχαίες εκκινήσεις και 25 επαναλήψεις. Πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση εμπλουτισμού με όρο GO των προκύπτων συμπλεγμάτων στο ThaleMine (https://apps.araport.org/thalemine/begin.do) χρησιμοποιώντας τα πιο παρόμοια ομόλογα Arabidopsis thaliana και στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε το REVIGO (http://revigo.irb. hr/) για φιλτράρισμα περιττών όρων GO, χρησιμοποιώντας δείκτη αποκοπής ομοιότητας 0,7. Ενώ χρησιμοποιήσαμε τον σχολιασμό αναφοράς (Phytozome v2.0) για να υπολογίσουμε την αφθονία των γονιδίων Mimulus, δημιουργήσαμε ομολογία γονιδίων σε σχέση με το Arabidopsis χρησιμοποιώντας BLASTx (Camacho et al., 2009) με αποκοπή E ≤ 0,001, ορίζοντας το χτύπημα με το υψηλότερο bitscore ως το πιο παρόμοιο ομόλογο A. thaliana. Υπήρχαν λίγες διαφορές μεταξύ των αποτελεσμάτων BLASTx και του σχολιασμού φυτοζώματος (Goodstein et al., 2012). Εδώ και αλλού σε αυτό το άρθρο, παρουσιάζουμε το όνομα γονιδίου και την ονομασία γονιδίου για το πιο παρόμοιο ομόλογο από το Arabidopsis thaliana για τον αριθμό γονιδίου M. guttatus. Χρησιμοποιήσαμε το plantTFDB 4.0 (http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/) για να σχολιάσουμε τους παράγοντες μεταγραφής σε M. guttatus, ντομάτα (Solanum lycopersicum), A. thaliana και ρύζι (Oryza sativa) (Jin et al. , 2015· Jin et al., 2017). Ευθυγραμμίσαμε τις πρωτεϊνικές αλληλουχίες γονιδίων MADS-box τύπου Ι από αυτά τα είδη και υπολογίσαμε και βάλαμε ένα δέντρο γειτονικού που ενώνει (NJ) (1000 επαναλήψεις) χρησιμοποιώντας το clustalW2.1 (Larkin et al., 2007). Υπήρχαν λίγες διαφορές μεταξύ των αποτελεσμάτων BLASTx και του σχολιασμού φυτοζώματος (Goodstein et al., 2012). Εδώ και αλλού σε αυτό το άρθρο, παρουσιάζουμε το όνομα γονιδίου και την ονομασία γονιδίου για το πιο παρόμοιο ομόλογο από το Arabidopsis thaliana για τον αριθμό γονιδίου M. guttatus. Χρησιμοποιήσαμε το plantTFDB 4.0 (http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/) για να σχολιάσουμε τους παράγοντες μεταγραφής σε M. guttatus, ντομάτα (Solanum lycopersicum), A. thaliana και ρύζι (Oryza sativa) (Jin et al. , 2015· Jin et al., 2017). Ευθυγραμμίσαμε τις πρωτεϊνικές αλληλουχίες γονιδίων MADS-box τύπου Ι από αυτά τα είδη και υπολογίσαμε και βάλαμε ένα δέντρο γειτονικού που ενώνει (NJ) (1000 επαναλήψεις) χρησιμοποιώντας το clustalW2.1 (Larkin et al., 2007). Υπήρχαν λίγες διαφορές μεταξύ των αποτελεσμάτων BLASTx και του σχολιασμού φυτοζώματος (Goodstein et al., 2012). Εδώ και αλλού σε αυτό το άρθρο, παρουσιάζουμε το όνομα γονιδίου και την ονομασία γονιδίου για το πιο παρόμοιο ομόλογο από το Arabidopsis thaliana για τον αριθμό γονιδίου M. guttatus. Χρησιμοποιήσαμε το plantTFDB 4.0 (http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/) για να σχολιάσουμε τους παράγοντες μεταγραφής σε M. guttatus, ντομάτα (Solanum lycopersicum), A. thaliana και ρύζι (Oryza sativa) (Jin et al. , 2015· Jin et al., 2017). Ευθυγραμμίσαμε τις πρωτεϊνικές αλληλουχίες γονιδίων MADS-box τύπου Ι από αυτά τα είδη και υπολογίσαμε και βάλαμε ένα δέντρο γειτονικού που ενώνει (NJ) (1000 επαναλήψεις) χρησιμοποιώντας το clustalW2.1 (Larkin et al., 2007). παρουσιάζουμε το όνομα γονιδίου και την ονομασία γονιδίου για το πιο παρόμοιο ομόλογο από το Arabidopsis thaliana για τον αριθμό γονιδίου M. guttatus. Χρησιμοποιήσαμε το plantTFDB 4.0 (http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/) για να σχολιάσουμε τους παράγοντες μεταγραφής σε M. guttatus, ντομάτα (Solanum lycopersicum), A. thaliana και ρύζι (Oryza sativa) (Jin et al. , 2015· Jin et al., 2017). Ευθυγραμμίσαμε τις πρωτεϊνικές αλληλουχίες γονιδίων MADS-box τύπου Ι από αυτά τα είδη και υπολογίσαμε και βάλαμε ένα δέντρο γειτονικού που ενώνει (NJ) (1000 επαναλήψεις) χρησιμοποιώντας το clustalW2.1 (Larkin et al., 2007). παρουσιάζουμε το όνομα γονιδίου και την ονομασία γονιδίου για το πιο παρόμοιο ομόλογο από το Arabidopsis thaliana για τον αριθμό γονιδίου M. guttatus. Χρησιμοποιήσαμε το plantTFDB 4.0 (http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/) για να σχολιάσουμε τους παράγοντες μεταγραφής σε M. guttatus, ντομάτα (Solanum lycopersicum), A. thaliana και ρύζι (Oryza sativa) (Jin et al. , 2015· Jin et al., 2017). Ευθυγραμμίσαμε τις πρωτεϊνικές αλληλουχίες γονιδίων MADS-box τύπου Ι από αυτά τα είδη και υπολογίσαμε και βάλαμε ένα δέντρο γειτονικού που ενώνει (NJ) (1000 επαναλήψεις) χρησιμοποιώντας το clustalW2.1 (Larkin et al., 2007).

Συγκρίναμε τα δεδομένα έκφρασής μας με προηγουμένως δημοσιευμένα δεδομένα μεταγραφής του M. guttatus που συλλέχθηκαν από κάλυκα, φύλλα, πέταλα και ιστό στελέχους (Edger et al., 2017) για να προσδιορίσουμε ποια γονίδια και παράγοντες μεταγραφής εκφράζονται αποκλειστικά σε ωάρια ή σπόρους. Ανατινάξαμε τις μεταγραφές στο Edger et al. (2017) στο γονιδίωμα αναφοράς του M. guttatus για να ληφθεί η γονιδιακή τους ταυτότητα, επιλέγοντας το χτύπημα με το υψηλότερο bitscore και χρησιμοποιώντας αποκοπή E ≤ 0,001. Σημειώνουμε ότι τόσο τα δεδομένα μας όσο και των Edger et al. (2017) περιλαμβάνουν μεταγραφές που δεν αντιστοιχούν στον τρέχοντα σχολιασμό του γονιδιώματος του M. guttatus. επιλέξαμε να μην συνεχίσουμε περαιτέρω αυτές τις μη σχολιασμένες μεταγραφές. Θεωρήσαμε ότι ένα γονίδιο εκφράζεται στα δεδομένα μας εάν είχε μέση τιμή FPKM ≥ 1,0 σε τουλάχιστον ένα χρονικό σημείο. Κατηγοριοποιήσαμε ως ειδικά για το στάδιο εκείνα τα γονίδια των οποίων η έκφραση στα δείγματά μας είχε μέση τιμή FPKM ≥ 5,0 σε αυτό το στάδιο αλλά ≤ 1,0 σε όλα τα άλλα στάδια. Τέλος, κατηγοριοποιούμε τα γονίδια ως αποκλειστικά για ωάρια ή σπόρους εάν τα επίπεδα έκφρασής τους όπως αναφέρονται στους Edger et al. (2017) ήταν FPKM lt; 1,0 και είχαν ελάχιστη μέση έκφραση FPKM ≥ 5 σε ωάρια ή 2–8 σπόρους DAP. Συγκρίνουμε τα δεδομένα μας με μεταγραφικά μεταγραφικά σπόρων του A. thaliana (Belmonte et al., 2013), του καλαμποκιού (Chen et al., 2014; Yi et al., 2019) και της εξημερωμένης ντομάτας και ενός σχεδόν άγριου συγγενή (Solanum pimpinellifolium) ( Pattison et al., 2015· Shinozaki et al., 2018) για να αναζητήσουν επικαλυπτόμενα σύνολα γονιδίων που αποκλείουν τους σπόρους σε αυτά τα taxa. (2017) ήταν FPKM lt; 1,0 και είχαν ελάχιστη μέση έκφραση FPKM ≥ 5 σε ωάρια ή 2–8 σπόρους DAP. Συγκρίνουμε τα δεδομένα μας με μεταγραφικά μεταγραφικά σπόρων του A. thaliana (Belmonte et al., 2013), του καλαμποκιού (Chen et al., 2014; Yi et al., 2019) και της εξημερωμένης ντομάτας και ενός σχεδόν άγριου συγγενή (Solanum pimpinellifolium) ( Pattison et al., 2015· Shinozaki et al., 2018) για να αναζητήσουν επικαλυπτόμενα σύνολα γονιδίων που αποκλείουν τους σπόρους σε αυτά τα taxa. (2017) ήταν FPKM lt; 1,0 και είχαν ελάχιστη μέση έκφραση FPKM ≥ 5 σε ωάρια ή 2–8 σπόρους DAP. Συγκρίνουμε τα δεδομένα μας με μεταγραφικά μεταγραφικά σπόρων του A. thaliana (Belmonte et al., 2013), του καλαμποκιού (Chen et al., 2014; Yi et al., 2019) και της εξημερωμένης ντομάτας και ενός σχεδόν άγριου συγγενή (Solanum pimpinellifolium) ( Pattison et al., 2015· Shinozaki et al., 2018) για να αναζητήσουν επικαλυπτόμενα σύνολα γονιδίων που αποκλείουν τους σπόρους σε αυτά τα taxa.

Ανίχνευση και επικύρωση γονιδίων με προκατειλημμένη έκφραση Mimulus guttatus

Χρησιμοποιήσαμε το ASEReadCounter της GATK για να συγκεντρώσουμε μετρήσεις αλληλόμορφων M. guttatus και M. pardalis σε θέσεις SNP, διακρίνοντας τις ενδογαμικές μας γραμμές, CSS4 και SEC39, για κάθε βιβλιοθήκη 2–8 σπόρων DAP. Περιορίσαμε τον αριθμό των αλληλόμορφων σε τοποθεσίες που ήταν ομόζυγες στις ενδογαμικές γραμμές 5G που χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία των γονικών ψευδοαναφορών. Σε κάθε χρονικό σημείο, συγκεντρώναμε λίστες γονιδίων που είτε 1) δεν εμφάνιζαν μητρική έκφραση σε κανένα SNP σε κανένα βιολογικό αντίγραφο, είτε 2) παρουσίαζαν σημαντική πατρική προκατάληψη για ένα ή περισσότερα SNP μέσα σε ένα γονίδιο για δύο ή περισσότερα αντίγραφα. Για το πρώτο εξαλείψαμε γονίδια που παρουσίαζαν είτε μικρή συνολική έκφραση (lt; 2 μετρήσεις κατά μέσο όρο στα αντίγραφα) είτε των οποίων η έκφραση μεταξύ των αντιγράφων μέσα σε ένα χρονικό σημείο ήταν εξαιρετικά μεταβλητή (δηλ. τυπική απόκλιση στην έκφραση gt; μέση έκφραση). Για τη δεύτερη ομάδα, σε κάθε SNP υπολογίσαμε την αναλογία των μετρήσεων αλληλόμορφων M. guttatus προς τις μετρήσεις αλληλόμορφων M. pardalis (Mg/Mp) για κάθε αντίγραφο και, στη συνέχεια, υπολογίσαμε τη μέση αναλογία Mg/Mp μεταξύ των αντιγράφων. Διατηρήσαμε μόνο εκείνα τα γονίδια όπου η πλειονότητα των SNP εντός του γονιδίου εμφάνιζε Mg/Mp gt; 2 και όπου η διακύμανση σε Mg/Mp ήταν χαμηλή (δηλαδή, όπου η τυπική απόκλιση του Mg/Mp μεταξύ των SNP ήταν μικρότερη από τη μέση τιμή σε όλα τα SNP εντός ένα γονίδιο). Μόνο γονίδια που εκφράζονται σε δύο ή περισσότερα αντίγραφα ελήφθησαν υπόψη για μελλοντική επικύρωση. Επειδή η αναζήτησή μας για έκφραση μεροληπτόμενη από το M. guttatus πραγματοποιήθηκε σε μεταγραφώματα πλήρους σπόρου, δεν μπορούμε να εφαρμόσουμε καμία a priori υπόθεση για την αναλογία έκφρασης Mg/Mp σε οποιοδήποτε δεδομένο γονίδιο, καθώς αυτό το γονίδιο μπορεί να εκφράζεται σε έναν ή περισσότερους τύπους ιστών (δηλαδή, κάλυμμα σπόρων, έμβρυο και/ή ενδοσπέρμιο). Ετσι,

Οι μεταγραφές που εμφανίζουν προκατάληψη έκφρασης προς το αλληλόμορφο M. guttatus θα μπορούσαν να προέρχονται από μια μεροληψία γονέα προέλευσης, μια μεροληψία αλληλόμορφου προέλευσης ή να είναι ψευδώς θετικά. Για να επικυρώσουμε τη μεροληψία έκφρασης και να κάνουμε διάκριση μεταξύ αυτών των πιθανοτήτων, απομονώσαμε με το χέρι το ενδοσπέρμιο από τους σπόρους SEC39 x CSS4 και CSS4 x SEC39 F1 σε 8 DAP. Το RNA μετατράπηκε σε cDNA και χρησιμοποιήθηκε σε ημι-ποσοτικές αναλύσεις PCR. Εντοπίσαμε επτά υποψήφια γονίδια που περιέχουν γνωστά SNP που διακρίνουν αλληλόμορφα λόγω της δημιουργίας ή της εξάλειψης μιας θέσης κοπής περιοριστικού ενζύμου. Δημιουργήσαμε ζεύγη ολίγο (Πίνακας S1) για να ενισχύσουμε τα θραύσματα που περιέχουν SNP. Η σχετική έκφραση των μητρικών και των πατρικών αλληλόμορφων προσδιορίστηκε με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης και με προσδιορισμό αλληλουχίας Sanger.

Αποτελέσματα

Δημιουργήσαμε 20 βιβλιοθήκες RNAseq με συνολικά 3,85 x 10 ⁸ ακατέργαστες αναγνώσεις, κατά μέσο όρο 1,93 x 10 ⁷αναγνώσεις ανά βιβλιοθήκη (βλ. Πίνακα S2 για στατιστικά στοιχεία στοίχισης). Η απόκλιση αλληλουχίας κατά ζεύγη (π) μεταξύ SEC39 και CSS4 στις κωδικοποιητικές περιοχές είναι 0,028 ± 0,022 SD Η αντιστοίχιση στην ψευδοαναφορά SEC39 παρήγαγε μέσο όρο 75,3% ± 4,25 SD σωστά ζευγαρωμένες, μοναδικά αντιστοιχισμένες αναγνώσεις, ενώ η αντιστοίχιση ψευδοαναφοράς CSS4 με την. % ± 2,34 SD σωστά ζευγαρωμένες, μοναδικά αντιστοιχισμένες αναγνώσεις. Η χαρτογράφηση στο γονιδίωμα ψευδοαναφοράς SEC39 (δηλαδή μητρικό) ήταν πιο αποτελεσματική, καθώς τα δείγματά μας περιέχουν αναγνώσεις από το περίβλημα του σπόρου (όλα μητρικό), το έμβρυο (1:1 μητρικό:πατρικό) και το ενδοσπέρμιο (2:1 μητρικό:πατρικό). Συνολικά, οι συγχωνευμένες ευθυγραμμίσεις μας έχουν κατά μέσο όρο 75,5% ± 3,98 SD σε ζεύγη, μοναδικά χαρτογραφημένες αναγνώσεις. Αυτό αντιπροσωπεύει μια σημαντική βελτίωση σε σχέση με τη χαρτογράφηση στο γονιδίωμα αναφοράς IM62, το οποίο παρήγαγε 67,7% ± 4,0 SD μοναδικά χαρτογραφημένες αναγνώσεις (t19 = 68,97,

Αναπτυξιακή πρόοδος των σπόρων Mimulus pardalis x Mimulus guttatus

Όπως ήταν αναμενόμενο, το σύνολο των σπόρων, η εξωτερική μορφολογία και οι ρυθμοί βλάστησης μεταξύ των ώριμων σπόρων από M. pardalis x M. guttatus (SEC39 x CSS4) επιβεβαιώνουν την έλλειψη μεταζυγωτικής απομόνωσης μεταξύ αυτών των αμιγών γραμμών (Oneal, Munger και Willis, αδημοσίευτα, Macnair και Cumbes (1989)) (βλέπε Εικόνα 1, Εικόνα S2). Οι καρποί Selfed M. pardalis, selfed M. guttatus και αμφίδρομοι M. pardalis x M. guttatus περιείχαν κυρίως στρογγυλούς, βιώσιμους σπόρους με μια μικρή μειοψηφία συρρικνωμένων ή επίπεδων σπόρων (Εικόνα 1Α, Εικόνα S2), χωρίς σημαντική διαφορά στην κατανομή των τύπων σπόρων μεταξύ των αυτοφυών καρπών και των υβριδικών καρπών (MANOVA F9,45 = 1,09, p gt; 0,1). Τα ποσοστά βλάστησης ήταν γενικά υψηλά (57,9–89,74%) (Εικόνα 1Β).

Σχήμα 1 (Α) Ποσοστό ώριμων φαινοτύπων σπόρων (στρογγυλών, συρρικνωμένων και επίπεδων) που ανακτήθηκαν από πλήρως ανεπτυγμένους καρπούς από αυτοφυή Mimulus pardalis και Mimulus guttatus και αμοιβαίες διασταυρώσεις M. pardalis x M. guttatus. Δεν υπήρξε σημαντική διαφορά στην κατανομή των τύπων σπόρων μεταξύ των αυτοφυών και των υβριδικών καρπών (MANOVA F9,45 = 1,09, p gt; 0,1). (Β) Ρυθμοί βλάστησης αυτοφυών σπόρων M. pardalis και M. guttatus, καθώς και υβριδικών σπόρων M. pardalis x M. guttatus και M. guttatus x M. pardalis. Mp, Μ. pardalis; Mg, Μ. guttatus. Οι ράβδοι υποδεικνύουν τυπικό σφάλμα. Τα ποσοστά βλάστησης ήταν γενικά υψηλά (57,9–89,74%) (Ν=4 για κάθε αυτοφύτευση και διασταύρωση).

Στο 2 DAP, οι περισσότεροι σπόροι περιέχουν έμβρυα τεσσάρων κυττάρων, προχωρώντας σε έμβρυα οκτώ κυττάρων και δερματογόνα κατά 4 DAP (Εικόνα 2Α). Στις 6 και 8 DAP, οι σπόροι περιέχουν έμβρυα όψιμου σφαιρικού και καρδιακού σταδίου, αντίστοιχα. Η ανάπτυξη του ενδοσπερμίου είναι από την αρχή κυτταρική (Arekal, 1965; Oneal et al., 2016). Υπάρχει τακτικός πολλαπλασιασμός του ενδοσπερμίου μεταξύ 4 και 8 DAP και περιορισμένη διαφοροποίηση στην κατανομή των εμβρυϊκών σταδίων σε κάθε χρονικό σημείο (Εικόνα 2Β), που μπορεί να προκύψει από διαφορές στον ρυθμό ανάπτυξης του γυρεόσωληνα και στο χρόνο γονιμοποίησης. Μια PCA κανονικοποιημένων τιμών γονιδιακής έκφρασης από τις 20 βιβλιοθήκες παρήγαγε καλά καθορισμένες συστάδες που αντιστοιχούν στα πέντε διαφορετικά αναπτυξιακά χρονικά σημεία που αναλύθηκαν (Εικόνα 2C), με εξαίρεση κάποιας επικάλυψης μεταξύ 2 και 4 DAP, που υποδηλώνει ότι αυτά τα στάδια εμφανίζουν παρόμοιες μεταγραφικές καταστάσεις .

Σχήμα 2 (Α) Μορφολογία των αναπτυσσόμενων σπόρων Mimulus pardalis x Mimulus guttatus που συλλέχθηκαν 2, 4, 6 και 8 ημέρες μετά την επικονίαση (DAP). Οι τομές ελήφθησαν από ενσωματωμένους σπόρους LR-λευκού (βλέπε Μέθοδοι). (Β) Κατανομή συχνότητας των εμβρυϊκών σταδίων των σπόρων που συλλέχθηκαν σε 2, 4, 6 και 8 DAP. (Γ) Διάγραμμα ανάλυσης βασικών συστατικών (PCA) βιβλιοθηκών RNA.

Συσχετίσεις μεταξύ της γονιδιακής έκφρασης και της προόδου της ανάπτυξης σπόρων Mimulus guttatus

Ανιχνεύσαμε την έκφραση 18.836 σχολιασμένων γονιδίων σε ωάρια και σπόρους, που αντιπροσωπεύουν το 67% όλων των επί του παρόντος σχολιασμένων γονιδίων M. guttatus, συμπεριλαμβανομένων 1.011 μεταγραφικών παραγόντων (TFs), εκ των οποίων 40 είναι γονίδια MADS-box. Ο αριθμός των γονιδίων που εκφράστηκαν σε οποιοδήποτε στάδιο ήταν ο υψηλότερος στα ωάρια (16.681) και ο χαμηλότερος στους σπόρους του καρδιακού σταδίου (8 DAP: 14.784), αλλά δεν βρήκαμε καμία σχέση μεταξύ της ποικιλομορφίας της γονιδιακής έκφρασης και του χρόνου συλλογής (ANOVA F4,15 = 2.522, p = 0,085) (Εικόνα S3). Ένα γενικευμένο γραμμικό μοντέλο που ενσωματώνει πολλαπλές, προοδευτικές συγκρίσεις ανά ζεύγη στο edgeR εντόπισε 12.384 DEG (FDR ≤ 0,01), ενώ μια ανάλυση χρονοσειρών στο Next maSigPro εντόπισε 6.613 DEG (R ²= 0,6, FDR ≤ 0,01) (Πίνακες S3 και S4). Εστιάζουμε στα επικαλυπτόμενα σύνολα DEG μεταξύ του edgeR και του Next maSigPro. Αυτά αποτελούνταν από 6.233 DEG (Εικόνα S4), συμπεριλαμβανομένων 388 μεταγραφικών παραγόντων (TF) από 49 οικογένειες, εκ των οποίων οι 16 είναι MADS τύπου Ι και οι 4 είναι γονίδια κουτιού MADS τύπου MIKC.

Η ομαδοποίηση αποκαλύπτει μοτίβα συνέκφρασης εμπλουτισμένα για λειτουργικές διαδρομές

Για να συσχετίσουμε περαιτέρω τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης με τις αναπτυξιακές αλλαγές στους σπόρους, χρησιμοποιήσαμε έναν αλγόριθμο ομαδοποίησης Hartigan και Wong K-means (Hartigan and Wong, 1979) στους 6.233 DEG που προσδιορίστηκαν από το edgeR και το Next maSigPro. Από 20 ομάδες K, 13 εμπλουτίστηκαν σημαντικά για όρους GO, συμπεριλαμβανομένων αρκετών εμπλουτισμένων με όρους GO που είναι γνωστό ότι παίζουν ρόλο στην ανάπτυξη σπόρων στο Arabidopsis (βλ. Εικόνα 3, Εικόνα S5, Πίνακες S5 και S6). Αρκετές από αυτές τις ομάδες είναι αξιοσημείωτες και αντικατοπτρίζουν ό,τι είναι γνωστό για τα μοτίβα γονιδιακής έκφρασης σε αναπτυσσόμενους σπόρους σε άλλα taxa. Για παράδειγμα, τα γονίδια που εμφανίζουν μέγιστη έκφραση στα ωάρια εμπλουτίζονται για τη ρύθμιση της μεταβολικής διαδικασίας RNA, τη ρύθμιση της έκφρασης και της μεταγραφής των γονιδίων και τη ρύθμιση της ανάπτυξης πολυκύτταρων οργανισμών (ομάδα 5). Στον αραβόσιτο, γονίδια που εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό στο θηλυκό γαμετόφυτο περιλαμβάνουν μεταγραφικούς παράγοντες που εμπλέκονται στη ρύθμιση του RNA (Chen et al., 2014). Στο Arabidopsis, οι επιγενετικές ρυθμιστικές οδοί που καθιερώθηκαν στο ωάριο και στο κεντρικό κύτταρο του θηλυκού γαμετόφυτου θέτουν το στάδιο για την παραγωγή μικρών παρεμβαλλόμενων RNAs (siRNA) που στοχεύουν το έμβρυο στο ενδοσπέρμιο (Wuest et al., 2010). Η ανάπτυξη στο 6 DAP χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση του εμβρύου όψιμου σφαιρικού σταδίου (Εικόνα 2Α) και την επιτάχυνση του πολλαπλασιασμού του ενδοσπέρματος (Oneal et al., 2016). Μια ομάδα συνεκφραζόμενων γονιδίων που κορυφώνεται τόσο στα ωάρια όσο και στους σφαιρικούς (6 DAP) σπόρους είναι εμπλουτισμένη με όρους GO που σχετίζονται με διαδικασίες κυτταρικού κύκλου, αντιγραφή DNA και οργάνωση χρωματίνης (ομάδα 17) όπως συμβαίνει στο Arabidopsis (Le et al., 2010· Belmonte et al., 2013). Ένα άλλο σύμπλεγμα που κορυφώνεται στο 6 DAP (ομάδα 2) περιέχει γονίδια που εμπλέκονται στη βιογένεση και οργάνωση του κυτταρικού τοιχώματος. Τέλος, τα γονίδια που παραμένουν μη εκφρασμένα μέχρι το 8 DAP εμπλουτίζονται για μεταβολικές διεργασίες υδατανθράκων και λιπιδίων, βιογένεση σώματος σπορέλαιου και εντοπισμό λιπιδίων (ομάδα 18). Στο Arabidopsis και στον αραβόσιτο αυτές οι βιολογικές διεργασίες εμπλουτίζονται σε ενδοσπέρμιο (Belmonte et al., 2013; Li et al., 2014), υποδηλώνοντας ότι μπορεί να έχουν παρόμοιους ρόλους σε είδη με εξαρχής κυτταρική ανάπτυξη ενδοσπερμίου.

Εικόνα 3 Παραδείγματα μη επικαλυπτόμενων συστάδων k-means συνεκφραζόμενων γονιδίων και σημαντικών όρων εμπλουτισμού γονιδιακής οντολογίας (GO).

Προσδιορίσαμε ένα υποσύνολο γονιδίων των οποίων η έκφραση ήταν ειδική για το στάδιο στα δεδομένα μας (βλ. Μέθοδοι), με 72 γονίδια ειδικά για τα ωάρια και 3, 29 και 77 γονίδια ειδικά για 2, 6 και 8 σπόρους DAP, αντίστοιχα (Πίνακας S7 ). Δεν υπήρχαν γονίδια ειδικά για 4 σπόρους DAP από. Μια σύγκριση των δεδομένων μας με δεδομένα έκφρασης από M. guttatus calyx, πέταλο, φύλλο και ιστό στελέχους (Edger et al., 2017) αποκάλυψε 30 γονίδια των οποίων η έκφραση ήταν αποκλειστικά στα ωάρια (δηλ. FPKM ≥ 5 στα ωάρια και ≤ 1 in οποιοδήποτε άλλο ιστό), συμπεριλαμβανομένων 4 μεταγραφικών παραγόντων (TFs) (Πίνακας S7). Υπήρχαν 478 γονίδια που εκφράζονται αποκλειστικά σε σπόρους, συμπεριλαμβανομένων 35 TFs από πολλαπλές οικογένειες και 6 γονιδίων MADS-box τύπου I που κωδικοποιούν παράγοντες μεταγραφής, με 2, 20 και 48 γονίδια αποκλειστικά στα 2, 6 και 8 στάδια DAP της ανάπτυξης των σπόρων, αντίστοιχα (Πίνακες S8 και S9).

Επικάλυψη μεταξύ γονιδίων Mimulus guttatus αποκλειστικά για σπόρους και γονιδίων αποκλειστικών σπόρων σε άλλα είδη

Η ομαδοποίηση των γονιδίων K-means που εκφράζονται στους σπόρους αποκαλύπτει ότι ένα μεγάλο κλάσμα (N=120, ή 25%) των γονιδίων που αποκλείουν τους σπόρους διαχωρίζονται στο σύμπλεγμα 18. Άλλα 101 (21,1%) γονιδίων που αποκλείουν τους σπόρους συνδιαχωρίζονται στο σύμπλεγμα 2 Η σύγκριση γονιδίων αποκλειστικών σπόρων στο M. guttatus με άλλα είδη, συμπεριλαμβανομένου του A. thaliana, του καλαμποκιού και της ντομάτας αποκαλύπτει κάποια επικάλυψη. Στο A. thaliana, υπάρχουν 43 γονίδια αποκλειστικά για τους σπόρους των οποίων τα πλησιέστερα ομόλογα είναι επίσης αποκλειστικά σπόροι στο M. guttatus (Πίνακας S7). ένα από αυτά τα γονίδια είναι εμπλουτισμένο στο περίβλημα του σπόρου A. thaliana (At5g39130) (Belmonte et al., 2013). Επίσης, μεταξύ των αποκλειστικών γονιδίων του M. guttatus είναι δύο που δεν είναι αποκλειστικά στους σπόρους A. thaliana, αλλά παρουσιάζουν εμπλουτισμένη έκφραση στο ενδοσπέρμιο A. thaliana: AtAGL62 (At5G60440) και AtCYS5 (At5g47550), μια πιθανή φυτοκυστατίνη που εκφράζεται et al., 2017). Το AtAGL62 καταστέλλει την κυτταροποίηση του ενδοσπερμίου στο A. thaliana και είναι ένας βασικός ρυθμιστής της ανάπτυξης του ενδοσπερμίου. Το μοτίβο έκφρασης αποκλειστικά για σπόρους 2 ομολόγων του AGL62 M. guttatus (Migut.B00708 και Migut.D01476) υποδηλώνει ότι παίζουν σημαντικό ρόλο κατά την ανάπτυξη του σπόρου Mimulus. Ωστόσο, χωρίς αλληλουχία RNA απομονωμένων ιστών σπόρων και πρόσθετες λειτουργικές αναλύσεις, δεν μπορούμε ακόμη να προσδιορίσουμε τον ρόλο των ομολόγων AGL62 του M. guttatus. Τέλος, υπάρχουν 25 γονίδια εμπλουτισμένα σε ενδοσπέρμιο A. thaliana που δεν εκφράζονται στους σπόρους του M. guttatus, συμπεριλαμβανομένων τριών μεταγραφικών παραγόντων (AtAGL87, AtFIS2 και AtFWA). D01476) υποδηλώνει ότι παίζουν σημαντικό ρόλο κατά την ανάπτυξη των σπόρων Mimulus. Ωστόσο, χωρίς αλληλουχία RNA απομονωμένων ιστών σπόρων και πρόσθετες λειτουργικές αναλύσεις, δεν μπορούμε ακόμη να προσδιορίσουμε τον ρόλο των ομολόγων AGL62 του M. guttatus. Τέλος, υπάρχουν 25 γονίδια εμπλουτισμένα σε ενδοσπέρμιο A. thaliana που δεν εκφράζονται στους σπόρους του M. guttatus, συμπεριλαμβανομένων τριών μεταγραφικών παραγόντων (AtAGL87, AtFIS2 και AtFWA). D01476) υποδηλώνει ότι παίζουν σημαντικό ρόλο κατά την ανάπτυξη των σπόρων Mimulus. Ωστόσο, χωρίς αλληλουχία RNA απομονωμένων ιστών σπόρων και πρόσθετες λειτουργικές αναλύσεις, δεν μπορούμε ακόμη να προσδιορίσουμε τον ρόλο των ομολόγων AGL62 του M. guttatus. Τέλος, υπάρχουν 25 γονίδια εμπλουτισμένα σε ενδοσπέρμιο A. thaliana που δεν εκφράζονται στους σπόρους του M. guttatus, συμπεριλαμβανομένων τριών μεταγραφικών παραγόντων (AtAGL87, AtFIS2 και AtFWA).

Στον αραβόσιτο, υπάρχουν 23 γονίδια αποκλειστικά για σπόρους των οποίων τα πλησιέστερα ομόλογα είναι επίσης αποκλειστικά για σπόρους στο M. guttatus (Πίνακας S7), 11 εμπλουτισμένα σε ενδοσπέρμιο και 2 εμπλουτισμένα στο έμβρυο (Chen et al., 2014; Yi et al., 2019 ). Από τα αποκλειστικά γονίδια στο M. guttatus, 54 γονίδια έχουν ομόλογα που δεν είναι αποκλειστικά για σπόρους, αλλά βρέθηκε ότι παρουσιάζουν εμπλουτισμένη έκφραση στο έμβρυο αραβοσίτου, στο ενδοσπέρμιο ή και στα δύο, σε σχέση με άλλους ιστούς σπόρων (Chen et al., 2014 ). Υπάρχουν 250 γονίδια εμπλουτισμένα σε ενδοσπέρμιο αραβοσίτου των οποίων τα ομόλογα δεν εκφράζονται καθόλου στους σπόρους του M. guttatus, συμπεριλαμβανομένων 39 μεταγραφικών παραγόντων όπως οι μεταγραφικοί παράγοντες που ενεργοποιούν το αραβόσιτο ABI3 (VP1), AUX/IAA και δύο γονίδια MADS τύπου I αραβοσίτου (MADS25 και MADS27). Ένα άλλο γονίδιο εμπλουτισμένο σε ενδοσπέρμιο αραβοσίτου αλλά που δεν εκφράζεται στους σπόρους του M. guttatus είναι το αραβόσιτο FIE1, το οποίο είναι μητρικά αποτυπωμένο και κορυφώνεται στην έκφραση κατά τη μετάβαση από τη μιτωτική κυτταρική διαίρεση στον ενδοδιπλασιασμό στο ενδοσπέρμιο (Hermon et al., 2007). Είκοσι γονίδια M. guttatus έχουν πλησιέστερα ομόλογα που εκφράζονται αποκλειστικά και στους σπόρους του A. thaliana και του αραβοσίτου (Πίνακας S7). Ωστόσο, δεν υπάρχει αλληλεπικάλυψη μεταξύ γονιδίων που δεν εκφράζονται στους σπόρους του M. guttatus αλλά είναι εμπλουτισμένα σε A. thaliana ή ενδοσπέρμιο αραβοσίτου.

Τέλος, στην εξημερωμένη ντομάτα υπάρχουν 8 γονίδια αποκλειστικά για σπόρους των οποίων τα πλησιέστερα ομόλογα (25 γονίδια) είναι αποκλειστικά σπόροι στο M. guttatus (Zuluaga et al., 2016· Shinozaki et al., 2018), ένα από τα οποία (CYS5) είναι εμπλουτισμένο στο έμβρυο ενός άγριου συγγενή εξημερωμένης ντομάτας (Pattison et al., 2015) (Solyc04g014780). Από τα 25 αποκλειστικά γονίδια για σπόρους M. guttatus με ομόλογα στην ντομάτα, τα 22 δεν έχουν ομόλογα αποκλειστικά για σπόρους στο A. thaliana ή στον αραβόσιτο. Αυτά περιλαμβάνουν ομόλογα M. guttatus και τομάτας των LIPID TRANSFER PROTEINS 4 και 12 (LPT4 και LPT12: Migut.M01356/Migut.M01355/Migut.M01350/Solyc05g053530), PECTIN METHY. Solyc09g072950), και VACUOLAR INHIBITOR OF FRUCTOSIDASE 1 (VIF1: Migut.M00087/Solyc09g072950). Μια ανάλυση εμπλουτισμού με όρο GO αυτών των γονιδίων βρίσκει δύο υπερεκπροσωπούμενες βιολογικές διεργασίες:

Τύπος I Έκφραση γονιδίου MADS-Box

Λόγω του γνωστού ρόλου τους στην ανάπτυξη θηλυκών γαμετόφυτων και σπόρων σε μια σειρά φυτικών ταξινομήσεων (Colombo et al., 1997; Busi et al., 2003; Köhler et al., 2003; Arora et al., 2007; Colombo et al., 1997; Busi et al., 2003; Köhler et al., 2003; Arora et al., 2007; Colombo et al.. , 2008· Kang et al., 2008· Steffen et al., 2008· Zhang et al., 2018), εξετάσαμε περαιτέρω τα χρονικά μοτίβα έκφρασης των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων MADS-box τύπου I χρησιμοποιώντας μια ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης. Αυτή η ανάλυση εντόπισε συνεκφραζόμενα σύνολα ή ιεραρχικές ομάδες έκφρασης γονιδίων κουτιού MADS τύπου Ι, μια οικογένεια που περιλαμβάνει τα γονίδια Arabidopsis AGAMOUS-LIKE AGL26, AGL62 και AGL104. Δύο Mimulus τύπου I MADS-box DEG εκφράστηκαν σε ωάρια αλλά δεν εκφράστηκαν μετά τη γονιμοποίηση (Εικόνα 4, ομάδα VI). άλλα MADS-box DEG είτε εκφράστηκαν κυρίως σε σπόρους σταδίου τεσσάρων κυττάρων έως δερματογόνου (2-4 DAP, συστάδες IV και V), ή σε σπόρους σφαιρικού και καρδιακού σταδίου (6–8 DAP, συστάδες I και II) (Εικόνα 4). Ένας γείτονας που ενώνει (NJ) δέντρο τύπου I γονιδίων MADS από M. guttatus, S. lycopersicum, A. thaliana και O. sativa υποδηλώνει ότι σε ορισμένες περιπτώσεις, γονίδια με παρόμοια χρονικά πρότυπα έκφρασης είναι το ένα οι πλησιέστεροι συγγενείς του άλλου (Εικόνα 5). .

Εικόνα 4 Ένας θερμικός χάρτης της έκφρασης γονιδίου τύπου Ι του κουτιού MADS σε ωάρια και σπόρους. Το πλησιέστερο ομόλογο Arabidopsis thaliana για κάθε γονίδιο MADS-box Mimulus guttatus υποδεικνύεται σε παρενθέσεις (όπως προσδιορίζεται από το BLASTx).

Σχήμα 5 Γείτονα που ενώνει δέντρο γονιδίων MADS-box τύπου I από ρύζι (Oryza sativa), Arabidopsis thaliana, ντομάτα (Solanum lycopersicum) και Mimulus guttatus (γραμμή αναφοράς IM62). Η υποστήριξη του bootstrap αντιπροσωπεύεται από χρώμα (πράσινο ≥ 90, μπλε 80–89). Οι κόμβοι με υποστήριξη μικρότερη από 80% δεν επισημαίνονται. Τα γονίδια M. guttatus που εκφράζονται στο σύνολο δεδομένων μας κωδικοποιούνται με χρωματική κωδικοποίηση από τον χρόνο κορυφαίας έκφρασης. Τα προφίλ έκφρασης A. thaliana υποδεικνύονται με χρωματικά κωδικοποιημένα τρίγωνα.

Τέσσερα αποτυπωμένα γονίδια που εκφράζονται με ενδοσπέρμιο εμφανίζουν ισχυρή προκατάληψη της πατρικής έκφρασης

Συγκεντρώσαμε μια λίστα με 163 γονίδια που έδειξαν μεροληψία έκφρασης υπέρ του αλληλόμορφου M. guttatus όπως περιγράφεται παραπάνω (Πίνακες S8 και S9). Το M. guttatus-bias θα μπορούσε να είναι το αποτέλεσμα της μεροληψίας ή της αποτύπωσης ειδικής έκφρασης του cis-ρυθμιστικού αλληλόμορφου (Stupar and Springer, 2006; Zhang and Borevitz, 2009). το πρώτο θα ήταν M. guttatus-προκατειλημμένο ανεξάρτητα από την κατεύθυνση διέλευσης. Επικυρώσαμε 7 από αυτά τα υποτιθέμενα γονίδια μεροληπτικά M. guttatus όπως παραπάνω και όλα εκφράζονται σε ενδοσπέρμιο. Τέσσερα γονίδια αποτυπώθηκαν, παρουσιάζοντας πατρική μεροληψία έκφραση σε απομονωμένο ενδοσπέρμιο ανεξάρτητα από την κατεύθυνση της διασταύρωσης (Πίνακας 2, Εικόνα 6). Περιέργως, μόνο ένα από τα επικυρωμένα γονίδια εμφανίζει χρονικά σημαντικές αλλαγές έκφρασης: το Migut.E01117 δεν εκφράζεται μέχρι το 6 DAP και στη συνέχεια μειώνεται στο 8 DAP. Τα υπόλοιπα δεν αναγνωρίστηκαν ως DEG από την ανάλυση χρονοσειρών μας. Και τα τέσσερα γονίδια έχουν αποτυπωμένα ομόλογα σε άλλα είδη (Πίνακας 2). Τα υπόλοιπα τρία υποτιθέμενα γονίδια με προκατάληψη M. guttatus εμφάνισαν ειδική έκφραση αλληλόμορφων (Πίνακας 2).

Πίνακας 2 Επιλέχθηκαν για επικύρωση γονίδια που εμφανίζουν ειδική μεροληψία αλληλόμορφου Mimulus guttatus.

Σχήμα 6 Επικύρωση τεσσάρων εκφρασμένων από τον πατέρα αποτυπωμένων γονιδίων: Migut.E01117 (MBD13), Migut.H00744 (ATRX5), Migut.I00545 (DnaJ) και Migut.N01317 (BGAL11) μέσω ημι-ποσοτικής PCR και Sanger. (Α) Δίνονται αναλύσεις πραγματικού χρόνου (RT)-PCR ειδικές για αλληλόμορφα για κάθε γονίδιο στο ενδοσπέρμιο αυτοφυών και αμοιβαίων διασταυρώσεων Mimulus pardalis (Mp) και Mimulus guttatus (Mg). Για κάθε γονίδιο, το πήκτωμα δείχνει τα μεγέθη των θραυσμάτων περιορισμού μετά από ενίσχυση RT-PCR και πέψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσες. (Β) Η πατρική έκφραση επιβεβαιώθηκε με χρωματογραφίες αλληλουχίας πραγματικού χρόνου (RT)-PCR σε επιλεγμένες περιοχές SNP που μετρούν την ειδική για αλληλόμορφη έκφραση σε αμοιβαίες διασταυρώσεις.

Συζήτηση

Η ανάπτυξη του σπόρου μπορεί να χωριστεί σε στάδια: πρώιμος σχηματισμός εμβρύου και πολλαπλασιασμός του ενδοσπερμίου, έναρξη και μορφογένεση οργάνων εμβρύου και έναρξη της ωρίμανσης, κατά την οποία το ενδοσπέρμιο συσσωρεύει πρωτεΐνες αποθήκευσης σπόρων και το έμβρυο εισέρχεται σε λήθαργο (Agarwal et al., 2011). Στο Mimulus, όπως και στο Arabidopsis, η πλειονότητα των γονιδίων που εκφράζονται σε ωάρια και σπόρους εκφράζονται σε όλα τα στάδια ανάπτυξης ωαρίων και σπόρων και συγκριτικά λίγα γονίδια είναι ειδικά για το στάδιο με έναν ακόμη μικρότερο αριθμό αποκλειστικά για ωάρια ή ανάπτυξη σπόρων από 2 έως 8 DAP (Πίνακας S7), υποδηλώνοντας ότι η πλειοψηφία των γονιδίων εκπληρώνει πολλαπλούς αναπτυξιακούς και βιολογικούς ρόλους (Le et al., 2010; Belmonte et al., 2013; Chen et al., 2014).

Ένα ερώτημα ιδιαίτερου ενδιαφέροντος είναι «ποιο είναι το σύνολο των γονιδίων που ρυθμίζουν τον εξαρχής κυτταρικό τύπο ανάπτυξης του ενδοσπερμίου και επιπλέον, η έκφραση αυτών των βασικών ρυθμιστών εκφράζεται μοναδικά στα κυτταρικά ενδοσπέρματα»; Παρατηρούμε κάποια αλληλεπικάλυψη μεταξύ του συνόλου των γονιδίων που εκφράζονται με τρόπο αποκλειστικό για σπόρους στο M. guttatus και των γονιδίων αποκλειστικών σπόρων που ανιχνεύονται σε άλλα είδη (π.χ. A. thaliana, καλαμπόκι και ντομάτα). Επιπλέον, υπάρχουν 8 γονίδια ντομάτας αποκλειστικά για σπόρους (που σχετίζονται με 25 ομόλογα Mimulus αποκλειστικά για σπόρους) που δεν εκφράζονται αποκλειστικά με σπόρους στον αραβόσιτο ή στο Arabidopsis. Αυτά τα γονίδια μπορεί να είναι καλοί υποψήφιοι για μελλοντικές λειτουργικές αναλύσεις που στοχεύουν στον εντοπισμό ρυθμιστικών διαφορών μεταξύ των στρατηγικών ανάπτυξης εξαρχής κυτταρικού και συγκυτιακού ενδοσπερμίου. Ωστόσο, Παραμένει πιθανό η διαφορά μεταξύ της εκ πρώτης όψεως και της ανάπτυξης συγκυτιακού ενδοσπερμίου να καθορίζεται από διαφορές στις δομικές πτυχές των κωδικοποιημένων πρωτεϊνών ή σε άλλες αλλαγές (π.χ. μετα-μεταγραφικές) που δεν αντικατοπτρίζονται στα μεταγραφικά μοτίβα που έχουμε εντοπίσει σε αυτήν την εργασία. Μόνο μελλοντικές λειτουργικές αναλύσεις μπορούν να απαντήσουν σε αυτό το ερώτημα. Παρατηρούμε έλλειψη επικάλυψης μεταξύ των γονιδίων που αποκλείουν τον σπόρο του A. thaliana και του αποκλειστικού σπόρου αραβοσίτου, τα οποία είναι εμπλουτισμένα σε ενδοσπέρμιο αλλά δεν εκφράζονται στους σπόρους του M. guttatus. Αυτό υποδηλώνει σημαντικό βαθμό μεταγραφικής απόκλισης μεταξύ αυτών των δύο ταξινομικών κατηγοριών που εμφανίζουν και τα δύο συγκυτιακή ανάπτυξη και μπορεί να αντικατοπτρίζει το γεγονός ότι αυτά τα είδη είναι πολύ γενετικά και εξελικτικά αποκλίνοντα και εμφανίζουν σημαντικές διαφορές στην ανάπτυξη των σπόρων συνολικά (το A. thaliana είναι δίκοταδο και ο αραβόσιτος είναι μονοκοτυλιά).

Τα περισσότερα εκφραζόμενα γονίδια δεν παρουσιάζουν σημαντικές αλλαγές που σχετίζονται με τη γονιμοποίηση και τα σημαντικά αναπτυξιακά γεγονότα μέσα στους σπόρους. Ένα σημαντικό μέρος, ωστόσο, εκφράζεται διαφορετικά και διαχωρίζεται σε ομάδες που υποδηλώνουν τους ρόλους τους στην ανάπτυξη. Τρεις ομάδες γονιδίων συνέκφρασης (ομάδες 2, 17 και 18) αξίζουν περαιτέρω συζήτηση εδώ λόγω των συσχετισμένων λειτουργικών όρων GO και της παρουσίας προτύπων γονιδιακής έκφρασης ειδικά για το στάδιο.

Συστάδα 17: Γονίδια εμπλουτισμένα για τον μιτωτικό κυτταρικό κύκλο και την οργάνωση της χρωματίνης

Τα γονίδια εντός της ομάδας 17 εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό στα ωάρια, μειώνονται στην έκφραση και στη συνέχεια αυξάνονται στους σπόρους σφαιρικού και καρδιακού σταδίου (Εικόνα 3). Οι υπερεκπροσωπούμενοι όροι GO υποδεικνύουν λειτουργικούς ρόλους στη ρύθμιση της οργάνωσης της χρωματίνης, της αντιγραφής του DNA και του κυτταρικού κύκλου. Ένα ομόλογο Mimulus της TOPOISOMERASE II (TOPII), το οποίο λειτουργεί για να διασφαλίζει τη σωστή κίνηση των χρωμοσωμάτων κατά την κυτταρική διαίρεση στο A. thaliana (Martinez-Garcia et al., 2018) περιέχεται επίσης στη συστάδα 17. Άλλα γονίδια σε αυτό το σύμπλεγμα έχουν ομόλογα που σχετίζονται με οργάνωση χρωματίνης συμπεριλαμβανομένων των AtCMT3 και AtMET1, οι οποίες δρουν για τη διατήρηση της μεθυλίωσης των θέσεων CHH και CG, αντίστοιχα, κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του DNA (Lindroth et al., 2001· Kankel et al., 2003). Στο A. thaliana, η ανάπτυξη των σπόρων συνοδεύεται από εκτεταμένο κέρδος μεθυλίωσης CHH, ειδικά εντός μετατιθέμενων στοιχείων και η μεταγραφή CMT3 και MET1 περιορίζεται σε μεγάλο βαθμό στο έμβρυο (Hsieh et al., 2009; Kawakatsu et al., 2017). Αντίθετα, πολλαπλά ομόλογα του CMT3 εκφράζονται στο ενδοσπέρμιο της τομάτας στο σφαιρικό στάδιο (Roth et al., 2019), αυξάνοντας την πιθανότητα ότι η λειτουργία του CMT3 στο Mimulus είναι πιο παρόμοια με την ντομάτα από το A. thaliana. Επίσης μέσα σε αυτό το σύμπλεγμα είναι ένα ομόλογο Mimulus του AtHMGB3, μια οικογένεια πρωτεϊνών με τομέα δέσμευσης DNA του κουτιού HMG που δρουν ως παγκόσμιοι ρυθμιστές της δομής της χρωματίνης μέσω της συναρμολόγησης συγκροτημάτων νουκλεοπρωτεϊνών (Pedersen και Grasser, 2010). Βρίσκουμε επίσης ένα ομόλογο του MINICHROMOSOME MAINTENANCE 7 (MCM7) και ο χρονισμός της έκφρασής του αντικατοπτρίζει το μοτίβο έκφρασής του στο A. thaliana. Το AtMCM7 είναι μέρος ενός συμπλέγματος που ξετυλίγει το DNA πριν από την αντιγραφή,

Συστάδα 2: Γονίδια που σχετίζονται με τη στρατολόγηση μιας ρυθμιστικής μονάδας βιοσύνθεσης δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος

Το σύμπλεγμα 2 αποτελείται από γονίδια που εκφράζονται ελάχιστα από 0 έως 4 DAP, κορυφώνονται δραματικά σε σπόρους σφαιρικού σταδίου (6 DAP) και μετά πάλι μειώνονται στους σπόρους σταδίου καρδιάς (8 DAP) (Εικόνα 3). Αυτά τα γονίδια δείχνουν μια ισχυρή υπερεκπροσώπηση των σχολιασμών GO που σχετίζονται με τη βιογένεση του δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος και τις δραστηριότητες αναδιαμόρφωσης του κυτταρικού τοιχώματος (Πίνακας S5). Το σύμπλεγμα 2 περιέχει ομόλογα Mimulus των γονιδίων Arabidopsis IRREGULAR XYLEM (IRX) συμπεριλαμβανομένων των IRX1 (At4g18780), IRX3 (At5g17420) και IRX5 (At5g44030), όλα που κωδικοποιούν τη συνθάση κυτταρίνης που κωδικοποιεί τη δεύτερη μορφή συνθάσης κυτταρίνης. Taylor et al., 2000· Taylor et al., 2004), καθώς και Mimulus ομόλογα των IRX7 (At2g28110), IRX9 (At2g37090), IRX10 (At1g27440), IRX12 (At2g30XL), IRX12 (At2g30XL) (At5g67210), τα οποία κωδικοποιούν πρόσθετα ένζυμα που εμπλέκονται στη σύνθεση του δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος (Zhong and Ye, 2015). Το σύμπλεγμα 2 περιέχει επίσης παράγοντες μεταγραφής που αποτελούν ένα βασικό ρυθμιστικό δίκτυο σχηματισμού δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος. Αυτά περιλαμβάνουν τα ομόλογα Mimulus της ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ 2 (SND2) NAC DOMAIN SECONDARY WALL-ASSOCIATED (SND2) (At4g28500), KNAT7 (At1g62990) και πέντε μέλη μιας οικογένειας MYB παραγόντων μεταγραφής που ρυθμίζουν τον σχηματισμό δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος (At688534,302, At688534,302, At6854g, At604g, At604g, At604g, At604g, At601,00,00,00. At1g66230). Έτσι, ένα μεγάλο μέρος του ρυθμιστικού μηχανισμού που βασίζεται στη σύνθεση του δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος στο Arabidopsis φαίνεται να διατηρείται στο Mimulus και στρατολογείται για να μεσολαβήσει σε ορισμένα δευτερογενή γεγονότα κυτταρικού τοιχώματος ειδικά σε αυτό το στάδιο ανάπτυξης, το οποίο περιλαμβάνει τον γρήγορο πολλαπλασιασμό του ενδοσπερμίου (Oneal et al. , 2016). Εκτός από τον μεγάλο αριθμό γονιδίων με γνωστούς λειτουργικούς σχολιασμούς στο Arabidopsis, πολλά άλλα γονίδια εντός του συμπλέγματος έκφρασης αναμένεται να ρυθμίζουν και να λειτουργούν στη βιοσύνθεση του δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος στο Mimulus. Ως εκ τούτου, η ανάλυσή μας προσδιορίζει επιπλέον υποψήφιους Mimulus για μελλοντικές λειτουργικές μελέτες ρύθμισης του δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος.

Συστάδα 18: Γονίδια που εμπλέκονται στη σύνθεση της αυξίνης και στη συσσώρευση δεξαμενών θρεπτικών ουσιών στο ενδοσπέρμιο

Η φυτική ορμόνη αυξίνη σχετίζεται με σχεδόν κάθε πτυχή της ανάπτυξης και ανάπτυξης των φυτών, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης σπόρων και καρπών (Zhao, 2010; Li et al., 2016; Figueiredo and Köhler, 2018). Ανιχνεύσαμε την έκφραση πολλών συστατικών της βιοσύνθεσης αυξίνης και της οδού σηματοδότησης στο σύμπλεγμα 18 που κορυφώνεται σε 8 σπόρους DAP (Εικόνα 3). Πράγματι, δύο τέτοια γονίδια που εκφράζονται αποκλειστικά σε σπόρους καρδιακού σταδίου είναι τα ομόλογα M. guttatus του TRYPTOPHAN AMINOTRANSFERASE RELATED2 (TAR2; Migut.D01989) και το YUCCA4 (YUC4; Migut.A00287) που κωδικοποιούν τα κύρια ένζυμα CYU της TAR και της βιοξίνης. μονοπάτι (Brumos et al., 2014). Εκφράζονται επίσης πολλαπλά γονίδια AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF), συμπεριλαμβανομένων τριών ομολόγων του μεταγραφικού παράγοντα ARF19 (Migut.L01587, Migut.J00834, Migut.L01914),

Τα ομόλογα Arabidopsis των γονιδίων Mimulus που βρίσκονται σε αυτό το σύμπλεγμα σχετίζονται με τη βιοσύνθεση σπορελαίου και εμφανίζουν αυξανόμενη έκφραση στους ώριμους σπόρους A. thaliana (At5g52920, At3g02630 και At5g63380) (Hajduch et al., 2010). Έτσι, προτείνουμε αυτά τα γονίδια Mimulus να παίζουν ρόλο στις μεταβολικές διεργασίες που δημιουργούν τα αποθέματα ενέργειας που απαιτούνται από τον φαινότυπο των ώριμων σπόρων. Μια τέτοια ομάδα σημαντικών ρυθμιστών της ωρίμανσης των σπόρων περιλαμβάνει την ομάδα γονιδίων LEAFY COTYLEDON (LEC). Το FUS3 είναι συστατικό αυτής της ομάδας και δρα ως μεταγραφικός ενεργοποιητής (Keith et al., 1994; Luerßen et al., 1998; Yamamoto et al., 2009; Wang and Perry, 2013). Τα μεταλλαγμένα fus3 χάνουν την ταυτότητα του εμβρύου και αποτυγχάνουν να βλαστήσουν (Harada, 2001). Το ABI3 είναι ένας άλλος μεταγραφικός ενεργοποιητής και τα μεταλλάγματα abi3 παρουσιάζουν μειωμένη ωρίμανση και βλάστηση εμβρύων (Parcy et al., 1994). Τόσο το FUS3 (Migut.F00019/At3g26790) όσο και το ABI3 (Migut.D00511/At3g24650) διαχωρίζονται στο σύμπλεγμα 18 και εκφράζονται διαφορικά κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του σπόρου: Το MgFUS3 εκφράζεται αποκλειστικά σε σπόρους καρδιακού σταδίου, ενώ εκφράζεται σε σπόρους καρδιακού σταδίου, σφαιρίδια3 – και σπόροι σταδίου καρδιάς. Ομοίως, το πλησιέστερο ομόλογο του τύπου LEC1 (AtL1L/At5g47670/Migut.M01289) περιέχεται επίσης σε αυτό το σύμπλεγμα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το MgABI3 και το MgFUS3 μπορεί να ρυθμίζουν την έκφραση αυτής της ομάδας γονιδίων με τρόπο παρόμοιο με αυτό που παρατηρείται στους σπόρους Arabidopsis, αραβόσιτου, κριθαριού και ντομάτας (McCarty et al., 1991; Bassel et al., 2006; Abraham et al., 2016). ενώ το MgABI3 εκφράζεται σε σπόρους σφαιρικού και καρδιακού σταδίου. Ομοίως, το πλησιέστερο ομόλογο του τύπου LEC1 (AtL1L/At5g47670/Migut.M01289) περιέχεται επίσης σε αυτό το σύμπλεγμα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το MgABI3 και το MgFUS3 μπορεί να ρυθμίζουν την έκφραση αυτής της ομάδας γονιδίων με τρόπο παρόμοιο με αυτό που παρατηρείται στους σπόρους Arabidopsis, αραβόσιτου, κριθαριού και ντομάτας (McCarty et al., 1991; Bassel et al., 2006; Abraham et al., 2016). ενώ το MgABI3 εκφράζεται σε σπόρους σφαιρικού και καρδιακού σταδίου. Ομοίως, το πλησιέστερο ομόλογο του τύπου LEC1 (AtL1L/At5g47670/Migut.M01289) περιέχεται επίσης σε αυτό το σύμπλεγμα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το MgABI3 και το MgFUS3 μπορεί να ρυθμίζουν την έκφραση αυτής της ομάδας γονιδίων με τρόπο παρόμοιο με αυτό που παρατηρείται στους σπόρους Arabidopsis, αραβόσιτου, κριθαριού και ντομάτας (McCarty et al., 1991; Bassel et al., 2006; Abraham et al., 2016).

Γονίδια Mimulus MADS-Box που εκφράζονται κατά την ανάπτυξη των σπόρων

Τα γονίδια MADS-box είναι παράγοντες μεταγραφής που παίζουν καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση των αναπτυξιακών μεταβάσεων που εμπλέκονται στη βλάστηση, την ανάπτυξη των ριζών, την ανθοφορία και την αναπαραγωγή (Zhang and Forde, 1998· Saedler et al., 2001· Bemer et al., 2010). Έρευνες της έκφρασης του κουτιού MADS τύπου Ι στο A. thaliana έχουν βρει ότι μέλη αυτής της οικογένειας γονιδίων εκφράζονται σε πολλαπλούς κυτταρικούς τύπους μέσα στο θηλυκό γαμετόφυτο και στον αναπτυσσόμενο σπόρο (Bemer et al., 2010; Zhang et al., 2018). Η προέλευση των γονιδίων MADS-box τύπου II μπορεί να αποδοθεί σε μεγάλο βαθμό σε συμβάντα διπλασιασμού ολόκληρου του γονιδιώματος (Shan et al., 2007), ενώ τα γονίδια τύπου I MADS-box φαίνεται να έχουν εξελιχθεί τόσο μέσω του διπλασιασμού ολόκληρου του γονιδιώματος όσο και μέσω συμβάντων διπλασιασμού μικρότερης κλίμακας (Nam et al., 2004). Προηγούμενη εργασία έχει βρει ευρέως διαδεδομένα στοιχεία απώλειας γονιδίων, υπολειτουργικότητας,

Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι αρκετά χρονικά συνεκφραζόμενα γονίδια MADS τύπου I είναι το ένα πλησιέστερο συγγενικό στοιχείο του άλλου (Εικόνα 5). Για παράδειγμα, δύο γονίδια που κορυφώνονται σε έκφραση στα ωάρια (Migut.B00480 και Migut.N01504) και δύο που κορυφώνονται σε 2 σπόρους DAP (Migut.B00708 και Migut.D01476) είναι αδέρφια μεταξύ τους στο δέντρο NJ (Εικόνα 5) και εμπίπτουν στα ίδια συμπλέγματα έκφρασης (ομάδες 5 και 1, αντίστοιχα). Μαζί με το Migut.B00479, αυτά τα γονίδια περιέχονται σε ένα κλάδο που περιλαμβάνει τα γονίδια MADS AtAGL23 (At1g65360), AtAGL28 (At1g01530) και AtAGL62 (At5g60440). Στο A. thaliana, αυτά τα γονίδια λειτουργούν σε ρυθμιστικά δίκτυα στο θηλυκό γαμετόφυτο και στον αναπτυσσόμενο σπόρο (Colombo et al., 2008; Kang et al., 2008; Steffen et al., 2008; Bemer et al., 2010; Figueiredo et al. ., 2015· Fiume et al., 2017· Zhang et al., 2018). Δύο γονίδια MADS που εκφράζονται διαφορικά σε 6 σπόρους DAP (Migut.B01089 και Migut.L01896) περιέχονται σε ένα κλάδο που περιλαμβάνει τα AtAGL96 και AtAGL48, που εκφράζονται και τα δύο στο σφαιρικό έμβρυο (Bemer et al., 2010), όπως είναι και το σχετικό γονίδιο MADS-box ντομάτας Solyc12g016150 (Pattison et al., 2015). Τα Migut.K01032 και Migut.H01211 επίσης ζευγαρώνουν και κορυφώνονται σε 6 σπόρους DAP.

Αρκετά γονίδια τύπου I MADS-box εμφανίζουν χρονικά μοτίβα έκφρασης στο M. guttatus που αντικατοπτρίζουν την έκφρασή τους στο A. thaliana. Τέσσερα γονίδια MADS-box εκφράζονται στο θηλυκό γαμετόφυτο αλλά όχι στον γονιμοποιημένο σπόρο του A. thaliana, συμπεριλαμβανομένων των AtAGL49 (At1g60040), AtAGL60 (At1g72350), AtAGL73 (At5g38620) και AtAGL83 (At01,049) . Τα ομόλογα M. guttatus αυτών των γονιδίων (AtAGL49: Migut.B01668; AtAGL60, AGL73, και AGL83: Migut.N01504) εκφράζονται επίσης σε ωάρια M. guttatus αλλά όχι σε σπόρους (Πίνακας S7). Ομοίως, τα AtAGL102 (At1g47760), AtAGL34 (At5g26580) και AtAGL90 (At5g27960) εκφράζονται σε σπόρους A. thaliana αλλά όχι πριν από τη γονιμοποίηση (Bemer et al., 2010; Zhang et al., ). τα ομόλογα M. guttatus αυτών των γονιδίων (AtAGL102: Migut.K00930; AtAGL34 και AtAGL90: Migut.B01455) δεν εκφράζονται επίσης στα ωάρια, κορυφώνεται δραματικά σε σπόρους M. guttatus τεσσάρων κυττάρων εμβρύου (2 DAP) (Πίνακας S7). Επιπλέον, έξι από τα ειδικά για τους σπόρους γονίδια που προσδιορίσαμε είναι γονίδια τύπου I MADS-box, συμπεριλαμβανομένου ενός που είναι επίσης ειδικό για τους σπόρους στο A. thaliana (AtAGL45/At3g05860: Migut.B01089). Τέλος, τα AtAGL26 (At5g26880), AtAGL28 (At1g01530), AtAGL40 (At1g01530) και AtAGL62 (At4g36590) εκφράζονται τόσο στο θηλυκό γαμετόφυτο A. thaliana, όπως και τα ομόλογά τους M. guttatus (60L guttatus; AtAGL28, AtAGL40 και AtAGL62: Migut.B00480). Ενώ το ιστορικό διπλασιασμού, διατήρησης και απώλειας γονιδίων MADS-box τύπου Ι στο Mimulus παραμένει αβέβαιο, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν κοινούς ρόλους για αυτούς τους σημαντικούς μεταγραφικούς παράγοντες στη γαμετοφυτική ανάπτυξη και την ανάπτυξη σπόρων σε A. thaliana και M. guttatus. Επιπλέον, έξι από τα ειδικά για τους σπόρους γονίδια που προσδιορίσαμε είναι γονίδια τύπου I MADS-box, συμπεριλαμβανομένου ενός που είναι επίσης ειδικό για τους σπόρους στο A. thaliana (AtAGL45/At3g05860: Migut.B01089). Τέλος, τα AtAGL26 (At5g26880), AtAGL28 (At1g01530), AtAGL40 (At1g01530) και AtAGL62 (At4g36590) εκφράζονται τόσο στο θηλυκό γαμετόφυτο A. thaliana, όπως και τα ομόλογά τους M. guttatus (60L guttatus; AtAGL28, AtAGL40 και AtAGL62: Migut.B00480). Ενώ το ιστορικό διπλασιασμού, διατήρησης και απώλειας γονιδίων MADS-box τύπου Ι στο Mimulus παραμένει αβέβαιο, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν κοινούς ρόλους για αυτούς τους σημαντικούς μεταγραφικούς παράγοντες στη γαμετοφυτική ανάπτυξη και την ανάπτυξη σπόρων σε A. thaliana και M. guttatus. Επιπλέον, έξι από τα ειδικά για τους σπόρους γονίδια που προσδιορίσαμε είναι γονίδια τύπου I MADS-box, συμπεριλαμβανομένου ενός που είναι επίσης ειδικό για τους σπόρους στο A. thaliana (AtAGL45/At3g05860: Migut.B01089). Τέλος, τα AtAGL26 (At5g26880), AtAGL28 (At1g01530), AtAGL40 (At1g01530) και AtAGL62 (At4g36590) εκφράζονται τόσο στο θηλυκό γαμετόφυτο A. thaliana, όπως και τα ομόλογά τους M. guttatus (60L guttatus; AtAGL28, AtAGL40 και AtAGL62: Migut.B00480). Ενώ το ιστορικό διπλασιασμού, διατήρησης και απώλειας γονιδίων MADS-box τύπου Ι στο Mimulus παραμένει αβέβαιο, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν κοινούς ρόλους για αυτούς τους σημαντικούς μεταγραφικούς παράγοντες στη γαμετοφυτική ανάπτυξη και την ανάπτυξη σπόρων σε A. thaliana και M. guttatus. thaliana (AtAGL45/At3g05860: Migut.B01089). Τέλος, τα AtAGL26 (At5g26880), AtAGL28 (At1g01530), AtAGL40 (At1g01530) και AtAGL62 (At4g36590) εκφράζονται τόσο στο θηλυκό γαμετόφυτο A. thaliana, όπως και τα ομόλογά τους M. guttatus (60L guttatus; AtAGL28, AtAGL40 και AtAGL62: Migut.B00480). Ενώ το ιστορικό διπλασιασμού, διατήρησης και απώλειας γονιδίων MADS-box τύπου Ι στο Mimulus παραμένει αβέβαιο, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν κοινούς ρόλους για αυτούς τους σημαντικούς μεταγραφικούς παράγοντες στη γαμετοφυτική ανάπτυξη και την ανάπτυξη σπόρων σε A. thaliana και M. guttatus. thaliana (AtAGL45/At3g05860: Migut.B01089). Τέλος, τα AtAGL26 (At5g26880), AtAGL28 (At1g01530), AtAGL40 (At1g01530) και AtAGL62 (At4g36590) εκφράζονται τόσο στο θηλυκό γαμετόφυτο A. thaliana, όπως και τα ομόλογά τους M. guttatus (60L guttatus; AtAGL28, AtAGL40 και AtAGL62: Migut.B00480). Ενώ το ιστορικό διπλασιασμού, διατήρησης και απώλειας γονιδίων MADS-box τύπου Ι στο Mimulus παραμένει αβέβαιο, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν κοινούς ρόλους για αυτούς τους σημαντικούς μεταγραφικούς παράγοντες στη γαμετοφυτική ανάπτυξη και την ανάπτυξη σπόρων σε A. thaliana και M. guttatus. Migut.B00480). Ενώ το ιστορικό διπλασιασμού, διατήρησης και απώλειας γονιδίων MADS-box τύπου Ι στο Mimulus παραμένει αβέβαιο, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν κοινούς ρόλους για αυτούς τους σημαντικούς μεταγραφικούς παράγοντες στη γαμετοφυτική ανάπτυξη και την ανάπτυξη σπόρων σε A. thaliana και M. guttatus. Migut.B00480). Ενώ το ιστορικό διπλασιασμού, διατήρησης και απώλειας γονιδίων MADS-box τύπου Ι στο Mimulus παραμένει αβέβαιο, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν κοινούς ρόλους για αυτούς τους σημαντικούς μεταγραφικούς παράγοντες στη γαμετοφυτική ανάπτυξη και την ανάπτυξη σπόρων σε A. thaliana και M. guttatus.

Πατερικά Αποτυπωμένα Γονίδια στο Ενδοσπέρμιο Mimulus

Η κυρίαρχη υπόθεση για την εξέλιξη της εντυπωμένης έκφρασης είναι η θεωρία της συγγένειας, η οποία υποστηρίζει ότι οι προκαταλήψεις στην έκφραση γονιδίων που προέρχονται από τη μητέρα ή τον πατέρα έχουν εξελιχθεί για να μεγιστοποιήσουν την καταλληλότητα των μητέρων έναντι των απογόνων σε σχέση με την παροχή απογόνων μέσω του ενδοσπερμίου (Haig and Westoby, 1989 Haig, 2004). Σύμφωνα με αυτό το σενάριο, η γονιδιωματική σύγκρουση για τους μητρικούς πόρους θα μπορούσε να οδηγήσει σε ταχεία εξέλιξη των εντυπωμένων τόπων, με αποτέλεσμα ταχεία απόκλιση αλληλουχιών ή/και αλλαγή στην κατάσταση αποτύπωσης των γονιδίων μεταξύ ακόμη και στενά συγγενών ειδών (Köhler et al., 2010; Köhler et al. , 2012). Γενικά, οι έρευνες των αποτυπωμένων γονιδίων έχουν βρει μικρή επικάλυψη στην κατάσταση αποτύπωσης των τόπων μεταξύ στενά συγγενών (Wolff et al., 2011) ή εξ αποστάσεως σχετιζόμενων κατηγοριών (Luo et al., 2011· Waters et al., 2013· Yoshida et al. , 2018), ωστόσο, ορισμένοι τόποι είναι αποτυπωμένοι σε πολλά διαφορετικά είδη. Εδώ αναφέρουμε τα πρώτα επικυρωμένα αποτυπωμένα γονίδια στο M. guttatus [(αλλά βλέπε (Kinser et al., 2018)]. Διαπιστώσαμε ότι και τα τέσσερα επικυρωμένα πατρικά αποτυπωμένα γονίδια (PEG) έχουν ομόλογα που είναι αποτυπωμένα σε άλλα είδη, όπως καλαμπόκι, σόργο και ρύζι (Πίνακας 2). Δεδομένης της ad hoc μεθόδου μας για την επικύρωση υποψήφιων PEG, η οποία περιλάμβανε ως κριτήριο τη δυνατότητα αποτύπωσης σε άλλα είδη, αυτό δεν προκαλεί έκπληξη. Ωστόσο, το γεγονός ότι αυτά τα γονίδια είναι αποτυπωμένα σε πολλαπλά είδη, συμπεριλαμβανομένου ενός με αποτυπωμένα ομόλογα σε έξι άλλα είδη (Migut.I00545: DnaJ heat shock chaperone protein), υποδηλώνει ότι οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από αυτά τα γονίδια εκτελούν παρόμοιες λειτουργίες στο ενδοσπέρμιο στα φυτικά ταξινομικά ταξινομημένα είδη. Βρήκαμε ότι και τα τέσσερα επικυρωμένα πατρικά αποτυπωμένα γονίδια μας (PEGs) έχουν ομόλογα που είναι αποτυπωμένα σε άλλα είδη, συμπεριλαμβανομένου του καλαμποκιού, του σόργου και του ρυζιού (Πίνακας 2). Δεδομένης της ad hoc μεθόδου μας για την επικύρωση υποψήφιων PEG, η οποία περιλάμβανε ως κριτήριο τη δυνατότητα αποτύπωσης σε άλλα taxa, αυτό δεν προκαλεί έκπληξη. Ωστόσο, το γεγονός ότι αυτά τα γονίδια είναι αποτυπωμένα σε πολλά είδη, συμπεριλαμβανομένου ενός με αποτυπωμένα ομόλογα σε έξι άλλα είδη (Migut.I00545: DnaJ θερμικού σοκ πρωτεΐνης συνοδού), υποδηλώνει ότι οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από αυτά τα γονίδια εκτελούν παρόμοιες λειτουργίες στο ενδοσπέρμιο στα φυτικά ταξινομικά είδη. Βρήκαμε ότι και τα τέσσερα επικυρωμένα πατρικά αποτυπωμένα γονίδια μας (PEGs) έχουν ομόλογα που είναι αποτυπωμένα σε άλλα είδη, συμπεριλαμβανομένου του καλαμποκιού, του σόργου και του ρυζιού (Πίνακας 2). Δεδομένης της ad hoc μεθόδου μας για την επικύρωση υποψήφιων PEG, η οποία περιλάμβανε ως κριτήριο τη δυνατότητα αποτύπωσης σε άλλα taxa, αυτό δεν προκαλεί έκπληξη. Ωστόσο, το γεγονός ότι αυτά τα γονίδια είναι αποτυπωμένα σε πολλά είδη, συμπεριλαμβανομένου ενός με αποτυπωμένα ομόλογα σε έξι άλλα είδη (Migut.I00545: DnaJ θερμικού σοκ πρωτεΐνης συνοδού), υποδηλώνει ότι οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από αυτά τα γονίδια εκτελούν παρόμοιες λειτουργίες στο ενδοσπέρμιο στα φυτικά ταξινομικά είδη.

Προηγούμενη εργασία δείχνει ότι πολλά PEG εμπλέκονται στην επιγενετική ρύθμιση (Waters et al., 2013; Pignatta et al., 2014) μέσω μεθυλίωσης DNA ή κατασταλτικών τροποποιήσεων ιστόνης. Δύο γονίδια M. guttatus που αναγνωρίσαμε ότι παρουσιάζουν πατρική μεροληψία ανήκουν σε αυτές τις λειτουργικές κατηγορίες: ένας μεταγραφικός παράγοντας δέσμευσης μεθυλίου-CpG Migut.E01117 (AtMBD13/At5g52230) και μια πρωτεΐνη αναδιαμόρφωσης χρωματίνης, Migut.H00tA90745. Οι μεταγραφικοί παράγοντες δέσμευσης μεθυλίου-CpG μεσολαβούν στη μεθυλίωση του CpG συντονίζοντας τις δραστηριότητες των αποακετυλασών ιστόνης και των μεθυλοτρανσφερασών ιστόνης (Zemach και Grafi, 2007). Ομοίως, το AtATXR5 προάγει τη γονιδιακή σίγαση στη συστατική ετεροχρωματίνη και την καταστολή των ΤΕ ενορχηστρώνοντας τη μονομεθυλίωση στο H3K27 (Jacob et al., 2009). Ομόλογα και των δύο γονιδίων αποτυπώνονται σε Capsella, καλαμπόκι, και κάστορας (MBD13) και στον αραβόσιτο και δύο είδη Solanum (Waters et al., 2013; Xu et al., 2014; Hatorangan et al., 2016; Roth et al., 2018). Ομόλογα της πρωτεΐνης θερμικού σοκ DnaJ (Migut.I00545) αποτυπώνονται σε έξι άλλα γένη, συμπεριλαμβανομένου του Solanum (Waters et al., 2013; Xu et al., 2014; Hatorangan et al., 2016; Roth et al., 2018), ενώ τα ομόλογα του BGAL11 (Migut.N01317) είναι αποτυπωμένα σε ρύζι και Solanum (Luo et al., 2011; Chen et al., 2018; Roth et al., 2018).

Η διαταραχή της αλληλικής δοσολογίας των πατρικά και μητρικά αποτυπωμένων γονιδίων στο ενδοσπέρμιο μπορεί να οδηγήσει σε δυσλειτουργική ανάπτυξη του ενδοσπερμίου και τελικά σε αποβολή σπόρων και σχετίζεται με αποτυχία υβριδικού σπόρου (Haig and Westoby, 1989; Haig and Westoby, 1991, Scott., Scott. 1998· Kinser et al., 2018). Η μεταζυγωτική απομόνωση μέσω αυτής της βιωσιμότητας των υβριδικών σπόρων είναι ευρέως διαδεδομένη στο Solanum (Baek et al., 2016) και οι αποτυπωμένοι τόποι έχουν εμπλακεί σε αυτή τη διαδικασία (Florez-Rueda et al., 2016; Roth et al., 2018; Roth et al. , 2019). Είναι εντυπωσιακό ότι τρία από τα επικυρωμένα PEG μας έχουν ομόλογα που είναι αποτυπωμένα στο Solanum (Πίνακας 2) και υποδηλώνει κοινά μοτίβα αποτύπωσης σε αυτά τα taxa, τα οποία και τα δύο εμφανίζουν ανάπτυξη κυτταρικού ενδοσπερμίου (Arekal, 1965· Oneal et al., 2016). Η βιωσιμότητα των υβριδικών σπόρων είναι επίσης κοινή στο M. σύμπλεγμα guttatus (Vickery, 1966; Vickery, 1978) και είναι γνωστό ότι σε ορισμένες περιπτώσεις προκαλείται από αποτυχία στην ανάπτυξη του ενδοσπέρματος (Oneal et al., 2016; Coughlan et al., 2018). Επιπλέον, οι επιδράσεις ορισμένων γονιδιωματικών τόπων που συμβάλλουν στη βιωσιμότητα των υβριδικών σπόρων εξαρτώνται από το εάν συνέβαλαν από το μητρικό ή το πατρικό γονιδίωμα (Garner et al., 2016). Μελλοντικές, συστηματικές έρευνες της γονιδιακής έκφρασης σε απομονωμένο ενδοσπέρμιο αμοιβαία διασταυρούμενων ενδοσπερμάτων στο M. guttatus και σε στενά συγγενικά διπλοειδή αδελφά είδη (π.χ. Mimulus nudatus, Mimulus tilingii και Mimulus decorus), σε συνδυασμό με χαρακτηρισμούς της έκφρασής τους σε ασύμβατα υβρίδια θα μπορούσε να αποδείξει εάν η γονιδιωματική αποτύπωση, η οποία πιστεύεται ότι εξελίσσεται μέσω γονεϊκής σύγκρουσης σχετικά με τους μητρικούς πόρους,

Συμπερασματικά, χρησιμοποιήσαμε την αλληλουχία RNA για να προφίλ δυναμικών γεγονότων γονιδιακής έκφρασης σε σπόρους σε μια χρονική πορεία 8 ημερών και χρησιμοποιήσαμε αναλύσεις εμπλουτισμού γονιδιακής οντολογίας για να αποκαλύψουμε στατιστικά υπερεκπροσωπούμενες βιολογικές λειτουργικές κατηγορίες συνεκφραζόμενων συστάδων γονιδίων. Όσον αφορά τη ρύθμιση ορισμένων σημαντικών βιολογικών γεγονότων κατά την ανάπτυξη του σπόρου (π.χ. βιοσύνθεση δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος, ωρίμανση σπόρων, σύνθεση αυξίνης) οι συστάδες συνεκφραζόμενων γονιδίων που αναφέρονται εδώ παρέχουν πολύτιμα σημεία εισόδου για τη διερεύνηση νέων μοριακών ρυθμιστικών μηχανισμών κατά τη διάρκεια του σπόρου Mimulus ανάπτυξη. Ομοίως, η ανάλυσή μας των μεταγραφικών ρυθμιστών Mimulus MADS τύπου I υπογραμμίζει το υποσύνολο της οικογένειας που αναμένεται να λειτουργήσει κατά την ανάπτυξη των σπόρων και ενισχύει την κατανόησή μας για την εξέλιξη αυτής της οικογένειας γονιδίων. Επί πλέον, ανιχνεύσαμε και επικυρώσαμε γονίδια που εμφανίζουν πατρικά αποτυπωμένη έκφραση. Η διατήρηση της εντυπωμένης κατάστασης των ομόλογων γονιδίων σε άλλα αγγειόσπερμα που μελετήθηκαν υποδηλώνει έντονα ότι παίζουν λειτουργικό ρόλο κατά την ανάπτυξη του ενδοσπέρματος στο Mimulus, μια περιοχή για μελλοντική μελέτη. Τα δεδομένα μας διευρύνουν το ταξινομικό πλαίσιο που διέπει τις μελέτες για την ανάπτυξη των σπόρων γενικά και αποτελούν πολύτιμη πηγή για άλλους ερευνητές που διερευνούν την ανάπτυξη σπόρων και τη βιωσιμότητα των υβριδίων στο Mimulus, καθώς και μελλοντικές μελέτες συγκριτικής γονιδιακής έκφρασης.

Δήλωση διαθεσιμότητας δεδομένων

Τα δεδομένα αλληλουχίας DNA και RNA έχουν κατατεθεί στη βάση δεδομένων SRA και GEO (προσβάσεις SRX6435295, SRX6435296 (DNA) και GSE123424 (RNA)). Τα υποστηρικτικά δεδομένα παρέχονται στους συμπληρωματικούς πίνακες με αυτήν την υποβολή και περιλαμβάνουν όλους τους εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, στατιστικά στοιχεία ευθυγράμμισης για βιβλιοθήκες RNA, τιμές FPKM για όλα τα γονίδια, τα αποτελέσματα του edgeR, Next maSigPro, ομαδοποίηση, αναλύσεις εμπλουτισμού GO-term και ακατέργαστες Δεδομένα μέτρησης SNP για γονίδια που εμφανίζουν μεροληψία του M. guttatus από 2-8 DAP.

Συνεισφορές Συγγραφέων

Οι MF-V, EO και RF σχεδίασαν τη μελέτη από κοινού. Ο MF-V διαχειρίστηκε συνολικές πειραματικές προσεγγίσεις και δημιούργησε δείγματα και βιβλιοθήκες RNA και επικύρωσε αποτυπωμένα γονίδια. Οι EO, MF-V, GV και ML ανέλυσαν τα δεδομένα. Προσεγγίσεις ανάλυσης διαχειριζόμενης EO και συναρμολογημένη λίστα γονιδίων με έκφραση μεροληπτική του M. guttatus. Ο MC πραγματοποίησε την ιστολογική τομή και ανάλυση. Τα δεδομένα μορφολογίας σπόρων δημιουργήθηκαν από CR. Οι MF-V, EO και RF διαχειρίστηκαν την ερμηνεία δεδομένων και έγραψαν το χειρόγραφο. Οι SC και JW αναθεώρησαν και επεξεργάστηκαν το χειρόγραφο.

Χρηματοδότηση

Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις NSF IOS-1557692 (RF) και IOS-1558113 (JW), καθώς και από επιχορήγηση από το πρόγραμμα έρευνας και καινοτομίας Horizon2020 της Ευρωπαϊκής Ένωσης στο πλαίσιο της συμφωνίας επιχορήγησης Marie Skłodowska-Curie (Αριθ. 690946) προς την SC και RF. Η συμμετοχή της CR σε αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Integrated Molecular Plant Systems NSF-REU (Award DBI-1558579).

Σύγκρουση συμφερόντων

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη απουσία εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστούν τους Steffen Heber και Annie Jeong για τις χρήσιμες συζητήσεις σχετικά με την ανάλυση αλληλουχίας RNA, την Candace Haigler για χρήσιμες συζητήσεις σχετικά με τη βιογένεση του δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος, την Jenn Coughlan για την ανατροφοδότηση σχετικά με το χειρόγραφο και τις Danielle Curran, Bianca Clark και Jessica Markowitz για τη βοήθεια με τις αναλύσεις διασταύρωσης. Οι συγγραφείς ευχαριστούν επίσης το προσωπικό του Phytotron στο Κρατικό Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνας.

Συμπληρωματικό υλικό

Το συμπληρωματικό υλικό για αυτό το άρθρο βρίσκεται στο διαδίκτυο στη διεύθυνση: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2020.00132/full#supplementary-material

Οξύ στεφανιαίο σύνδρομο, ρήξη πλάκας, διάβρωση πλάκας, ασβεστοποιημένο οζίδιο, ενδοαγγειακό υπερηχογράφημα, τομογραφία οπτικής συνοχής, φασματοσκοπία εγγύς υπέρυθρης ακτινοβολίας, ανάπτυξη σπόρων, αλληλουχία RNA, ανάλυση αναπτυξιακού χρόνου, Ενδόσπερμα, Γονιδιωματική Αποτύπωση, Συστάδες γονιδίων K-Means, MADS, , Mimulus guttatus