Φερουλοϋλίωση κυτταρικού τοιχώματος χόρτου: κατανομή δεσμευμένου φερουλικού και υποψηφίου γονιδίου έκφρασης στο Brachypodium distachyon

• Plant Biology and Crop Science, Rothamsted Research, Harpenden, Hertfordshire, UK

Τα κυτταρικά τοιχώματα των χόρτων όπως το σιτάρι, ο αραβόσιτος, το ρύζι και το ζαχαροκάλαμο, περιέχουν μεγάλες ποσότητες φερουλικού που συνδέεται με εστέρα με τον πολυσακχαρίτη του κυτταρικού τοιχώματος γλυκουρονοαραβινοξυλάνη (GAX). Αυτό το φερουλικό θεωρείται ότι περιορίζει την πεπτικότητα του πολυσακχαρίτη στη βιομάζα χόρτου καθώς σχηματίζει ομοιοπολικούς δεσμούς μεταξύ συστατικών πολυσακχαρίτη και λιγνίνης. Υποψήφια γονίδια σε μια ειδική για το γρασίδι κλάδο της υπεροικογένειας BAHD acyl-coA τρανσφεράσης έχουν αναγνωριστεί ως υπεύθυνα για την εστερική σύνδεση του ferulate με το GAX. Ο χειρισμός αυτών των γονιδίων BAHD μπορεί επομένως να είναι ένας βιοτεχνολογικός στόχος για την αύξηση της αποτελεσματικότητας της μετατροπής της βιομάζας χόρτου σε βιοκαύσιμο. Εδώ, περιγράφουμε την έκφραση αυτών των υποψηφίων γονιδίων και τις ποσότητες δεσμευμένου φερουλικού από διάφορους ιστούς και αναπτυξιακά στάδια του μοντέλου χόρτου Brachypodium distachyon. Υποψήφιες μεταγραφές BAHD και σημαντικές ποσότητες δεσμευμένου φερουλικού ήταν παρόντες σε κάθε ιστό και αναπτυξιακό στάδιο. Υποθέτουμε ότι υποψήφια γονίδια BAHD παρόμοια με το πρόσφατα περιγραφόμενο γονίδιο Oryza sativa p-κουμαρικής μονολιγνόλης τρανσφεράσης (OsPMT) (υποκλάση PMT) είναι κυρίως υπεύθυνα για το δεσμευμένο παρα-κουμαρικό οξύ (pCA) και ότι άλλα υποψήφια BAHD (μη PMT sub-clade) είναι υπεύθυνοι για το δεσμευμένο φερουλικό οξύ (FA). Υπήρχαν κάποιες ομοιότητες με την αναλογία έκφρασης των μη-ΡΜΤ/ΡΜΤ γονιδίων και την αναλογία δεσμευμένων FA/pCA μεταξύ των τύπων ιστών, συμβατή με αυτήν την υπόθεση. Ωστόσο, απαιτείται πολύ περαιτέρω εργασία για την τροποποίηση των γονιδίων BAHD στα χόρτα και για τον χαρακτηρισμό των ετερόλογα εκφραζόμενων πρωτεϊνών για να αποδειχθεί η λειτουργία τους.

Εισαγωγή

Πολλές από τις πιο άφθονες πιθανές λιγνοκυτταρινικές πρώτες ύλες προέρχονται από χόρτα, είτε υποπροϊόντα από καλλιέργειες τροφίμων όπως άχυρο σιταριού, άχυρο ρυζιού, αραβόσιτο και υπολείμματα ζαχαροκάλαμου είτε από εξειδικευμένες καλλιέργειες βιοενέργειας όπως ο Miscanthus και το γρασίδι. Τέτοιες πρώτες ύλες διαφέρουν από αυτές από δικοτυλήδονες καλλιέργειες ως προς την εμφάνιση τρανς-φερουλικού οξέος (FA), ενός υδροξυκινναμικού οξέος που συνδέεται με εστέρα με το ημικυτταρινικό συστατικό, τη γλυκουρονοαραβινοξυλάνη (GAX; Carpita, 1996; Scheller and Ulvskov, 2010). Αυτή η σύνδεση εμφανίζεται μόνο σε μονοκοτυλήδονες commelinid και είναι ιδιαίτερα άφθονη στα χόρτα (Harris and Trethewey, 2010). Θεωρείται ότι επηρεάζει την πεπτικότητα (Grabber, 2005; Dhugga, 2007), καθώς το FA μπορεί να διασταυρωθεί οξειδωτικά για να σχηματίσει δεσμούς αιθέρα ή δεσμούς C-C, συνδέοντας αλυσίδες GAX (Ishii, 1991) ή GAX με λιγνίνη (Ralph et al., 1995). Έτσι συνδέει ομοιοπολικά τον πολυσακχαρίτη του κυτταρικού τοιχώματος που μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα για βιοκαύσιμα με το ανασταλτικό συστατικό λιγνίνης. Ενώ το εμπόδιο στην αποικοδόμηση που παρουσιάζεται από το FA είναι κυρίως δομικό, το FA έχει επίσης αντιμικροβιακή δράση, αναστέλλοντας τη ζύμωση του σακχάρου από τη ζύμη (Baranowski et al., 1980; Akin, 2008). Τα χόρτα με μειωμένη φερουλοϋλίωση του GAX στα κυτταρικά τους τοιχώματα μπορούν επομένως να μετατραπούν πιο εύκολα σε βιοκαύσιμο. Συγκεκριμένα, θα έχουν χαμηλότερη ενεργειακή απαίτηση για το διαχωρισμό της λιγνίνης από τον πολυσακχαρίτη, ένα ουσιαστικό βήμα στους περισσότερους αγωγούς επεξεργασίας βιομάζας. αναστέλλοντας τη ζύμωση σακχάρων από μαγιά (Baranowski et al., 1980; Akin, 2008). Τα χόρτα με μειωμένη φερουλοϋλίωση του GAX στα κυτταρικά τους τοιχώματα μπορούν επομένως να μετατραπούν πιο εύκολα σε βιοκαύσιμο. Συγκεκριμένα, θα έχουν χαμηλότερη ενεργειακή απαίτηση για το διαχωρισμό της λιγνίνης από τον πολυσακχαρίτη, ένα ουσιαστικό βήμα στους περισσότερους αγωγούς επεξεργασίας βιομάζας. αναστέλλοντας τη ζύμωση σακχάρων από μαγιά (Baranowski et al., 1980; Akin, 2008). Τα χόρτα με μειωμένη φερουλοϋλίωση του GAX στα κυτταρικά τους τοιχώματα μπορούν επομένως να μετατραπούν πιο εύκολα σε βιοκαύσιμο. Συγκεκριμένα, θα έχουν χαμηλότερη ενεργειακή απαίτηση για το διαχωρισμό της λιγνίνης από τον πολυσακχαρίτη, ένα ουσιαστικό βήμα στους περισσότερους αγωγούς επεξεργασίας βιομάζας.

Τα γονίδια και τα ένζυμα που είναι υπεύθυνα για τη φερουλοϋλίωση του GAX είναι ακόμη άγνωστα. Ωστόσο, χρησιμοποιώντας μια βιοπληροφορική ανάλυση δημοσίως διαθέσιμων ετικετών εκφρασμένης αλληλουχίας (ESTs), εντοπίσαμε μια ορθολογική ομάδα στην υπεροικογένεια BAHD acyl-coA ως πιθανές υποψήφιες με βάση τη διαφορική τους έκφραση στα δημητριακά σε σύγκριση με τα δίκοτα (Mitchell et al., 2007). Η οικογένεια BAHD (αναφέρεται επίσης ως οικογένεια PF02458, καθώς όλα τα μέλη της οικογένειας περιέχουν την περιοχή PFAM PF02458 που είναι ειδική για την οικογένεια) πήρε το όνομά της από τα πρώτα τέσσερα μέλη που χαρακτηρίζονται βιοχημικά (ακετυλοτρανσφεράση βενζυλαλκοόλης, BEAT, υδροξυκινναμοϋλοτρανσφεράση ανθοκυανίνης, AHCT ανθρανιλική υδροξυκινναμοϋλ/βενζοϋλ τρανσφεράση, HCBT, ακετυλοτρανσφεράση δεακτυλβινδολίνης, DAT, D’Auria, 2006). Ο προβλεπόμενος ρόλος στη φερουλοϋλίωση GAX είναι συμβατός με τις διάφορες δραστηριότητες υδροξυκινναμοϋλ τρανσφεράσης που δημιουργούν εστερικούς δεσμούς γνωστούς στην οικογένεια, με το φερουλοϋλ-CoA να ενεργεί ως δότης. Προσδιορίσαμε επίσης τα γονίδια GT61 που είναι πιθανό να εμπλέκονται στη βιοσύνθεση GAX (Mitchell et al., 2007) και πρόσφατα δείξαμε (σε συνεργασία με το εργαστήριο Dupree, Πανεπιστήμιο του Cambridge, UK) ότι αυτά τα γονίδια μεσολαβούν στην προσθήκη 3-συνδεδεμένων αραβινοφουρανόζη (Araf) σε ξυλάνη (Anders et al., 2012). Τα γονίδια GT61 τείνουν να συνεκφράζονται με τα υποψήφια BAHD στα δημητριακά (Mitchell et al., 2007· Shewry et al., 2011), σύμφωνα με έναν ρόλο στη φερουλοϋλίωση των 3-συνδεδεμένων υπολειμμάτων Araf που προστίθενται από τις πρωτεΐνες GT61. Ο προβλεπόμενος ρόλος των γονιδίων BAHD στη φερουλοϋλίωση δοκιμάστηκε από μια άλλη ομάδα χρησιμοποιώντας καταστολή RNAi στο ρύζι, παρουσιάζοντας μια μέτρια (-19%) αλλά σημαντική μείωση του φερουλικού που συνδέεται με το κυτταρικό τοίχωμα στους μίσχους των διαγονιδιακών φυτών (Piston et al., 2010). Ωστόσο, αυτό το αποτέλεσμα θα μπορούσε να είναι μια έμμεση συνέπεια της γονιδιακής καταστολής, επομένως ο ρόλος αυτών των γονιδίων BAHD εξακολουθεί να απαιτεί διευκρίνιση.

Ένα ερώτημα είναι ο ενδοκυτταρικός εντοπισμός των πρωτεϊνών που κωδικοποιούνται από τα γονίδια BAHD: αυτό προβλέπεται ότι είναι κυτταροπλασματικό με βάση τις πρωτεϊνικές αλληλουχίες και αυτός είναι ο εντοπισμός για όλα τα γνωστά μέλη της οικογένειας (D’Auria, 2006), ενώ το GAX συντίθεται στο Golgi (Buanafina, 2009). Μια δραστηριότητα από σπορόφυτα ρυζιού ικανά για φερουλοϋλίωση του Araf σε ένα συνθετικό μόριο βρέθηκε στο διαλυτό κλάσμα και όχι στο κλάσμα της μεμβράνης, σύμφωνο με ένα κυτταροζολικό ένζυμο (Yoshida-Shimokawa et al., 2001). Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι οι πρωτεΐνες BAHD είναι υπεύθυνες για τη φερουλοϋλίωση ενός κυτοσολικού προδρόμου, όπως το UDP-Araf, το οποίο είναι το υπόστρωμα για την αραβινοζυλίωση ξυλάνης. Ενώ η μεγάλη πλειοψηφία της UDP-αραβινοπυρανόζης συντίθεται στον αυλό Golgi, αυτό μετατρέπεται από μια μουτάση στη μορφή UDP-Araf στο κυτοσόλιο (Konishi et al., 2007; Rautengarten et al., 2011) επομένως αυτό είναι ένα πιθανό υπόστρωμα για μια αντίδραση κυτταροζολικής φερουλοϋλίωσης στο φυτό. Το προϊόν από αυτό θα μεταφερόταν στη συνέχεια πίσω στο Golgi, όπου το φερουλοϋλιωμένο Araf θα μεταφερόταν στο GAX, πιθανώς από ένα ένζυμο GT61. Η φερουλοϋλίωση της αραβινοξυλάνης έχει αποδειχθεί ότι συμβαίνει εντός του πρωτοπλάστη (Myton and Fry, 1994), αν και υπάρχουν επίσης ενδείξεις εναλλακτικής οδού που επιτρέπει τη φερουλοϋλίωση στο τοίχωμα όταν χρησιμοποιούνται αναστολείς για την καταστολή της εκκριτικής οδού (Mastrangelo et al., 2009). όπου το φερουλοϋλιωμένο Araf θα μεταφερόταν στο GAX, πιθανώς από ένα ένζυμο GT61. Η φερουλοϋλίωση της αραβινοξυλάνης έχει αποδειχθεί ότι συμβαίνει εντός του πρωτοπλάστη (Myton and Fry, 1994), αν και υπάρχουν επίσης ενδείξεις εναλλακτικής οδού που επιτρέπει τη φερουλοϋλίωση στο τοίχωμα όταν χρησιμοποιούνται αναστολείς για την καταστολή της εκκριτικής οδού (Mastrangelo et al., 2009). όπου το φερουλοϋλιωμένο Araf θα μεταφερόταν στο GAX, πιθανώς από ένα ένζυμο GT61. Η φερουλοϋλίωση της αραβινοξυλάνης έχει αποδειχθεί ότι συμβαίνει εντός του πρωτοπλάστη (Myton and Fry, 1994), αν και υπάρχουν επίσης ενδείξεις εναλλακτικής οδού που επιτρέπει τη φερουλοϋλίωση στο τοίχωμα όταν χρησιμοποιούνται αναστολείς για την καταστολή της εκκριτικής οδού (Mastrangelo et al., 2009).

Μια σημαντική πρόσφατη ανακάλυψη ήταν η απόδειξη ότι τουλάχιστον ένα από αυτά τα γονίδια BAHD στο ρύζι έχει διαφορετικό ρόλο από αυτόν που είχε προβλεφθεί. στο ότι η κωδικοποιημένη πρωτεΐνη καταλύει την προσθήκη όχι FA σε ένα σάκχαρο, αλλά του στενά συνδεδεμένου παρα-κουμαρικού οξέος (pCA) σε μονολιγνόλες. Αυτό το γονίδιο επομένως κωδικοποιεί μια τρανσφεράση μονολιγνόλης pCA και έχει ονομαστεί OsPMT (Oryza sativa p-coumarate monolignol transerase; Withers et al., 2012). Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ άλλες πρωτεΐνες BAHD έχουν αποδειχθεί ότι χρησιμοποιούν τόσο FA-CoA όσο και pCA-CoA ως μόρια δότη (Luo et al., 2007), το OsPMT βρέθηκε να μην έχει σχεδόν καμία δραστηριότητα με το FA-CoA (Withers et al., 2012 ). Ενώ είναι θεωρητικά πιθανό ότι το OsPMT θα μπορούσε επίσης να προσθέσει FA ή pCA στο Araf, δραστηριότητες με τόσο διαφορετικούς αποδέκτες δεν έχουν βρεθεί προηγουμένως για τις πρωτεΐνες BAHD. Η δραστηριότητα OsPMT είναι πιθανώς υπεύθυνη για το σχηματισμό εστερικών δεσμών μεταξύ pCA και λιγνίνης, ένας δεσμός που είναι επίσης πολύ πιο συνηθισμένος στα χόρτα από ό,τι σε άλλες ομάδες φυτών. Είναι επομένως πιθανό η υποψήφια ομάδα που περιλαμβάνει το OsPMT να είναι υπεύθυνη μόνο για αυτή τη δραστηριότητα, παρά επίσης για τη φερουλοϋλίωση GAX. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, μόνο ένα από τα γονίδια έχει αποδειχθεί ότι έχει αυτή τη δραστηριότητα και άλλα εκφράζονται (αν και σε χαμηλά επίπεδα) σε αμυλούχο ενδοσπέρμιο σίτου που δεν έχει λιγνίνη αλλά έχει φερουλοϋλιωμένο AX (Pellny et al., 2012). υποδηλώνοντας ότι άλλα γονίδια εντός της ομάδας είναι υπεύθυνα για τη φερουλοϋλίωση ξυλάνης. Κατά την προετοιμασία αυτού του άρθρου, δημοσιεύτηκε ισχυρή υποστήριξη για αυτήν τη θεωρία όπου ένα άλλο γονίδιο BAHD σε αυτήν την ομάδα υπερεκφραζόταν στο ρύζι, με αποτέλεσμα αυξημένο δεσμευμένο pCA με καλές ενδείξεις ότι αυτό συνδέθηκε με εστέρα με GAX, όχι με λιγνίνη (Bartley et al., 2013). Ενώ αυτό το γονίδιο φαίνεται ειδικό για το pCA, φαίνεται πολύ πιθανό ότι μερικά από τα άλλα παρόμοια γονίδια στο clade είναι υπεύθυνα για εστέρες FA που συνδέονται με GAX.

Το Brachypodium distachyon είναι ένα πρότυπο είδος γρασιδιού που έχει μικρό και πλήρως αλληλουχημένο γονιδίωμα, σύντομο κύκλο ζωής και μικρό μέγεθος, καθιστώντας το ιδανικό για τη μελέτη των κυτταρικών τοιχωμάτων χλόης (Vogel et al., 2010). Ως εκ τούτου, προσδιορίσαμε τα περιεχόμενα των δεσμευμένων FA και pCA (κυρίως συνδεδεμένα με GAX και λιγνίνη, αντίστοιχα) σε διάφορους ιστούς και σε διαφορετικά στάδια κατά τη διάρκεια του κύκλου ζωής, και τα συσχετίσαμε με την έκφραση των γονιδίων BAHD που προσδιορίζονται ως υποψήφια για την προσθήκη αυτών. φαινολικά οξέα σε πολυμερή κυτταρικού τοιχώματος (GAX και λιγνίνη).

Αποτελέσματα και συζήτηση

Το Σχήμα 1 δείχνει ένα φυλογενετικό δέντρο των κλάδων της υπεροικογένειας γονιδίων BAHD που έχει προταθεί ότι περιέχουν υποψήφια γονίδια για τη φερουλοϋλίωση του GAX σε κυτταρικά τοιχώματα χόρτου (Mitchell et al., 2007), χωρισμένα σε clades A και B. Clade B γονίδια δεν εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό ή δεν συνεκφράζονται με τα γονίδια της οδού ξυλάνης και δεν έχουν σαφείς ορθολογίες μεταξύ του ρυζιού και του Brachypodium. Τα πιο εκφρασμένα γονίδια κλάδου Α ταυτοποιήθηκαν ως εκ τούτου ως τα ισχυρότερα υποψήφια (Mitchell et al., 2007) για φερουλοϋλίωση AX. Το Clade A περιλαμβάνει επίσης το γονίδιο που στη συνέχεια αποδείχθηκε ότι κωδικοποιεί μια μονολιγνολική τρανσφεράση pCA στο ρύζι, OsPMT (Withers et al., 2012). Δύο γονίδια σίτου, ορθολογικά με τα υποψήφια 1 και 3, εκφράζονται σε αμυλούχο ενδοσπέρμιο σίτου, το οποίο δεν περιέχει λιγνίνη στα κυτταρικά τοιχώματα (Pellny et al., 2012). Ένα κατασκεύασμα RNAi το οποίο ταυτόχρονα κατέστειλε την έκφραση των υποψηφίων ρυζιού 1, 4, 8 και 10 (στην ονοματολογία μας) οδήγησε σε μείωση του FA κυτταρικού τοιχώματος κατά 19% στο διαγονιδιακό ρύζι (Piston et al., 2010). Μια πιθανή ερμηνεία είναι επομένως ότι η δραστικότητα pCA τρανσφεράσης μονολιγνόλης περιορίζεται στην υπο-κλάση που περιέχει OsPMT που περιλαμβάνει τα υποψήφια 7 και 9 και το μόνο γονίδιο Arabidopsis, και οι άλλοι υποψήφιοι στην κλάση Α μπορεί να εμπλέκονται στη φερουλοϋλίωση GAX. Αυτό υποστηρίζεται από την πρόσφατη απόδειξη ότι η υπερέκφραση OsAt10 (συμπτωματικά επίσης υποψήφιος 10 στην ονοματολογία μας) οδήγησε σε αυξημένο pCA σχεδόν σίγουρα συνδεδεμένο με εστέρα με το GAX (Bartley et al., 2013). Αυτή η εστερική σύνδεση είναι λιγότερο συχνή από την FA στους περισσότερους ιστούς και απουσιάζει στο αμυλούχο ενδοσπέρμιο σίτου. Από όλα τα στοιχεία,

ΣΧΗΜΑ 1. Φυλογενετικό δέντρο κλάδων εντός της υπεροικογένειας γονιδίων BAHD για γονίδια ρυζιού και Brachypodium, τα οποία ταυτοποιήθηκαν ότι περιέχουν πιθανούς υποψήφιους για φερουλοϋλίωση ξυλάνης (Mitchell et al., 2007). Οι αριθμοί είναι αυθαίρετοι υποψήφιοι αριθμοί που βασίζονται σε γονίδια ρυζιού. όπου δύο παράλογα γονίδια Brachypodium ταιριάζουν με ένα γονίδιο ρυζιού, δίνεται ο ίδιος αριθμός αλλά με το “p1” ή το “p2” προσαρτημένο στο όνομα. Τα γονίδια εντός του κλάδου Α εκφράζονται γενικά πιο έντονα από εκείνα του κλάδου Β. Τα γονίδια που εντοπίστηκαν πρόσφατα μονολιγνόλη pCA τρανσφεράση OsPMT (Withers et al., 2012) και OsAt10 (που εμπλέκονται στην προσθήκη pCA στην ξυλάνη· Bartley et al., 2013) ενδείκνυνται .

Η έκφραση των υποψηφίων γονιδίων και οι ποσότητες των δεσμευμένων FA και pCA προσδιορίστηκαν σε ιστούς αναπτυσσόμενων φυτών B. distachyon όπως φαίνεται στο Σχήμα 2.

ΕΙΚΟΝΑ 2. Στάδια ανάπτυξης βραχυπόδιου. (Α) Πρώιμη βλαστική φάση (EVP), ράβδος = 1cm. (Β) όψιμη βλαστική φάση (LVP), ράβδος = 2 cm; (Γ) μεταβατική φάση (TP), ράβδος = 2 cm; (Δ) αναπαραγωγική φάση (RP), ράβδος = 3 cm; (Ε) προχωρημένη φάση (AP), ράβδος = 2cm.

Η αφθονία μεταγραφής των γονιδίων BAHD (που συμβολίζονται με τους υποψήφιους αριθμούς που φαίνονται στο σχήμα 1), προσδιορίστηκαν με ποσοτική RT-PCR σε πραγματικό χρόνο (qRT-PCR) και οι τιμές εμφανίζονται για τα διαφορετικά γονίδια, ιστούς και αναπτυξιακά στάδια σε Σχήμα 3. Οι αποτελεσματικότητες εκκινητών ήταν συγκρίσιμες για τα διαφορετικά γονίδια (Πίνακας 2), επομένως οι διαφορές στις αφθονίες που προσδιορίζονται για τα γονίδια θα πρέπει να αντικατοπτρίζουν πραγματικές διαφορές στην αφθονία μεταγραφής. Σε αυτή τη βάση, μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι τα υποψήφια γονίδια BAHD που εκφράζονται πιο έντονα σε δείγματα ιστών πάνω από το έδαφος από τη βλαστική φάση είναι, κατά φθίνουσα σειρά αφθονίας, 5, 9, 1, ενώ στις ρίζες είναι 1, 9 Σε μεταγενέστερα στάδια της αναπαραγωγικής ανάπτυξης, είναι 9, 7, 5 και 2p2, και στην ακίδα στο προχωρημένο στάδιο 7, 10, 5 (Εικόνα 3). Επομένως, Τα γονίδια BAHD από το clade A εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό σε όλους τους ιστούς που αναλύθηκαν. Με βάση τη φυλογενετική σχέση με το OsPMT (Εικόνα 1) και την υπόθεση ότι οι BdBAHD 9 και 7 είναι υπεύθυνοι για την προσθήκη κουμαρυλεστέρων στη λιγνίνη (δηλαδή, δραστηριότητα PMT) και οι άλλοι υπεύθυνοι για τη φερουλοϋλίωση ξυλάνης (με εξαίρεση το 10 που είναι πιο πιθανό υπεύθυνο για τους κουμαρυλεστέρες στην ξυλάνη), μπορεί να σημειωθεί ότι τουλάχιστον ένα γονίδιο με κάθε λειτουργία εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό σε κάθε ιστό που αναλύθηκε, με τα γονίδια με δραστηριότητα PMT να είναι σχετικά πιο εκφρασμένα από άλλα υποψήφια γονίδια BAHD σε τη φάση της αναπαραγωγικής ανάπτυξης.

ΣΧΗΜΑ 3. Η αφθονία μεταγραφής των υποψηφίων γονιδίων BAHD σε αναπτυσσόμενους ιστούς Brachypodium εκτιμάται με qRT-PCR. Οι ράβδοι σφάλματος είναι ±SE από τρία βιολογικά αντίγραφα. Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης έδειξε ότι η επίδραση ιστού/σταδίου στην αφθονία μεταγραφής ήταν σημαντική σε πιθανότητα Flt;0,001 για κάθε γονίδιο εκτός από το BAHD2p1, όπου ήταν σημαντική σε πιθανότητα F = 0,002.

Ο προσδιορισμός των ποσοτήτων των δεσμευμένων φαινολικών οξέων σε δείγματα φυτών είναι ένα μέτρο των ποσοτήτων που συνδέονται ομοιοπολικά με το κλάσμα του κυτταρικού τοιχώματος. Τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιούν μέτρια αλκαλική επεξεργασία απελευθερώνουν μόνο τα συνδεδεμένα με εστέρα φαινολικά από τα κυτταρικά τοιχώματα, τα οποία στη συνέχεια διαχωρίζονται και ποσοτικοποιούνται με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC). Με διαφορά τα πιο άφθονα δεσμευμένα φαινολικά οξέα είναι τα FA και pCA. Το FA θεωρείται ότι συνδέεται αποκλειστικά με το GAX με εστερικούς δεσμούς στα τοιχώματα των κυττάρων χόρτου, ενώ το pCA είναι κυρίως συνδεδεμένο με εστέρα με τη λιγνίνη, με πολύ μικρότερη ποσότητα εστερικά συνδεδεμένη με το GAX. Το FA, σε αντίθεση με το pCA, μπορεί να συζευχθεί οξειδωτικά στο φυτό για να σχηματίσει διμερή ή ολιγομερή υψηλότερης τάξης. Οι ποσότητες του δεσμευμένου μονομερούς FA, των κύριων διμερών FA και του δεσμευμένου pCA φαίνονται για διαφορετικούς ιστούς στο Σχήμα 4. Η ποσότητα του pCA αντικατοπτρίζει κυρίως την ποσότητα αυτού του φαινολικού οξέος που συνδέεται με εστέρα με τη λιγνίνη, και αυτό το κλάσμα έχει βρεθεί ότι συσχετίζεται σε μεγάλο βαθμό με τον βαθμό λιγνίωσης στα χόρτα (Grabber et al., 2004). Οι τιμές που εμφανίζονται είναι επομένως συνεπείς με την αυξημένη λιγνίωση κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής φάσης, σε σχέση με τη φερουλοϋλίωση GAX, η οποία εμφανίζεται τόσο στα πρωτογενή όσο και στα δευτερεύοντα κυτταρικά τοιχώματα χόρτου. Οι απόλυτες ποσότητες FA και pCA σε νεαρούς βλαστούς (πρώιμη βλαστική φάση, EVP) που προσδιορίζονται εδώ είναι επίσης συγκρίσιμες με εκείνες που προσδιορίζονται για τα σπορόφυτα στις 8 ημέρες μετά τη βλάστηση (DAG) όπου η FA και η pCA βρέθηκαν να είναι ~400 και ~200μgg Οι τιμές που εμφανίζονται είναι επομένως συνεπείς με την αυξημένη λιγνίωση κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής φάσης, σε σχέση με τη φερουλοϋλίωση GAX, η οποία εμφανίζεται τόσο στα πρωτογενή όσο και στα δευτερεύοντα κυτταρικά τοιχώματα χόρτου. Οι απόλυτες ποσότητες FA και pCA σε νεαρούς βλαστούς (πρώιμη βλαστική φάση, EVP) που προσδιορίζονται εδώ είναι επίσης συγκρίσιμες με εκείνες που προσδιορίζονται για τα σπορόφυτα στις 8 ημέρες μετά τη βλάστηση (DAG) όπου η FA και η pCA βρέθηκαν να είναι ~400 και ~200μgg Οι τιμές που εμφανίζονται είναι επομένως συνεπείς με την αυξημένη λιγνίωση κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής φάσης, σε σχέση με τη φερουλοϋλίωση GAX, η οποία εμφανίζεται τόσο στα πρωτογενή όσο και στα δευτερεύοντα κυτταρικά τοιχώματα χόρτου. Οι απόλυτες ποσότητες FA και pCA σε νεαρούς βλαστούς (πρώιμη βλαστική φάση, EVP) που προσδιορίζονται εδώ είναι επίσης συγκρίσιμες με εκείνες που προσδιορίζονται για τα σπορόφυτα στις 8 ημέρες μετά τη βλάστηση (DAG) όπου η FA και η pCA βρέθηκαν να είναι ~400 και ~200μgg^-1 , αντίστοιχα (Christensen et al., 2010) και με πρόσφατη ανάλυση περισσότερων ιστών και σταδίων (Rancour et al., 2012). Ένα συνεπές χαρακτηριστικό των δεδομένων που παρουσιάζονται εδώ (Εικόνα 4) και από τους Rancor et al. (2012) είναι ότι η αναλογία pCA:FA είναι υψηλότερη στους μίσχους σε σύγκριση με τα φύλλα, κάτι που συνάδει με τη συγκριτικά μεγαλύτερη λιγνίωση στους μίσχους.

ΣΧΗΜΑ 4. Περιεκτικότητα δεσμευμένου υδροξυκινναμικού οξέος από αναπτυσσόμενους ιστούς Brachypodium που υπολογίζεται με HPLC. Τα δείγματα ήταν πρώιμα φυτικά φυτά (EVP), όψιμα φυτικά φυτά (LVP), φύλλα μεταβατικής φάσης (TPL), μεσογονάβια μεταβατικής φάσης (TPI4, TPI3), ρίζες μεταβατικής φάσης (TPR), φύλλα αναπαραγωγικής φάσης (RPL), μεσογονάβια αναπαραγωγικής φάσης ( RPI4, RPI3, RPI2), ακίδα προχωρημένης φάσης (APS), φύλλα προχωρημένης φάσης (APL) και μεσογονάτια προηγμένης φάσης (API4, API3, API2). Τα διμερή FA είναι το άθροισμα των τεσσάρων κύριων διμερών που περιγράφονται στην Ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι». Οι ράβδοι σφάλματος είναι ±SE από τρία βιολογικά αντίγραφα. Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης έδειξε ότι η επίδραση του ιστού/σταδίου τόσο στο συνολικό περιεχόμενο FA όσο και στο pCA ήταν σημαντική με πιθανότητα Flt;0,001.

Η έκφραση των υποψηφίων BAHD τόσο από την υπο-κλάση PMT όσο και από μη-ΡΜΤ βρέθηκε σε κάθε ιστό που εξετάστηκε (Εικόνα 3), όπως και σημαντικές ποσότητες δεσμευμένων FA και pCA (Εικόνα 4). Δεν αναμένονται απλές συσχετίσεις μεταξύ της αφθονίας των μεταγραφών που κωδικοποιούν ένζυμα σε μια βιοσυνθετική οδό και της ποσότητας του τελικού προϊόντος από αυτήν την οδό. Η αφθονία μεταγραφής μετρά τη δυνατότητα για σύνθεση ενζύμου μόνο σε ένα μόνο χρονικό σημείο, ενώ η συσσώρευση τελικού προϊόντος λαμβάνει χώρα σε μια αναπτυξιακή διαδικασία και μπορεί να περιοριστεί από τη διαθεσιμότητα του υποστρώματος καθώς και από τη δραστηριότητα ενζύμου, η οποία με τη σειρά της εξαρτάται από την ενεργοποίηση του ενζύμου καθώς και από την ποσότητα του ενζύμου. Ωστόσο, οι ιστοί που τείνουν να έχουν περισσότερο δεσμευμένο FA σε σύγκριση με το συνολικό δεσμευμένο pCA, μπορεί επίσης να αναμένεται να έχει μεγαλύτερη έκφραση των υποψηφίων BAHD στην υποκατηγορία μη PMT σε σχέση με αυτούς στην υποκατηγορία PMT. Βρήκαμε ότι αυτό συμβαίνει σε γενικές γραμμές, με βλαστούς κατά τη διάρκεια της βλαστικής φάσης και φύλλα σε μεταγενέστερες φάσεις, που έχουν υψηλή δεσμευμένη ολική περιεκτικότητα σε FA top pCA (λόγω μικρότερης λιγνίωσης), έχοντας επίσης μεγαλύτερες αναλογίες έκφρασης μη PMT προς PMT από τα μεσογονάτια. ρίζες και ακίδα (Εικόνα 5).

ΣΧΗΜΑ 5. Αναλογίες έκφρασης μη-PMT BAHD προς PMT BAHD και δεσμευμένου FA προς pCA. Ο λόγος έκφρασης είναι το άθροισμα των τιμών για τα γονίδια 1–5 και 8 (non-PMT) σε σχέση με το άθροισμα των τιμών για τα γονίδια 7 και 9 (PMT). Ο λόγος FA προς pCA είναι το άθροισμα του μονομερούς FA και των διμερών σε σχέση με το pCA. Οι αναλογίες που εμφανίζονται υπολογίζονται κατά μέσο όρο σε σχέση με EVP, LVP για βλαστούς, TPL, RPL για φύλλα, TPI4, RPI4, RPI3, RPI2 για μεσογονάτια. Η ρίζα είναι TPR και η ακίδα είναι APS.

Έχουμε εντοπίσει προηγουμένως συνέκφραση μεταξύ υποψηφίων BAHD και γονιδίων σύνθεσης ξυλάνης, συμβατή με έναν ρόλο στη φερουλοϋλίωση GAX (Mitchell et al., 2007· Shewry et al., 2011), αλλά δεδομένων των νέων ευρημάτων σε αυτά τα υποψήφια γονίδια (Withers et al. al., 2012· Bartley et al., 2013), αποφασίσαμε να το επανεξετάσουμε. Οι δημόσιοι πόροι δεν είναι ακόμη εκτενείς για την έκφραση του γονιδίου Brachypodium, αλλά χρησιμοποιώντας το εργαλείο RiceFREND που χρησιμοποιεί ένα ευρύ φάσμα πειραμάτων μεταγραφής ρυζιού (Sato et al., 2013), εξετάσαμε τη συνέκφραση για τα γονίδια BAHD ρυζιού με γονίδια ρυζιού που πιθανώς εμπλέκονται σε σύνθεση ξυλάνης (Πίνακας 1). Σχεδόν όλα τα γονίδια κλάδος Α είχαν συνθετικά γονίδια ξυλάνης στο κορυφαίο 1% των γονιδίων που ταξινομήθηκαν βάσει συσχέτισης έκφρασης, αλλά κανένα από τα γονίδια κλάδος Β δεν είχε. BAHD1, 5, και 8 έδειξαν ιδιαίτερα στενή συνέκφραση με γονίδια που εμπλέκονται στη σύνθεση UDP-Xyl και UDP-Ara και γονίδια GT61, ενώ το OsPMT και παρόμοια γονίδια (BAHD7 και BAHD9) είχαν λιγότερα στενά συνεκφραζόμενα γονίδια. Εάν αυτά τα γονίδια στην υπο-κλάση PMT είναι υπεύθυνα για την προσθήκη pCA στη λιγνίνη, τότε μπορεί να αναμένεται κάποια συνέκφραση με οποιαδήποτε γονίδια που εμπλέκονται στη σύνθεση ξυλάνης του δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος.

ΠΙΝΑΚΑΣ 1. Συνέκφραση υποψηφίων γονιδίων BAHD στο ρύζι με γονίδια που πιθανώς εμπλέκονται στη σύνθεση ξυλάνης.

συμπέρασμα

Τα γονίδια που προσδιορίζονται ως υποψήφια για εμπλοκή στη φερουλοϋλίωση του GAX (Mitchell et al., 2007) εκφράζονται σε κάθε ιστό και σε κάθε αναπτυξιακό στάδιο στο μοντέλο Grass Brachypodium όπως αναμένεται για μια διαδικασία που απαιτείται για κάθε πρωτογενές και δευτερεύον κυτταρικό τοίχωμα στο φυτό. Οι σχετικές ποσότητες pCA και FA σε αυτούς τους διαφορετικούς ιστούς φαίνονται συμβατές με την έκφραση των υποψηφίων γονιδίων BAHD, όπου αυτά χωρίζονται σε εκείνα που θεωρούνται υπεύθυνα για pCA που συνδέεται με λιγνίνη (PMT) και FA που συνδέεται με ξυλάνη (non-PMT). Τα στοιχεία που παρουσιάζονται εδώ δεν αποδεικνύουν τη λειτουργία. Για αυτό απαιτούνται περισσότερες μελέτες με στοχευμένη τροποποίηση των γονιδίων σε είδη χόρτου (όπως στο Bartley et al., 2013) και in vitro χαρακτηρισμό καθαρών πρωτεϊνών (όπως στο Withers et al., 2012).

Υλικά και μέθοδοι

Ανάπτυξη φυτού

Τα φυτά Brachypodium Bd21 αναπτύχθηκαν σε τυπικές συνθήκες γυάλινου σπιτιού στους 25°C. Ολόκληρο το εναέριο φυτό συγκομίστηκε για την EVP (7 DAG) και την όψιμη βλαστική φάση (LVP, 12 DAG). Τα φυτά εαρινοποιήθηκαν στους 4°C για 2 εβδομάδες κατά τη διάρκεια της EVP. Οι αναφορές σε «DAG» δεν περιλαμβάνουν αυτήν την περίοδο. Στη μεταβατική (20 DAG) και στην αναπαραγωγική φάση (30 DAG), τα φυτά διαχωρίστηκαν σε ιστούς φύλλων και μεσογονάτους, όπου το μεσογονάτιο 1 είναι το παλαιότερο και το 4 το ανώτερο και νεότερο. Στη μεταβατική φάση συγκομίστηκαν και ρίζες. Τα στάχυα, δηλαδή οι αναπτυσσόμενοι σπόροι με τους περιβάλλοντες μητρικούς ιστούς, συγκομίστηκαν στην προχωρημένη φάση (50 DAG). Το υλικό καταψύχθηκε αμέσως σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκε στους -80°C.

Φυλογενετική Ανάλυση

Οι πρωτεϊνικές αλληλουχίες για ολόκληρη την υπεροικογένεια BAHD ταυτοποιήθηκαν ως όλες οι αλληλουχίες ρυζιού, Arabidopsis και Brachypodium από το Phytozome ¹ που περιέχει την περιοχή PFAM PF02458. Δημιουργήθηκε ένα αρχικό δέντρο και όλες οι αλληλουχίες που περιέχονται στην υποψήφια ομάδα ταυτοποιήθηκαν στους Mitchell et al. (2007) ευθυγραμμίστηκαν με τον αλγόριθμο MUSCLE (Edgar, 2004). Οι στήλες με διάκενα αφαιρέθηκαν, ακολουθούμενη από ανάλυση φυλογένεσης ευθυγραμμισμένων αλληλουχιών στο πακέτο PhyML (Guindon et al., 2005) χρησιμοποιώντας το μοντέλο Whelan and Goldman (2001). Μια αρχική εκτέλεση βελτιστοποίησε τις παραμέτρους γάμμα και αμετάβλητης αναλογίας. Αυτά στη συνέχεια διατηρήθηκαν σταθερά για 100 εκτελέσεις για μη παραμετρική ανάλυση bootstrap και παρουσιάζεται το δέντρο μέγιστης πιθανότητας.

Προσδιορισμός της αφθονίας μεταγραφής

Το RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας μια μέθοδο βρωμιούχου κετυλοτριμεθυλαμμωνίου (CTAB) ακολουθώντας τους Chang et al. (1993). Πραγματοποιήθηκε ποσοτική PCR όπως στους Pellny et al. (2008) σε ένα σύστημα PCR σε πραγματικό χρόνο Applied Biosystems 7500 ² χρησιμοποιώντας το πράσινο κιτ JumpStart SYBR (Sigma-Aldrich ³) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η έκφραση των γονιδίων που μας ενδιαφέρουν κανονικοποιήθηκε με δύο ενδογενείς μάρτυρες το ένζυμο σύζευξης ουβικιτίνης 18 (UBC18) και την ηλεκτρική αφυδρογονάση (SDH). Δοκιμάστηκαν επίσης υποτιθέμενα γονίδια διατήρησης της γλυκεραλδεΰδης-3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH), αποκαρβοξυλάσης S-αδενοσυλομεθειονίνης (SAMDC) και πεπτιδικής αποφορμυλάσης 2 (PDF2), αλλά βρέθηκαν λιγότερο σταθερά στους διαφορετικούς ιστούς και χρονικά σημεία. Οι υπολογισμοί της έκφρασης πραγματοποιήθηκαν όπως προτείνεται από τους Rieu και Powers (2009). Οι επιμέρους αποτελεσματικότητες ενίσχυσης καθορίστηκαν με το LinRegPCR χρησιμοποιώντας ένα παράθυρο γραμμικότητας και υπολογίστηκαν οι σχετικές ποσότητες (RQs) για τα γονίδια στόχους. Αυτό κανονικοποιήθηκε με τον γεωμετρικό μέσο όρο των RQ των γονιδίων ελέγχου. Οι χρησιμοποιούμενοι εκκινητές και η μέση απόδοση των ζευγών παρατίθενται στον Πίνακα 2.

ΠΙΝΑΚΑΣ 2. Εκκινητές PCR.

Προσδιορισμός Δεσμευμένης Φαινολικής Περιεκτικότητας

Οι δεσμευμένες στο κυτταρικό τοίχωμα φαινολικές ουσίες απελευθερώθηκαν με αλκαλική υδρόλυση αδιάλυτων υπολειμμάτων αλκοόλης (AIRs) από δείγματα (20 mg) λυοφιλοποιημένου, αλεσμένου ιστού και εκχύλιση σε οξικό αιθυλεστέρα όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Pellny et al., 2012). 3,5-Διχλωρο-4-υδροξυβενζοϊκό οξύ (20μL σε 1,5mgmL ^-1) προστέθηκε στο AIR όλων των δειγμάτων, πριν από την αλκαλική υδρόλυση, ως εσωτερικό πρότυπο. Τα δείγματα διαλύθηκαν σε 1 mL 50% μεθανόλη: 2% οξικό οξύ (v:v) και δεσμεύτηκαν φαινολικά οξέα από 40 μL εκχυλίσματος που διαχωρίστηκαν με HPLC σε υγρό χρωματογράφο υψηλής απόδοσης Shimadzu Prominence όπως περιγράφεται από Waldron et al. (1996) αλλά χρησιμοποιώντας ένα δυαδικό σύστημα αντλίας κλίσης. Η ποσοτικοποίηση του FA και του pCA έγινε με ενσωμάτωση περιοχών κορυφής στα 280 nm με αναφορά σε βαθμονομήσεις που έγιναν χρησιμοποιώντας γνωστές ποσότητες καθαρών ενώσεων. Οι κορυφές των κύριων διμερών FA εντοπίστηκαν με σύγκριση των χρόνων κατακράτησης με καθαρά πρότυπα που παρέχονται ευγενικά από τον καθηγητή John Ralph (Lu et al., 2012; 5-5, 8-O-4, 8-5-benzofuran) ή με σύγκριση των φάσμα με αυτό στο Waldron et al. (1996) (8-5). Η ποσοτικοποίηση του διμερούς επιτεύχθηκε σε σχέση με το μονομερές FA χρησιμοποιώντας περιοχές αυτών των κορυφών και τους παράγοντες απόκρισης για τα διμερή και το μονομερές FA στο Waldron et al. (1996). Όλα τα δείγματα εκχυλίστηκαν και αναλύθηκαν εις τριπλούν.

Δήλωση Σύγκρουσης Συμφερόντων

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη απουσία εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.

Ευχαριστίες

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από το Ερευνητικό Συμβούλιο Βιοτεχνολογίας και Βιολογικών Επιστημών του Ηνωμένου Βασιλείου (BBSRC), εν μέρει από μια επιχορήγηση του Προγράμματος Βιομάζας του BBSRC Sustainable Bioenergy Center (BSBEC) και ευχαριστούμε την PI, Dr Angela Karp (Rothamsted), για την υποστήριξή της. Η υποστήριξη του Hugo BC Molinari από το BBSRC και η χρηματοδότηση από το Υπουργείο Περιβάλλοντος, Τροφίμων και Αγροτικών Υποθέσεων του Ηνωμένου Βασιλείου στο πλαίσιο ενός προγράμματος συνεργασίας BSBEC-EMBRAPA αναγνωρίζεται με ευγνωμοσύνη. Η χρηματοδότηση για το Till K. Pellny προήλθε από επιχορήγηση του BBSRC στους Rowan AC Mitchell και Peter R. Shewry (BB/F014295/1). Η Rothamsted Research λαμβάνει υποστήριξη με επιχορήγηση από το BBSRC.

1. ^ www.phytozome.org
2. ^ www.appliedbiosystems.com
3. ^ www.sigmaaldrich.com

γλυκουρονοαραβινοξυλάνη, υδροξυκινναμωμικό οξύ, οικογένεια γονιδίων BAHD, περιοχή PF02458, δεσμευμένο φαινολικό