Φωτογραφίες από την υψηλή κουζίνα του Νότου

Μαγειρεύοντας με τη Φωτιά

Η Emily Railsback σερβίρει κλασικά κοκτέιλ στο Patterson House , στο Νάσβιλ.

Δοκιμάστε μια νέα γεύση παγωτού

Στο Knoxville του Tennessee** **Cruze Dairy Farm λάνσαρε μια σειρά γεύσεων παγωτού Cruze Farm Girl, συμπεριλαμβανομένου του μελιού λεβάντας.

Περισσότερα για τη νέα υψηλή κουζίνα του Νότου

Bowens Island Restaurant, Τσάρλεστον, Νότια Καρολίνα

Church St., Charleston, SC

Harvest Swoon

Η γενναιοδωρία του Νότου έχει τώρα τους σεφ που της αξίζει—αυτές οι μπουκιές κατευθύνονται στην κουζίνα του Blackberry Farm , ενός γκουρμέ ναού του Τενεσί (και στο κτήμα Relais amp; Châteaux).

Τα άγρια ​​χόρτα εμπλουτίζουν το γάλα στο Knoxville’s Cruze Dairy Farm — ιδιαίτερα διάσημο για το βουτυρόγαλά του.

Southern Comforts

Τηγανητά γλυκά με φασόλια άνηθου, ασκαλώνια, χόρτα μουστάρδας και πουρέ καρότου στο Blackberry Farm .

Το μπαρ στο εστιατόριο του Charleston’s FIG (Food Is Good).

Τενεσί Τάρταρ

Μοσχαρίσιο ταρτάρ με γαρνιτούρες όπως σερβίρεται στο εστιατόριο Catbird Seat στο Νάσβιλ—ίσως χρειαστεί να περιμένετε έναν ολόκληρο μήνα για να κάνετε κράτηση στον πάγκο είκοσι θέσεων.

Πού είναι το Χοιρινό;

Ξεχάστε τα υπερχειλισμένα πιάτα—στη φάρμα Blackberry , η καλλιτεχνία εμφανίζεται σε πιάτα με προσεκτική σύνθεση, όπως ριγέ μπάσο με μάραθο, με χρυσό ρύζι Carolina με άρωμα σαφράν, γαρίδες, μύδια και μύδια Clammer Dave. Το δείπνο στο αγρόκτημα (και στο πανδοχείο) σερβίρεται σε έναν αχυρώνα άμις μεγέθους καθεδρικού ναού.

Dixie Delights

Κάνουν παγωτό διαφορετικά στον Νότο: μια παλέτα γεύσεων σερβίρεται σε απανθρακωμένη βελανιδιά στο Nashville’s Catbird Seat , όπου υπάρχει ένα μενού γευσιγνωσίας 7 έως έντεκα πιάτων αξίας $100.

Λαχταριστό κλισέ

Εντάξει, ακούγεται σαν αστείο σχετικά με τις προκαταλήψεις για τα νότια φαγητά – οι φλούδες κοτόπουλου στο Catbird Seat σερβίρονται με ζυμαρικά – όπως ο πουρές Wonder Bread – αλλά δεν θα ακούσετε κανένα παράπονο.

Καβούρι με μαλακό κέλυφος στο The Admiral , στο West Asheville, Βόρεια Καρολίνα.

Το Green Acres είναι το μέρος για μένα!

Θα μπορούσε να είναι μια νυσταγμένη γραφική σκηνή του Νότου—αλλά για μια ιδέα, οι προσεκτικά διαμορφωμένοι κήποι λαχανικών και βοτάνων στο Blackberry Farm , ο φάρος μιας γαστρονομικής επανάστασης.

Το Cruze Dairy Farm , στο Knoxville, παράγει τρυφερό βουτυρόγαλα (η κόρη του ιδιοκτήτη μερικές φορές κάνει μπάνιο σε αυτό!). Οι αγελάδες, στις οποίες δεν χορηγούνται ποτέ ορμόνες, βρίσκονται σε βοσκότοπους 365 ημέρες το χρόνο.

Το φαγητό στο Blackberry Farm προέρχεται κυρίως είτε από το ίδιο το αγρόκτημα είτε από κοντινά γαλακτοκομεία και ποτάμια. Η πέστροφα της Βόρειας Καρολίνας με καπνιστό κονσομέ βουτυρόγαλου είναι μια απόλαυση για το φαγητό.

Το Bowens Island Restaurant σερβίρει βασικό φαγητό από την Τσάρλεστον: στρείδια στον ατμό, τηγανητά θαλασσινά και κουτάβια. (Το εστιατόριο άνοιξε ξανά μετά από φωτιά.)

Το Robert’s Western World , στο Νάσβιλ, διαθέτει παραδοσιακή κάντρι μουσική και ροκαμπίλι. Ο John Shepherd παίζει τακτικά αγαπημένα honky-tonk από τον Hank Williams.

Ο αχυρώνας στο Blackberry Farm δεν είναι βουστάσιο: Στο μαγευτικό περιβάλλον σερβίρονται εξωφρενικές σπεσιαλιτέ με πολλά πιάτα από φάρμα σε τραπέζι με κρασιά από το κελάρι κρασιού 8.000 τετραγωνικών ποδιών.

Το Catbird Seat , στο Νάσβιλ, σερβίρει γκουρμέ νότιο φαγητό, όπως αυτή η χοιρινή κοιλιά με τροφοδοτημένα λουλούδια.

Ο σεφ του FIG , Mike Lata, προτιμά να κρατά τα πράγματα απλά στο διάσημο εστιατόριο του Charleston, σερβίροντας τοπικά προϊόντα με βιώσιμη καλλιέργεια, καθώς και αυτό το πιάτο με φρέσκα ζυμαρικά και τοπικές αχιβάδες.

Το Charleston’s Hominy Grill φτιάχνει εκδόσεις με υψηλή περιεκτικότητα σε φαλουτίνη από σπεσιαλιτέ του Νότου, όπως τηγανητές πράσινες ντομάτες και γαρίδες και γκριλ – σε ένα σπιτικό περιβάλλον.

Ο Jeff Ross, ο διευθυντής κήπου στο Blackberry Farm , παραδίδει μαθήματα μαγειρικής σε εξωτερικούς χώρους με πιάτα όπως σοτέ αρκτικό κάρβουνο.

Το Big Daddy Sampler στο Martin’s Bar-B-Que Joint , στο Nolensville του Τενεσί, περιλαμβάνει παϊδάκια, χοιρινό, ψαρονέφρι, μισό κοτόπουλο, έξι φτερούγες και —αν έχετε ακόμα χώρο— τρεις πίνες συνοδευτικά.

Περισσότερα από το Condé Nast Traveler

The Orphan Crop Crassocephalum crepidioides Συσσωρεύει το αλκαλοειδές πυρρολιζιδίνης Jacobine ως απόκριση στην πείνα από άζωτο

• ¹ Βιοτεχνολογία Κηπευτικών Καλλιεργειών, TUM School of Life Sciences, Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Freising, Γερμανία
• ² Τμήμα Φυσιολογίας Φυτών και Πολλαπλασιασμού Woody, Ινστιτούτο Συστημάτων Παραγωγής Οπωροκηπευτικών, Πανεπιστήμιο Gottfried Wilhelm Leibniz Hannover, Ανόβερο, Γερμανία

Το Crassocephalum crepidioides είναι μια αφρικανική ορφανή καλλιέργεια που χρησιμοποιείται ως φυλλώδες λαχανικό και φαρμακευτικό φυτό. Αν και είναι υψηλής περιφερειακής σημασίας στην Υποσαχάρια Αφρική, το φυτό εξακολουθεί να συλλέγεται κυρίως από τη φύση και ως εκ τούτου καταβάλλονται προσπάθειες για την προώθηση της εξημέρωσής του. Ωστόσο, εκτός από τις ευεργετικές ιδιότητες, υπήρχαν πρώτα στοιχεία ότι το C. crepidioides μπορεί να συσσωρεύσει το εξαιρετικά τοξικό αλκαλοειδές πυρρολιζιδίνης (PA) jacobine και εδώ διερευνήθηκε πώς ελέγχεται η παραγωγή jacobine. Χρησιμοποιώντας οικότυπους από την Αφρική και την Ασία που χαρακτηρίστηκαν ως προς τα προφίλ PA τους, αποδεικνύεται ότι το τετραπλοειδές C. crepidioides σχηματίζει jacobine, μια ικανότητα που φαίνεται να στερείται διπλοειδούς στενού συγγενή του Crassocephalum rubens. Παρέχονται αποδείξεις ότι η ανεπάρκεια αζώτου (Ν) αυξάνει έντονα τη ζακοβίνη στα φύλλα του C. crepidioides, ότι αυτή η ικανότητα εξαρτάται περισσότερο από το βλαστό παρά από το ριζικό σύστημα και ότι η δραστηριότητα της συνθάσης της ομοσπερμιδίνης (HSS) δεν είναι περιοριστική για αυτή την αντίδραση. Ένας χαρακτηρισμός της αναπαράστασης και της μεταγραφής του γονιδίου HSS έδειξε ότι τα C. crepidioides και C. rubens διαθέτουν δύο λειτουργικές εκδοχές, η μία από τις οποίες διατηρείται, ότι το μεταγράφημα HSS είναι κυρίως παρόν στις ρίζες και ότι η αφθονία του δεν ελέγχεται από ανεπάρκεια Ν. Συνοπτικά, αυτή η εργασία βελτιώνει την κατανόησή μας για το πώς τα περιβαλλοντικά στοιχεία επηρεάζουν τη βιοσύνθεση της PA στα φυτά και παρέχει τη βάση για την ανάπτυξη ποικιλιών C. crepidioides χωρίς PA, οι οποίες θα βοηθήσουν στην εξημέρωσή του και στην ασφαλή χρήση του. Ένας χαρακτηρισμός της αναπαράστασης και της μεταγραφής του γονιδίου HSS έδειξε ότι τα C. crepidioides και C. rubens διαθέτουν δύο λειτουργικές εκδοχές, η μία από τις οποίες διατηρείται, ότι το μεταγράφημα HSS είναι κυρίως παρόν στις ρίζες και ότι η αφθονία του δεν ελέγχεται από ανεπάρκεια Ν. Συνοπτικά, αυτή η εργασία βελτιώνει την κατανόησή μας για το πώς τα περιβαλλοντικά στοιχεία επηρεάζουν τη βιοσύνθεση της PA στα φυτά και παρέχει τη βάση για την ανάπτυξη ποικιλιών C. crepidioides χωρίς PA, οι οποίες θα βοηθήσουν στην εξημέρωσή του και στην ασφαλή χρήση του. Ένας χαρακτηρισμός της αναπαράστασης και της μεταγραφής του γονιδίου HSS έδειξε ότι τα C. crepidioides και C. rubens διαθέτουν δύο λειτουργικές εκδοχές, η μία από τις οποίες διατηρείται, ότι το μεταγράφημα HSS είναι κυρίως παρόν στις ρίζες και ότι η αφθονία του δεν ελέγχεται από ανεπάρκεια Ν. Συνοπτικά, αυτή η εργασία βελτιώνει την κατανόησή μας για το πώς τα περιβαλλοντικά στοιχεία επηρεάζουν τη βιοσύνθεση της PA στα φυτά και παρέχει τη βάση για την ανάπτυξη ποικιλιών C. crepidioides χωρίς PA, οι οποίες θα βοηθήσουν στην εξημέρωσή του και στην ασφαλή χρήση του.

Εισαγωγή

Η διαθεσιμότητα των τροφίμων εξαρτάται μόνο από λίγες καλλιέργειες. Οι εκτιμήσεις δείχνουν ότι σήμερα 15 είδη παρέχουν το 90% της παγκόσμιας τροφής και φυτικής ενέργειας (Gruber, 2017). Ενώ οι κύριες καλλιέργειες καλλιεργούνται ευρέως, η παραγωγικότητά τους εξαρτάται από μεγάλες εισροές πόρων, αφού εκτράφηκαν για απόδοση σε συστήματα καλλιέργειας υψηλών εισροών (Fess et al., 2011). Εκτός από τις κύριες καλλιέργειες, υπάρχουν εκατοντάδες φυτά που έχουν χρησιμεύσει ως πηγές τροφής για αιώνες ή και χιλιετίες, αλλά είναι ήσσονος σημασίας όσον αφορά το παγκόσμιο εμπόριο και την ερευνητική προσοχή που λαμβάνουν (Heywood et al., 2013; Gruber, 2017). Αυτές οι υποχρησιμοποιούμενες ή ορφανές καλλιέργειες μπορούν να προάγουν την καλύτερη διατροφή, ιδιαίτερα σε αναπτυσσόμενες περιοχές του κόσμου, και να βοηθήσουν στη βελτιστοποίηση των πόρων γης καλλιεργώντας εδάφη που είναι οριακά ή ακατάλληλα για μεγάλη φυτική παραγωγή (Pingali, 2012; Jain and Gupta, 2013).

Πολλές ορφανές καλλιέργειες είναι άγρια ​​ή ημί-άγρια ​​είδη με χαρακτηριστικά που μοιάζουν με τις καλλιέργειες για τα οποία δεν υπάρχουν συστήματα προμήθειας σπόρων ούτε έχουν καθιερωθεί προγράμματα καλλιέργειας (FAO, 1999; Jain and Gupta, 2013). Επιπλέον, τα εργαλεία και η μεθοδολογία για την αναπαραγωγή φυτών και τη μοριακή γενετική που θα μπορούσαν να διευκολύνουν τις προσεγγίσεις για ταχύτερη εξημέρωση δεν έχουν αναπτυχθεί ελάχιστα. Για να βελτιωθεί η κατάσταση, ιδρύθηκε το African Orphan Crops Consortium, μια πρωτοβουλία που στοχεύει στη δημιουργία γενετικών πόρων, συμπεριλαμβανομένων ολόκληρων αλληλουχιών γονιδιώματος για 101 παραδοσιακές καλλιέργειες τροφίμων με μεγάλη σημασία για την Αφρική (Hendre et al., 2019; Jamnadass et al., 2020 ). Ο κατάλογος των φυτών περιέχει κυρίως καλλιέργειες οπωροκηπευτικών, μία από τις οποίες είναι το Crassocephalum rubens.

Το Crassocephalum rubens και ο στενός συγγενής του C. crepidioides ανήκουν στην οικογένεια των φυτών Asteraceae (Pelser et al., 2007). Είναι φυλλώδη λαχανικά και φαρμακευτικά φυτά εγγενή στην τροπική Αφρική, αλλά αναπτύσσονται σε τροπικές και υποτροπικές περιοχές του κόσμου. Ανάλογα με την περιοχή υπάρχουν διάφορες ονομασίες που συνήθως αναφέρονται και στα δύο είδη. Στην Αφρική τα κοινά ονόματα είναι γιορουβανικά bologi, ebolo (Νιγηρία) ή gbolo (Μπενίν). Τα αγγλικά ονόματα είναι redflower ragleaf και fireweed. Τα φυτά έχουν ενδιαφέρουσες θρεπτικές και φαρμακευτικές ιδιότητες, καθώς είναι πλούσια σε μέταλλα, αιθέρια έλαια και αντιοξειδωτικά (Adjatin et al., 2013a; Oyebode et al., 2019).

Παρά την αξία τους στη Δυτική και Κεντρική Αφρική, τα είδη Crassocephalum δεν καλλιεργούνται τακτικά, αλλά εξακολουθούν να συλλέγονται κυρίως από την άγρια ​​φύση. Όταν καλλιεργείται και συλλέγεται επανειλημμένα, οι αποδόσεις του C. crepidioides μπορεί να φτάσουν τους 25-27 τόνους/στρέμμα φύλλων και βλαστών ανά έτος (Grubben, 2004). Αυτά τα κέρδη βιομάζας επιτυγχάνονται ακόμη και σε οριακές συνθήκες, στις οποίες το φυτό είναι καλά προσαρμοσμένο, και έτσι γίνονται προσπάθειες για την προώθηση της ευρύτερης καλλιέργειας και κατανάλωσής του (Joshi, 2011· Adjatin et al., 2013b).

Ωστόσο, εκτός από τις ευεργετικές ιδιότητες, υπάρχουν στοιχεία ότι το C. crepidioides μπορεί να συσσωρεύσει το αλκαλοειδές πυρρολιζιδίνης (PA) jacobine (Rozhon et al., 2018). Οι PA είναι ετεροκυκλικές ενώσεις που συντίθενται από φυτά, οι οποίες αποτελούν μέρος του συστήματος χημικής άμυνας κατά των φυτοφάγων (Macel, 2011; Wei et al., 2015). Οι εκτιμήσεις δείχνουν ότι περίπου 6.000 είδη φυτών παγκοσμίως, που αποτελούν το 3% όλων των ανθοφόρων φυτών, παράγουν αυτούς τους δευτερογενείς μεταβολίτες. Συγκεκριμένα, μέλη των Asteraceae, Boraginaceae, Heliotropiaceae, Apocynaceae και μερικά γένη των Orchidaceae είναι παραγωγοί PA (Ober and Hartmann, 2000).

Ενώ τα ίδια τα PA είναι χημικά μη αντιδραστικά, μπορούν να βιοενεργοποιηθούν στον εντερικό σωλήνα και κατά τη διάρκεια της διέλευσης μέσω του ήπατος των θηλαστικών. Αυτό οδηγεί σε πυρρόλες υψηλής αντίδρασης, οι οποίες είναι ηπατοτοξικές και καρκινογόνες (Ruan et al., 2014). Οι φλεβικές αποφράξεις στο ήπαρ και στους πνεύμονες, η μεγαλοκυττάρωση, η αναστολή της κυτταρικής διαίρεσης και η κίρρωση του ήπατος είναι σημάδια τοξικότητας από PA. Γονιδιοτοξικές επιδράσεις έχουν επίσης αναφερθεί, ιδιαίτερα για 1,2-ακόρεστα PA όπως η jacobine (Fu et al., 2002), γι’ αυτό η Ευρωπαϊκή Αρχή για την Ασφάλεια των Τροφίμων εφαρμόζει την προσέγγιση του «Περιθωρίου Έκθεσης» και συνιστά ένα όριο δόσης 0,007 mg PA/kg σωματικού βάρους/ημέρα (Πίνακας EFSA για τους μολυντές στην τροφική αλυσίδα, 2011). Στις βιομηχανικές χώρες, εκτός από την πρόσληψη βοτάνων που περιέχουν PA (όταν υπάρχουν σε τσάι, αφεψήματα βοτάνων,

Αν και η σημασία τους ως μολυντές τροφίμων και ζωοτροφών και για αντιδράσεις άμυνας των φυτών, σχετικά λίγα είναι γνωστά για τη βιοσύνθεση PA. Τα PA παράγονται από ομοσπερμιδίνη, η οποία σχηματίζεται από συνθάση ομοσπερμιδίνης (HSS), μια 4-αμινοβουτυλ-τρανσφεράση πουτρεσκίνης:πουτρεσκίνης που καταλύει την πρώτη αποκλειστική και ουσιαστική αντίδραση στη βιοσύνθεση ΡΑ (Ober and Hartmann, 1999). Στη συνέχεια, η βιοσύνθεση των PA προχωρά με σε μεγάλο βαθμό άγνωστα μέσα, αλλά σίγουρα περιλαμβάνει εστεροποίηση οξέων νεκίνης με βάση νεκίνης. Με βάση τις βάσεις του necine, τα PA ταξινομούνται σε τρεις τύπους: τον τύπο ρετρονεκίνης, τον τύπο της ωτονεσίνης και τον τύπο της πλατυνεκίνης και μπορούν να εμφανιστούν σε ελεύθερες ή ως συνδεδεμένες με Ν-οξείδια μορφές (Schramm et al., 2019b) . Η τοξική ισχύς αυτών των PA ποικίλλει σημαντικά με τα PA τύπου ρετρονεκίνης να είναι πιο τοξικά για τα θηλαστικά (Ruan et al., 2014) και το jacobine ανήκει σε αυτή την κατηγορία. Έχει υψηλή οξεία τοξικότητα και ισχυρή μεταλλαξιογόνο ικανότητα και ως εκ τούτου προκαλεί ιδιαίτερη ανησυχία όταν υπάρχει στην τροφική αλυσίδα (Mulder et al., 2018).

Εδώ, χρησιμοποιήσαμε οικότυπους C. rubens και C. crepidioides από την Αφρική και την Ασία για να δείξουμε ότι η jacobine παράγεται από διαφορετικές προσαρτήσεις C. crepidioides, μια ικανότητα που δεν είχαν οι μελετηθείσες προσαρτήσεις C. rubens. Παρέχονται αποδείξεις ότι ο σχηματισμός ιακοβίνης στο C. crepidioides εξαρτάται από τους βλαστούς και προκαλείται από ανεπάρκεια αζώτου (Ν), ένα ρυθμιστικό αποτέλεσμα που εμφανίζεται κατά τη ροή του HSS. Τα γονίδια που κωδικοποιούν HSS κλωνοποιήθηκαν και χαρακτηρίστηκαν για να διευκολύνουν προσεγγίσεις για την ανάπτυξη ποικιλιών C. crepidioides χωρίς ΡΑ, οι οποίες συζητούνται.

Υλικά και μέθοδοι

Φυτική ύλη

Σπόροι δύο οικοτύπων C. rubens και ενός C. crepidioides ελήφθησαν από την Millenium Seed Bank (MSB) στο Kew Royal Botanic Gardens (Kew, Ηνωμένο Βασίλειο) και έχουν τους ακόλουθους σειριακούς αριθμούς MSB: CrMali (αρ. 440626), CrBurkina Faso (αρ. 320148) και CcNepal (αρ. 31170). Η προσχώρηση Crassocephalum crepidioides Ilé-Ifè από τη Νιγηρία περιγράφηκε προηγουμένως (Rozhon et al., 2018). Crassocephalum crepidioides accession Το CcOsogbo συλλέχθηκε στο Osogbo της Νιγηρίας και το CrThailand ελήφθη από την Ταϊλάνδη.

Φυλογενετική Ανάλυση

Για να επιβεβαιωθεί η ταυτότητα των προσαρτήσεων και να διεξαχθεί μια φυλογενετική ανάλυση, ο χρωμοσωμικός εσωτερικός μεταγραφόμενος διαχωριστής (Blattner, 1999) και ο διαχωριστής trnL-trnF του χλωροπλάστη (Taberlet et al., 1991) ενισχύθηκαν με PCR χρησιμοποιώντας τα ζεύγη εκκινητών fwd trnL /trnF rev και ITS-A/ITS-B, αντίστοιχα (για τις αλληλουχίες όλων των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, βλέπε Συμπληρωματικό Πίνακα 2). Τα αμπλικόνια καθαρίστηκαν και αλληλουχήθηκαν, και οι αλληλουχίες ευθυγραμμίστηκαν. Τα δέντρα γειτονικής ένωσης υπολογίστηκαν με το MEGA X (Kumar et al., 2018).

Αναλύσεις μεγέθους γονιδιώματος και περιεκτικότητας 5-μεθυλκυτοσίνης

Η απόλυτη περιεκτικότητα σε πυρηνικό DNA (pg/2C) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας πυρήνες που απομονώθηκαν από φυτά που καλλιεργήθηκαν σε θερμοκήπιο. Περίπου 0,5 cm ² αυτού του υλικού νεαρών φύλλων κόπηκε σε 400 μl του ρυθμιστικού διαλύματος απομόνωσης πυρήνων (Κιτ: CyStain PI Absolute P; Sysmex Deutschland GmbH, Norderstedt, Γερμανία) μαζί με 0,5 cm ²νεαρός φυλλικός ιστός των εσωτερικών προτύπων, π.χ. Pisum sativum ποικιλία «Viktoria, Kifejto Borso» (9,07 pg/2C, Genebank IPK Gatersleben σύμφωνα με αρ. PIS 630). Το εναιώρημα που προέκυψε επωάστηκε για 2 λεπτά, διηθήθηκε (30 μm Celltric filters, Sysmex) και αναμίχθηκε με 1.600 μl του διαλύματος χρώσης του κιτ (CyStain PI Absolute P; Sysmex) που περιέχει ιωδιούχο προπίδιο. Μετά από 1 ώρα σκοτεινής επώασης σε πάγο, τα δείγματα αναλύθηκαν στο κυτταρόμετρο ροής (CyFlow Ploidy Analyzer; Sysmex Partec GmbH, Münster, Γερμανία). Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν σε τουλάχιστον τρεις διαφορετικές ημερομηνίες με στόχο έναν ελάχιστο αριθμό 2.000 σωματιδίων στις κύριες κορυφές και των δύο ειδών. Ανά προσχώρηση, προσδιορίστηκαν τα περιεχόμενα DNA 3-5 δενδρυλλίων, το καθένα με 3-7 αντίγραφα που παρασκευάστηκαν με ανεξάρτητα συλλεγμένο υλικό φύλλων. Για την εκτίμηση των περιεχομένων του πυρηνικού DNA, η μέση θέση κορυφής του δείγματος G0/G1 διαιρέθηκε με την τυπική μέση θέση κορυφής G0/G1 και πολλαπλασιάστηκε με το περιεχόμενο DNA του προτύπου (pg/2C). Το μέγεθος του γονιδιώματος υπολογίστηκε από το περιεχόμενο DNA σύμφωνα με τους Dolezel et al. (2003) χρησιμοποιώντας τον συντελεστή μετατροπής 0,978. Η περιεκτικότητα σε 5-mdC μετρήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Rozhon et al., 2008).

Συνθήκες ανάπτυξης στο έδαφος

Για ανάπτυξη στο έδαφος, τα φυτά καλλιεργήθηκαν σε θαλάμους ανάπτυξης (Bright Boy, CLF Plant Climmatics, Wertingen) ή στο θερμοκήπιο στους 22 ± 2°C και σε κύκλους 16 ωρών λευκού φωτός (80 μmol m −2 s −1 ⁾ / ⁸ h σκοτάδι. Χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα εμπορικά διαθέσιμα υποστρώματα με διαφορετική σύνθεση θρεπτικών συστατικών: CL ED73 και SP ED63 P (Patzer GmbH and Co. KG, Sinntal-Altengronau, Γερμανία) καθώς και D400 και C700 με Cocopor® (Stender AG, Schermbeck, Γερμανία ⁾ . Για πειράματα υποστρώματος, έξι σπορόφυτα 4 εβδομάδων ανά ομάδα θεραπείας, προ-αναπτυγμένα σε υπόστρωμα SP ED63 P, μεταμοσχεύθηκαν ξεχωριστά σε πλαστικά δοχεία 9,5 cm που περιείχαν ίσους όγκους από τα διαφορετικά υποστρώματα και αναπτύχθηκαν για άλλες 8 εβδομάδες μέχρι την ανάλυση.

Για το πείραμα χρονικής πορείας της ασιτίας με άζωτο, δενδρύλλια CcIle-Ife 4 εβδομάδων, προαναπτυγμένα σε υπόστρωμα SP ED63 P, μεταφυτεύθηκαν σε γλάστρες που περιείχαν 160 g εδάφους χαμηλής περιεκτικότητας σε θρεπτικά συστατικά (COMPO SANA ^®; COMPO GmbH, Münster, Γερμανία) και αναπτύχθηκε για άλλες 3 εβδομάδες. Σε κάθε δοχείο προστέθηκε στη συνέχεια ένα διάλυμα νιτρικού αμμωνίου, για να ληφθούν 150 ή 500 mg N/kg υποστρώματος, αντίστοιχα. Επιπλέον, 20 ml ενός βασικού θρεπτικού διαλύματος (22 g/L KH2PO4, 16,2 g/L MgSO4·7 H2O, 11,7 g/L CaCl2·2 H2O (μόνο για τη δεύτερη εφαρμογή), 3,98 g/L FeSO4·7 H2O, Δόθηκαν 985 mg/L MnSO4·H2O, 157 mg/L CuSO4·5 H2O, 176 mg/L ZnSO4·7 H2O και 46 mg/L H3BO3. Η θεραπεία με νιτρικά ξεκίνησε στις 7 εβδομάδες μετά τη βλάστηση και πραγματοποιήθηκε δύο φορές, σε διαστήματα 2 εβδομάδων. Το υλικό των φύλλων συγκομίστηκε μετά την τελευταία επεξεργασία με νιτρικά από 3 έως 4 μεμονωμένα φυτά ανά ομάδα επεξεργασίας (χαμηλό Ν και υψηλό Ν) σε 3-4 βιολογικά αντίγραφα, 7, 14, 21 και 28 ημέρες μετά την τελευταία λίπανση και πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις HPLC έξω.

Υδροπονικό Σύστημα για Πειράματα Λιμού Ν και Κ

Το υδροπονικό σύστημα φαίνεται στο συμπληρωματικό σχήμα 1. Αποτελούνταν από ένα κουτί ανάπτυξης με μέγεθος 28 cm × 19 cm × 14 cm και ένα αντίστοιχο καπάκι με έξι τρύπες, εξοπλισμένο με διχτυωτές γλάστρες γεμάτες με κυλινδρικούς ογκόλιθους από αφρώδες υλικό (Du Yang , Shenzhen, Κίνα). Κάθε υδροπονικό κουτί χρησιμοποιήθηκε για την καλλιέργεια έξι φυτών σε υγρό μέσο 4-L, το οποίο ανταλλάσσονταν δύο φορές την εβδομάδα. Ο σταθερός αερισμός του μέσου παρέχεται με πέτρες αέρα προσαρτημένες σε μια αντλία αέρα (Συμπληρωματικό Σχήμα 1).

Για πειράματα θρεπτικής πείνας, σπορόφυτα ηλικίας 3 εβδομάδων, προ-αναπτυγμένα σε SP ED63 P, μεταμοσχεύθηκαν στις υδροπονικές δεξαμενές και καλλιεργήθηκαν σε μέσο ½ MS (Murashige and Skoog, 1962) για άλλες 3 εβδομάδες προτού ανταλλάξουν ½ MS με ένα τροποποιημένο Μέσο Hoagland (Hoagland and Arnon, 1938). Μετά την ανταλλαγή του μέσου, τα φυτά αναπτύχθηκαν για άλλες 3 εβδομάδες στις δεξαμενές, πριν αναλυθεί η σύνθεση ΡΑ από 3 μεμονωμένα φυτά σε τρεις βιολογικές επαναλήψεις.

Το μέσο Hoagland αποτελούταν από 1,25 mM K2SO4, 2,5 mM Ca(NO3)2, 6,8 μM C10H12N2NaFeO8, 0,5 mM MgSO4, 0,125 mM KH2PO4, 11,56 μM Z2SO4, μ. διαλύθηκε σε απιονισμένο νερό, περιείχε 4,28 g MES (4-μορφολινοαιθανοσουλφονικό οξύ) και είχε το ρΗ ρυθμισμένο στο 5,8 με ΚΟΗ. Η πτώση του νιτρικού άλατος επιτεύχθηκε με την αντικατάσταση του Ca(NO3)2 με CaCl2, η πτώση του καλίου με την παράλειψη του K2SO4.

Εμβολιασμός

Η διαδικασία εμβολιασμού προσαρμόστηκε από το Melnyk (2017). Σπορόφυτα ηλικίας δεκατεσσάρων ημερών που είχαν προαναπτυχθεί σε μέσο ½ MS μεταφέρθηκαν σε τρυβλία Petri που περιείχαν δύο στρώσεις υγρού διηθητικού χαρτιού και ένα στρώμα νάιλον μεμβράνης. Αφαιρέθηκε μία κοτυληδόνα και έγιναν εγκάρσιες τομές διαμέσου των υποκοτυλήνων κάτω από το κορυφαίο μερίστωμα του βλαστού. Οι τεμαχισμένοι βλαστοί τοποθετήθηκαν στην κορυφή των αντίστοιχων υποκείμενων για τη συναρμολόγηση των μοσχευμάτων. Μετά τον εμβολιασμό, τα τρυβλία Petri σφραγίστηκαν με παραφίλμ και τοποθετήθηκαν κατακόρυφα σε επωαστήρα σε κύκλους 16 ωρών φωτός/8 ωρών σκότους στους 22°C. Μετά από 7 ημέρες τα επιτυχώς εμβολιασμένα φυτά μεταφέρθηκαν σε υπόστρωμα SP ED63 P. Οι τυχαίες ρίζες των φυτών αφαιρούνταν τακτικά στο αρχικό τους στάδιο για να διατηρηθεί η επιθυμητή ταυτότητα υποκείμενου. Τα εμβολιασμένα φυτά καλλιεργήθηκαν σε υπόστρωμα για άλλες 11 εβδομάδες πριν από τη συγκομιδή των ιστών των φύλλων για αναλύσεις.

Ανάλυση Μεταβολιτών και Ορυκτών σε Φυλλικό Ιστό και Έδαφος

Το Jacobine μετρήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Rozhon et al., 2018). Η ποσοτικοποίηση της ολικής ρετρονεκίνης προσαρμόστηκε από τους Kempf et al. (2008) και περιγράφεται αναλυτικά στις Συμπληρωματικές Πληροφορίες. Οι πολυαμίνες ποσοτικοποιήθηκαν με HPLC μετά από παραγωγοποίηση με χλωριούχο δανσύλιο (λεπτομέρειες δίνονται επίσης στις Συμπληρωματικές Πληροφορίες). Τα νιτρικά προσδιορίστηκαν ποσοτικά με χρωματογραφία ζεύγους ιόντων όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Schramm et al., 2019a). Για ανάλυση ορυκτών ομογενοποιημένο κατεψυγμένο φυτικό υλικό ζυγίστηκε σε χωνευτήριο χαλαζία και αποτεφρώθηκε στους 500°C για 5 ώρες. Η τέφρα διαλύθηκε σε 1 ml νιτρικού οξέος 1 Μ και προστέθηκε νερό σε τελικό όγκο 10 ml. Για ανάλυση του καλίου, το διάλυμα αραιώθηκε 1:20 με απεσταγμένο νερό και αναλύθηκε με χρωματογραφία ανταλλαγής κατιόντων όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Schramm et al., 2019a). Η περιεκτικότητα σε φωσφορικά άλατα αναλύθηκε με μια τροποποιημένη μέθοδο μολυβδαινικού όπως περιγράφεται στις Συμπληρωματικές Πληροφορίες. Τα υποστρώματα ανάπτυξης αναλύθηκαν από την Agrolab (Sarstedt, Γερμανία).

Κλωνοποίηση γονιδίων HSS, Ανασυνδυασμένη Έκφραση HSS και Δοκιμασίες Ενζυμικής Δραστικότητας

Για την κλωνοποίηση HSS από το Senecio jacobaea, απομονώθηκε RNA από ρίζες S. jacobaea και δημιουργήθηκε cDNA από 2 μg RNA χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης cDNA του RevertAid H μείον πρώτου κλώνου (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Ηνωμένες Πολιτείες). Αυτό το cDNA χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για την ενίσχυση των κωδικοποιητικών αλληλουχιών HSS χρησιμοποιώντας το ζεύγος εκκινητών Ρ70/Ρ71 (Reimann et al., 2004· για όλες τις αλληλουχίες εκκινητών, βλέπε Συμπληρωματικό Πίνακα 1). Η κλωνοποίηση στο pRSET-A και ο προσδιορισμός της αλληλουχίας αποκάλυψαν τρεις εκδόσεις SjHSS που διέφεραν μόνο κατά λίγα αμινοξέα σε μη διατηρημένες περιοχές.

Για την κλωνοποίηση του CcHSS, απομονώθηκε DNA από νεαρά φύλλα C. crepidioides Ile-Ife και οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τα εκφυλισμένα ζεύγη εκκινητών SxHSS fwd1/SxHSS rev1 και SxHSS fwd2/SxHSS rev2 που σχεδιάστηκαν να συνδέονται με τα πιο διατηρημένα μέρη του γνωστού HSS. γονίδια των Senecioneae. Και τα δύο απέδωσαν αμπλικόνια με μέγεθος περίπου 1 kb. Η αλληλουχία επιβεβαίωσε την ομολογία με το γονίδιο HSS του S. jacobaea. Χρησιμοποιώντας αυτές τις αλληλουχίες, σχεδιάστηκαν εκκινητές για 5′-RACE (εκκινητές CcHSS 5′-RACE 1, 2, και 3) και 3′-RACE (εκκινητές CcHSS 3′-RACE 1, 2, και 3). Το εκμαγείο cDNA παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε παραπάνω χρησιμοποιώντας ρίζες C. crepidioides Ile-Ife απομονωμένης με RNA. Τα 5′-RACE και 3′-RACE πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Scotto-Lavino et al., 2006a,b). Οι ληφθέντες αλληλουχίες κατατέθηκαν στη βάση δεδομένων αλληλουχιών νουκλεοτιδίων EMBL ή GenBank με τους ακόλουθους αριθμούς πρόσβασης: CcIle-Ife_HSS1, LR999447; CcIle-Ife_HSS2, LR999448; CcNepal_HSS1, LR999449; CcNepal_HSS2, LR999450; CrBurkina_Faso_HSS2, MZ275249; CrMali_HSS2, MZ275250; S.j_HSS2, LR999444; και S.j_HSS3, LR999445. Αυτές οι αλληλουχίες ευθυγραμμίστηκαν με τις αλληλουχίες των ορθολόγων HSS του S. jacobaea (HSS1, AJ704850), Senecio vulgaris (HSS, AJ251500) και Senecio vernalis (HSS1, AJ238623; HSS2, AJ704848 ree.¹ και ένα δέντρο που ενώνει γείτονα υπολογίστηκε με τη δοκιμή bootstrap (1.000 επαναλήψεις) χρησιμοποιώντας το MEGA X (Kumar et al., 2018).

Οι κωδικοποιητικές αλληλουχίες HSS κλωνοποιήθηκαν στον φορέα pRSET-A (Thermo Fisher Scientific) για να παραχθούν εκδόσεις με επισήμανση His. Αυτά τα κατασκευάσματα μετασχηματίστηκαν σε Escherichia coli BL21 και η έκφραση των πρωτεϊνών με επισήμανση His προκλήθηκε με προσθήκη IPTG σε τελική συγκέντρωση 1 mM. Οι πρωτεΐνες καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας ρητίνη κοβαλτίου HisPur™ (Thermo Fisher Scientific) όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές ενζυμικής δραστηριότητας σε αντιδράσεις 50 μl που περιείχαν 1 μg ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης σύντηξης HSS, 25 μl ρυθμιστικού διαλύματος TEA (100 mM, προσαρμοσμένο σε pH 9,5 με φωσφορικό οξύ), 1 μl EDTA (5 mM), 1 μl DTT (50 mM), 2 μl πουτρεσκίνης (1 mM), 2 μl σπερμιδίνης (1 mM) και 2,5 μl NAD (25 mM). Οι αντιδράσεις επωάστηκαν για 1 ώρα στους 30°C και σταμάτησαν με την προσθήκη 100 μl ανθρακικού νατρίου 2 Μ. Οι πολυαμίνες παραγοντοποιήθηκαν και οι συγκεντρώσεις μετρήθηκαν όπως περιγράφεται στις Συμπληρωματικές Πληροφορίες.

Ποσοτικές αναλύσεις PCR

Για την ποσοτική PCR (qPCRs) απομονώθηκε RNA από αντίστοιχα δείγματα με το κιτ φυτικών RNA EZNA (Omega Bio-tek, Norcross, GA, Ηνωμένες Πολιτείες) και συντέθηκε cDNA με το RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham , MA, Ηνωμένες Πολιτείες). Οι qPCRs πραγματοποιήθηκαν με το Mastercycler RealPlex2 (Eppendorf, Αμβούργο, Γερμανία) όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Unterholzner et al., 2015). Εν συντομία, οι αντιδράσεις PCR περιείχαν 2 μl cDNA, το ζεύγος εκκινητών CcHSS1 2 fwd/CcHSS rev για ανάλυση HSS1 2 και ένα πράσινο κύριο μείγμα SYBR (Nippon Genetics Europe, Düren, Γερμανία). Ως γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιήθηκε το C. crepidioides γλυκεραλδεϋδη-3-φωσφορική-αφυδρογονάση C2 (CcGAPC2) (He et al., 2016) και ενισχύθηκε με το ζεύγος εκκινητών CcG.

Στατιστικές αναλύσεις

Η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε με μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από δοκιμές HSD του Tukey. Οι σημαντικές διαφορές στο p ≤ 0,05 υποδεικνύονται με διαφορετικά γράμματα. Λεπτομέρειες σχετικά με τον αριθμό των αντιγράφων δίνονται στις αντίστοιχες θρυλικές εικόνες.

Αποτελέσματα

Απομόνωση Οικοτύπων Crassocephalum crepidioides και Crassocephalum rubens που διαφέρουν ως προς τη βλαστική ανάπτυξη και τη σύνθεση του γονιδιώματος

Προηγουμένως, δείξαμε ότι μια προσχώρηση του C. crepidioides από το Ilé-Ifè στη Νιγηρία (CcIle-Ife) μπορεί να συσσωρεύσει ιακοβίνη αλλά δεν σχηματίζει άλλα PA τύπου σενεσιονίνης (Rozhon et al., 2018). Για να διερευνήσουμε, εάν η ικανότητα σχηματισμού jacobine είναι συγκεκριμένη για τον οικότυπο και να εξετάσουμε εάν υπάρχουν διαφορές στη συσσώρευση jacobine μεταξύ C. crepidioides και C. rubens, λάβαμε τρεις επιπλέον οικότυπους C. crepidioides, από το Νεπάλ (CcNepal), την Ταϊλάνδη (CcThailand) και Osogbo στη Νιγηρία (CcOsogbo), και δύο εισαγωγές C. rubens, από το Μάλι (CrMali) και την Μπουρκίνα Φάσο (CrBurkina Faso). Μια φυλογενετική ανάλυση, βασισμένη στις αλληλουχίες ITS και trnL-trnF, έδειξε ότι, όπως αναμενόταν, οι προσαρτήσεις του ασιατικού και του αφρικανικού C. crepidioides και του C. ruben είχαν την πιο ισχυρή σχέση (Συμπληρωματικά Σχήματα 2Α, Β).

Μια πρόχειρη φαινοτυπική σύγκριση αυτών των οικοτύπων έδειξε ότι τα φυτά του C. crepidioides ήταν γενικά μεγαλύτερα από το C. rubens και σχημάτισαν περισσότερα φύλλα (Συμπληρωματικό Σχήμα 2C), πριν εισέλθουν στο γενετικό στάδιο. Επιπλέον, η φάση της βλαστικής ανάπτυξης, που ορίζεται ως ο χρόνος από τη βλάστηση των σπόρων μέχρι την ανάπτυξη των πρώτων ανθοφόρων μπουμπουκιών, παρατάθηκε σημαντικά στους αφρικανικούς οικότυπους C. crepidioides, που χρειάστηκαν περίπου 72 ημέρες μέχρι την ανθοφορία και περίπου 110 ημέρες μέχρι τη διασπορά των σπόρων (Συμπληρωματικό Σχήμα 2D) . Επιπλέον, οι αφρικανικές προσαρτήσεις σχημάτισαν περισσότερα φύλλα, τα οποία ήταν επίσης πιο οδοντωτά (Συμπληρωματικά σχήματα 2C,D). Δεδομένου ότι οι δύο αφρικανικοί και ασιατικοί οικότυποι C. crepidioides είχαν συγκρίσιμα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά, εστιάσαμε σε μια αφρικανική (CcIle-Ife) και μια ασιατική γραμμή (CcNepal) για την επόμενη εργασία.

Για να συγκριθεί η γενετική σύνθεση των οικοτύπων προσδιορίστηκαν οι αριθμοί των χρωμοσωμάτων και τα μεγέθη του γονιδιώματος. Γενικά, το γένος Crassocephalum έχει βασικό αριθμό χρωμοσωμάτων n = 10 (Oyelakin and Ayodele, 2013). Το CcIle-Ife περιείχε 40 χρωμοσώματα (Rozhon et al., 2018), τα οποία έδειχναν τετραπλοειδία και ήταν σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές (Vanijajiva and Kadereit, 2009· Oyelakin and Ayodele, 2013). Το επίπεδο πλοειδίας του C. rubens περιγράφηκε ως διπλοειδές (Oyelakin and Ayodele, 2013). Για να επαληθευτεί αυτό για τους πρόσθετους οικότυπους, τα χρωμοσώματα μετρήθηκαν στα κύτταρα του άκρου της ρίζας. Αυτό έδειξε ότι το CcNepal, όπως το CcIle-Ife, περιείχε 40 χρωμοσώματα, ενώ οι δύο οικότυποι C. rubens CrMali και CrBurkina Faso περιείχαν 20 (Συμπληρωματικό Σχήμα 2Ε), επιβεβαιώνοντας x = 10 και τετραπλοειδείς και διπλοειδείς καταστάσεις, αντίστοιχα. Και στα δύο είδη,

Για τον προσδιορισμό των μεγεθών του γονιδιώματος, πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις κυτταρομετρίας ροής. Η μέση τιμή 2C του CcIle-Ife και του CcNepal ήταν 12,4 pg, που υποδηλώνει μέγεθος γονιδιώματος περίπου 12,1 Gbp. Τα γονιδιώματα των δύο προσαρτημάτων C. rubens CrMali και CrBurkina Faso είχαν τιμές 2C 6,1 pg (Συμπληρωματικός Πίνακας 2). Για μια περαιτέρω σύγκριση της σύνθεσης του γονιδιώματος, προσδιορίστηκε το επίπεδο μεθυλίωσης DNA 5-mdC, το οποίο επηρεάζει την έκφραση χαρακτηριστικών και την πλαστικότητα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα σπορόφυτα ηλικίας 2 εβδομάδων των C. crepidioides και C. rubens είχαν παρόμοια περιεκτικότητα 5-mdC περίπου 30 και 31,5 mol%, αντίστοιχα (Συμπληρωματικός Πίνακας 2).

Η λιμοκτονία με άζωτο αυξάνει την ιακωβίνη στα φύλλα του Crassocephalum crepidioides, αλλά όχι του Crassocephalum rubens

Η ιακοβίνη συντίθεται στη βιοσυνθετική οδό PA, όπου ο σχηματισμός ομοσπερμιδίνης από τις πολυαμίνες σπερμιδίνη και πουτρεσκίνη από το HSS είναι η πρώτη ουσιαστική αντίδραση (Εικόνα 1Α). Δεδομένου ότι προηγουμένως είχαμε ανακαλύψει ότι οι συνθήκες ανάπτυξης επηρεάζουν τα επίπεδα ιακομίνης στο CcIle-Ife (Rozhon et al., 2018), υποθέσαμε ότι ο τύπος του υποστρώματος και ειδικότερα η παροχή θρεπτικών συστατικών μπορεί να είναι σχετικός. Για να ελεγχθεί αυτό, χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα διαφορετικά υποστρώματα ανάπτυξης με διαφορετική περιεκτικότητα σε θρεπτικά συστατικά. Τα φυτά που αναπτύχθηκαν στα υποστρώματα D400 και SP ED63 P, τα οποία έχουν χαμηλή περιεκτικότητα σε νιτρικά (Συμπληρωματικός Πίνακας 3), ανέπτυξαν σαφή συμπτώματα ανεπάρκειας Ν (Ueda et al., 2017; Yang et al., 2018), συμπεριλαμβανομένης της καθυστερημένης ανάπτυξης, των χλωρωτικών φύλλων και συσσώρευση ανθοκυανίνης (Εικόνα 1Β). Στη σειρά, μια ανάλυση των ιστών των φύλλων έδειξε ότι αυτά τα φυτά είχαν έλλειψη νιτρικών αλάτων, ενώ είχαν παρόμοια περιεκτικότητα σε κάλιο (Κ) και φώσφορο (Ρ, Συμπληρωματικό Σχήμα 3). Η ανεπάρκεια Ν συσχετίστηκε με ενισχυμένη συσσώρευση ελεύθερης jacobine στα φύλλα των δύο γραμμών C. crepidioides CcNepal και CcIle-Ife. Είναι ενδιαφέρον ότι αμφότερες οι προσαρτήσεις C. rubens δεν σχημάτισαν ιακωβίνη σε κανένα από τα χρησιμοποιούμενα υποστρώματα, με τα επίπεδα ιακωβίνης να είναι κάτω από το όριο ανίχνευσης των 4 nmol/g Fw (Εικόνα 1C).

Εικόνα 1 . Τα φύλλα του Crassocephalum crepidioides, αλλά όχι του Crassocephalum rubens, συσσωρεύουν jacobine, η οποία προωθείται από την ανάπτυξη σε υπόστρωμα χαμηλών νιτρικών αλάτων. (Α) Δοκιμαστική βιοσυνθετική οδός PA που απαιτείται για τη βιοσύνθεση της jacobine (τροποποιημένη από Schramm et al., 2019b). Οι PA και οι πρόδρομες ουσίες που αναλύθηκαν επισημαίνονται με κόκκινο χρώμα. Τα άγνωστα ένζυμα επισημαίνονται με; (Β) Αντιπροσωπευτικά φυτά ηλικίας 8 εβδομάδων του οικοτύπου Crassocephalum crepidioides του Νεπάλ, που αναπτύχθηκαν στα υποδεικνυόμενα υποστρώματα ανάπτυξης σε συνθήκες ανάπτυξης μεγάλης ημέρας στους 22 ± 2°C. (Γ) Ποσότητα ελεύθερης jacobine σε φύλλα φυτών ηλικίας 8 εβδομάδων Crassocephalum crepidioides και Crassocephalum rubens (που καλλιεργούνται όπως στο Β) μετρήθηκε από έξι φυτά. Οι αναλύσεις θρεπτικών συστατικών έδειξαν ότι το D400 και το SP ED63 P έχουν χαμηλή περιεκτικότητα σε νιτρικά, το C700 έχει μέτρια νιτρικά και το CL ED73 έχει υψηλά επίπεδα νιτρικών (οι συγκεντρώσεις διαλυτών νιτρικών φαίνονται στο υπόμνημα· για λεπτομέρειες σχετικά με όλα τα θρεπτικά συστατικά, βλέπε Συμπληρωματικό Πίνακας 1). (Δ) Ποσότητες των πολυαμινών σπερμιδίνη, πουτρεσκίνη και ομοσπερμιδίνη σε φύλλα φυτών που έχουν αναπτυχθεί όπως στο (Β). Οι στήλες και οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν το μέσο και τυπικό σφάλμα έξι ανεξάρτητων αντιγράφων. Στατιστικά σημαντική διαφορά στο p ≤ 0,05 των αποτελεσμάτων μεταξύ των υποστρωμάτων (σε μεμονωμένα είδη) υποδεικνύεται με διαφορετικά γράμματα και προσδιορίστηκε με μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από δοκιμή HSD του Tukey [jacobine: CcNepal (ANOVA F3,20 = 7,251, p = 0,002) , CcIle-Ife (ANOVA F3,20 = 11,199, p = 0,0002); σπερμιδίνη: CcNepal (ANOVA F3,20 = 8,482, p = 0,001), CcIle-Ife (ANOVA F3,20 = 37,897, p lt; 0,0001), CrBurkina Faso (ANOVA F3,19 = 9,300, C F3,20 = 23,154, p lt; 0,0001); πουτρεσκίνη: CcNepal (ANOVA F3,20 = 31,576, p lt; 0,0001), CcIle-Ife (ANOVA F3,20 = 31,307, p lt; 0,0001), CrBurkina Faso (ANOVA F3,19 = 8,000, 8,016, AN. F3,20 = 42.433, p lt; 0.0001); ομοσπερμιδίνη: CC

Για να εκτιμήσουμε, εάν η αύξηση της ιακοβίνης μπορεί να προκύψει από αυξήσεις σε πρόδρομες ουσίες ανάντη, μετρήσαμε τα επίπεδα σπερμιδίνης, πουτρεσκίνης και ομοσπερμιδίνης στα ίδια φυτά. Αυτό έδειξε ότι οι συγκεντρώσεις καμίας από αυτές τις πολυαμίνες δεν αυξήθηκαν ως απόκριση σε χαμηλό Ν, αλλά, αντίθετα, η σπερμιδίνη και η πουτρεσκίνη μειώθηκαν σαφώς. Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ δεν μπόρεσαν να σχηματίσουν jacobine, οι οικότυποι C. ruben σχημάτισαν ομοσπερμιδίνη, αν και σε χαμηλές συγκεντρώσεις, υποδεικνύοντας ότι δεν είναι έκφραση ή δραστηριότητα HSS, που περιορίζει τη σύνθεση jacobine στο C. rubens (Εικόνα 1D).

Για περαιτέρω επαλήθευση, εάν η εξάντληση του Ν προκαλεί σχηματισμό ιακοβίνης στα φύλλα του C. crepidioides, πραγματοποιήθηκε ένα πείραμα χρονικής πορείας με CcIle-Ife. Τα φυτά αναπτύχθηκαν σε λιμνούλα χαμηλής περιεκτικότητας σε θρεπτικά συστατικά, συμπληρωμένα με θρεπτικά συστατικά. Σε αυτό το υπόστρωμα ανάπτυξης προστέθηκε Ν με τη μορφή νιτρικού αμμωνίου (NH4NO3) σε δύο δόσεις, δηλαδή συνολικά 150 mg N/kg DW ή 500 mg/kg DW, οι οποίες προστέθηκαν σε κλάσματα, η πρώτη μετά τη φύτευση των δενδρυλλίων και το δεύτερο 2 εβδομάδες μετά. Στη συνέχεια, συλλέχθηκαν δείγματα στις 7, 14, 21 και 28 ημέρες μετά την τελευταία προσθήκη νιτρικού αμμωνίου και μετρήθηκαν πρόδρομοι ιακοβίνης και πολυαμίνης στους ιστούς των φύλλων. Αυτό επιβεβαίωσε ότι οι συγκεντρώσεις της ελεύθερης jacobine αυξήθηκαν έντονα, ενώ τα επίπεδα της ομοσπερμιδίνης και της σπερμιδίνης μειώθηκαν, όταν η παροχή νιτρικών αλάτων μειώθηκε (Εικόνα 2). Επομένως,

Σχήμα 2. Η πείνα με άζωτο αποδίδει ισχυρές αυξήσεις jacobine στα φύλλα Crassocephalum crepidioides. Τα φυτά CcIle-Ife, που αναπτύχθηκαν σε έδαφος λιμνών χαμηλών θρεπτικών στοιχείων, γονιμοποιήθηκαν με νιτρικό αμμώνιο είτε σε χαμηλή (150 mg N/kg DW) είτε σε υψηλή δόση (500 mg N/kg DW). Η κατεργασία με νιτρικά ξεκίνησε 7 εβδομάδες μετά τη βλάστηση και πραγματοποιήθηκε δύο φορές, σε διαστήματα 2 εβδομάδων. Ελήφθησαν δείγματα φύλλων από 3 έως 4 φυτά ανά ομάδα αγωγής στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία μετά την τελευταία προσθήκη νιτρικού αμμωνίου και οι συγκεντρώσεις της ελεύθερης ιακομίνης, σπερμιδίνης, πουτρεσκίνης και ομοσπερμιδίνης μετρήθηκαν με HPLC. Οι στήλες και οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν το μέσο και τυπικό σφάλμα 3-4 ανεξάρτητων βιολογικών αντιγράφων. Στατιστικά σημαντική διαφορά των αποτελεσμάτων μεταξύ των χρονικών σημείων και των επιπέδων Ν στο p ≤ 0.

Ο αντίκτυπος της εξάντλησης του Ν στη συσσώρευση Ιακωβίνης εμφανίζεται κάτω από τη ροή του HSS

Υπάρχουν ελάχιστες ενδείξεις ότι η ανεπάρκεια Ν μπορεί να προκαλέσει βιοσύνθεση PA. Στα είδη Senecio, η αυξημένη γονιμοποίηση NPK μείωσε τις συγκεντρώσεις PA στους βλαστούς (Vrieling et al., 1993; Vrieling and van Wijk, 1994; Hol et al., 2003; Kirk et al., 2010). Ωστόσο, ποια θρεπτική ουσία ευθύνεται για αυτές τις επιδράσεις είχε παραμείνει άγνωστη. Για να αξιολογηθεί οριστικά, εάν είναι η μείωση του Ν που προκαλεί συσσώρευση ιακωβίνης, υιοθετήθηκε ένα υδροπονικό σύστημα για το είδος. Το σύστημα (φαίνεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 1 και Σχήμα 3Α) επιτρέπει την ανάπτυξη των φυτών σε συνθήκες χωρίς έδαφος, τη στοχευμένη παροχή ενώσεων και τη μεμονωμένη δειγματοληψία υλικού βλαστών και ριζών.

Εικόνα 3 . Η διαρροή αζώτου αυξάνει τη ζακοβίνη και την ολική ρετρονεκίνη, αλλά όχι τις πολυαμίνες στα φύλλα των υδροπονικά αναπτυσσόμενων φυτών Crassocephalum crepidioides. Τα φυτά CcNepal και CcIle-Ife ηλικίας τριών εβδομάδων που καλλιεργήθηκαν στο έδαφος μεταφέρθηκαν σε υδροπονικό σύστημα, προσαρμόστηκαν για 3 εβδομάδες για να αναπτυχθούν στις υδροπονικές συνθήκες και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν είτε σε πλήρη είτε σε κάλιο (-K) ή σε άζωτο (-Ν ) μέσο εγκατάλειψης. Μετά από 3 εβδομάδες ανάπτυξης στο μέσο που εγκατέλειψε, τα φύλλα ή οι ρίζες αναλύθηκαν χωριστά από τρία μεμονωμένα φυτά. (Α) Εικόνα αντιπροσωπευτικών φυτών CcNepal. (Β) Επίπεδα ελεύθερης jacobine. nd (δεν ανιχνεύθηκε): κάτω από το όριο ανίχνευσης των 4 nmol/g Fw. (ΝΤΟ)Επίπεδα σπερμιδίνης, πουτρεσκίνης, ομοσπερμιδίνης και ολικής ρετρονεκίνης. Οι στήλες και οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν το μέσο και τυπικό σφάλμα 3 ανεξάρτητων βιολογικών αντιγράφων. Στατιστικά σημαντική διαφορά των αποτελεσμάτων εντός των οργάνων του μεμονωμένου είδους στο p ≤ 0,05 υποδεικνύεται με διαφορετικά γράμματα και προσδιορίστηκε με μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από δοκιμή HSD του Tukey [ελεύθερη jacobine: φύλλα CcNepal (ANOVA F2,6 = 46,821, p = 0,0002 ), φύλλα CcIle-Ife (ANOVA F2,6 = 16.451, p = 0.004); σπερμιδίνη: φύλλα CcNepal (ANOVA F2,6 = 99,300, p lt; 0,0001), φύλλα CcIle-Ife (ANOVA F2,6 = 27,509, p = 0,001), ρίζες CcNepal (ANOVA F2,6 = 51,901), CcIle-Ife 51,6 = 20,90 c. -Εάν ρίζες (ANOVA F2,6 = 25,216, p = 0,001); ομοσπερμιδίνη: φύλλα CcNepal (ANOVA F2,6 = 181,942, p lt; 0,0001), φύλλα CcIle-Ife (ANOVA F2,6 = 39,788, p = 0,0003), Cc Ρίζες Νεπάλ (ANOVA F2,6 = 13,364, p = 0,006), ρίζες CcIle-Ife (ANOVA F2,6 = 91,586, p lt; 0,0001); putrescine: φύλλα CcNepal (ANOVA F2,6 = 57,970, p = 0,0001), φύλλα CcIle-Ife (ANOVA F2,6 = 41,215, p = 0,0003), ρίζες CcNepal (ANOVA F2,6 = 44,200, C) -Εάν ρίζες (ANOVA F2,6 = 76,987, p lt; 0,0001); ρετρονεκίνη: φύλλα CcNepal (ANOVA F2,6 = 24,150, p = 0,001), φύλλα CcIle-Ife (ANOVA F2,6 = 5,923, p = 0,038), ρίζες CcNepal (ANOVA F2,6 = 2,691, p = 2,691, p = ). -Αν ρίζες (ANOVA F2,6 = 12.140, p =0.008)]. 0001); ρετρονεκίνη: φύλλα CcNepal (ANOVA F2,6 = 24,150, p = 0,001), φύλλα CcIle-Ife (ANOVA F2,6 = 5,923, p = 0,038), ρίζες CcNepal (ANOVA F2,6 = 2,691, p = 2,691, p = ). -Αν ρίζες (ANOVA F2,6 = 12.140, p =0.008)]. 0001); ρετρονεκίνη: φύλλα CcNepal (ANOVA F2,6 = 24,150, p = 0,001), φύλλα CcIle-Ife (ANOVA F2,6 = 5,923, p = 0,038), ρίζες CcNepal (ANOVA F2,6 = 2,691, p = 2,691, p = ). -Αν ρίζες (ANOVA F2,6 = 12.140, p =0.008)].

Τα φυτά CcNepal και CcIle-Ife προ-αναπτύχθηκαν για 3 εβδομάδες σε υπόστρωμα ανάπτυξης και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν είτε σε δεξαμενές που περιείχαν υγρό μέσο με όλα τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά (γεμάτη) είτε σε δεξαμενές που περιείχαν θρεπτικό υλικό εγκατάλειψης, το οποίο δεν είχε είτε κάλιο (-K) είτε νιτρικό (-Ν). Μια ξεχωριστή ανάλυση ιστών νεαρών φύλλων και ριζών έδειξε ότι η ελεύθερη ιακοβίνη αυξήθηκε σημαντικά ως απόκριση στην ανεπάρκεια Ν στα φύλλα και των δύο προσαρτήσεων, αλλά ήταν κάτω από το όριο ανίχνευσης των 4 nmol/g Fw στις ρίζες, αποκαλύπτοντας διαφορές ειδικών οργάνων. Η ανεπάρκεια Κ είχε σημαντικό αντίκτυπο στις ποσότητες ιακοβίνης στα φύλλα του CcNepal, αλλά όχι στο CcIle-Ife (Εικόνα 3Β).

Σύμφωνα με τα αποτελέσματα από φυτά που καλλιεργούνται στο έδαφος, τα επίπεδα των πολυαμινών μειώθηκαν ως απάντηση στην ανεπάρκεια Ν. Αντίθετα, η ανεπάρκεια Κ αύξησε τις πολυαμίνες, ιδιαίτερα την πουτρεσκίνη (Εικόνα 3Γ, παρακαλούμε σημειώστε τη λογαριθμική κλίμακα), η οποία έχει επίσης περιγραφεί για άλλα είδη φυτών (Richards and Coleman, 1952· Liu et al., 2015). Σε αντίθεση με την ελεύθερη ιακοβίνη, οι πολυαμίνες υπάρχουν σε παρόμοιες ποσότητες στα φύλλα και τις ρίζες, δείχνοντας ότι δεν είναι η έλλειψη αυτών των πρόδρομων ουσιών που βλάπτουν τον σχηματισμό ιακοβίνης στις ρίζες του C. crepidioides.

Για να προσδιοριστούν περαιτέρω οι θέσεις της επίδρασης έλλειψης Ν, προσδιορίστηκαν στα ίδια δείγματα τα επίπεδα της ρετρονεκίνης, ενός προϊόντος που σχηματίστηκε αργότερα στη βιοσύνθεση PA (Εικόνα 1Α). Η μέθοδος που χρησιμοποιείται επιτρέπει έναν ποσοτικό προσδιορισμό τόσο της ελεύθερης όσο και (σε ​​PA που προέρχονται από ρετρονεκίνη) συνδεδεμένης ρετρονεκίνης. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης έδειξαν ότι, στα φύλλα και των δύο οικοτύπων, τα συνολικά επίπεδα ρετρονεκίνης αυξήθηκαν κατά περίπου 2 φορές όταν αναπτύχθηκαν σε μέσο χωρίς νιτρικά, το οποίο συσχετίστηκε με αύξηση της ιακωβίνης κατά περίπου 2,5 φορές (Εικόνες 3B,C ). Αντίθετα, η jacobine δεν ήταν ανιχνεύσιμη στις ρίζες, ενώ υπήρχε και ολική ρετρονεκίνη, αν και σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις. Είναι σημαντικό ότι η ολική ρετρονεκίνη ανταποκρίθηκε στη μείωση του Ν στους βλαστούς, αλλά όχι στις ρίζες, πράγμα που σημαίνει ότι η ρυθμιστική επίδραση είναι ειδική για τους βλαστούς. Συνοψίζοντας,

Ο σχηματισμός Jacobine στο Crassocephalum crepidioides Απαιτεί όργανα βλαστών

Κατ’ αρχήν, οι PA μπορούν να υπάρχουν σε όλα τα φυτικά όργανα, αλλά σε είδη της οικογένειας Asteraceae, όπως το S. vulgaris (κοινό έδαφος), πιστεύεται ότι συντίθενται αποκλειστικά στις ρίζες και στη συνέχεια, ως Ν-οξείδια, μεταφέρονται μέσω το phloem στους βλαστούς (Hartmann et al., 1989). Δεδομένου ότι το jacobine ήταν μη ανιχνεύσιμο στις ρίζες (Εικόνα 3Β), σκοπεύαμε να ελέγξουμε εάν το ριζικό σύστημα είναι απαραίτητο για το σχηματισμό jacobine στο C. crepidioides. Για να το καταφέρουμε αυτό, δημιουργήσαμε ένα σύστημα εμβολιασμού για το Crassocephalum και εμβολιάσαμε βλαστούς του παραγωγού jacobine CcIle-Ife σε υποκείμενα του CrMali, τα οποία δεν σχηματίζουν jacobine. Φυτάρια φυτών CcIle-Ife ηλικίας 2 εβδομάδων εμβολιάστηκαν σε υποκείμενα των CrMali και CcIle-Ife, ως έλεγχος. Ο εμβολιασμός του CrMali σε υποκείμενα των CcIle-ife και CrMali δημιούργησε μοσχεύματα με αντίθετη σύνθεση.

Τα εμβολιασμένα φυτά εμφάνισαν σημάδια στρες, όπως αυξημένη συσσώρευση ανθοκυανίνης και καθυστέρηση ανάπτυξης, σε σύγκριση με μη εμβολιασμένα φυτά C. crepidioides (Εικόνα 4Α). Αυτή ήταν μια αντίδραση εμβολιασμού, καθώς τα μοσχεύματα ελέγχου (βλαστοί που ενώνονται με αποθέματα ριζών του ίδιου είδους) έδειξαν τους ίδιους φαινότυπους με τους συνδυασμούς μεταξύ των ειδών. Έτσι, είχαν δημιουργηθεί λειτουργικά μοσχεύματα και πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις της ιακοβίνης (τόσο της ελεύθερης όσο και της συνολικής, που περιλαμβάνει το Ν-οξείδιο της) από τους ιστούς των φύλλων. Αυτά έδειξαν ότι στα φύλλα των μοσχευμάτων ελέγχου CcIle-Ife CcIle-Ife, σε σύγκριση με τα μη εμβολιασμένα φυτά C. crepidioides, τα επίπεδα τόσο της ελεύθερης όσο και της ολικής ιακωβίνης αυξήθηκαν σημαντικά, δείχνοντας ότι ο εμβολιασμός, εκτός από την πρόκληση (άλλου) στρες -αντιδράσεις απόκρισης, επίσης διέγειραν την παραγωγή ιακομίνης. Τα μοσχεύματα ελέγχου C. rubens, τα οποία συνδύαζαν το Cr

Εικόνα 4 . Η συσσώρευση ιακοβίνης στο Crassocephalum crepidioides βασίζεται στα βλαστικά όργανα του. Γλώσσες ηλικίας δύο εβδομάδων του CcIle-Ife εμβολιάστηκαν σε αποθέματα ριζών του CrMali και αντίστροφα και διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια ιστού για 1 εβδομάδα για εγκατάσταση. Εμβολιασμένα φυτά, μάρτυρες εμβολιασμού (μπολόνια ενωμένα με υποκείμενα του ίδιου είδους) και μη εμβολιασμένα φυτά CcIle-Ife (ως μάρτυρας) τα οποία στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε υπόστρωμα SP ED63 (χαμηλά νιτρικά) και αναπτύχθηκαν για άλλες 11 εβδομάδες σε τυπικές συνθήκες ανάπτυξης. πριν μετρηθεί η ελεύθερη και η ολική jacobine σε βλαστούς. (Α) Εικόνες αντιπροσωπευτικών φυτών. Οι συνδυασμοί εμβολιασμού ονομάζονται με το βλαστό στην πρώτη θέση (με έντονα γράμματα) και το κοντάκι ρίζας στη δεύτερη θέση. (ΣΙ)Επίπεδα ελεύθερης και ολικής jacobine σε nmol/g Fw. Τα φυτά επισημαίνονται όπως στο Α (δότης βλαστών με έντονους χαρακτήρες). Οι στήλες και οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν το μέσο και τυπικό σφάλμα 6–17 ανεξάρτητων αντιγράφων. Στατιστικά σημαντική διαφορά στο p ≤ 0,05 των αποτελεσμάτων υποδεικνύεται με διαφορετικά γράμματα και προσδιορίστηκε με μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από δοκιμή HSD του Tukey (ελεύθερη ιακωβίνη: ANOVA F2,30 = 164,719, p lt; 0,0001, συνολική ιακωβίνη: ANOVA F2,30 130,194, p lt; 0,0001). nd (δεν ανιχνεύθηκε): κάτω από το όριο ανίχνευσης των 4 nmol/g Fw.

Είναι σημαντικό ότι όταν το ριζικό απόθεμα CcIle-Ife αντικαταστάθηκε με ένα απόθεμα ρίζας CrMali, τα επίπεδα jacobine μειώθηκαν σαφώς σε σύγκριση με τα μοσχεύματα ελέγχου CcIle-Ife CcIle-Ife, παρέχοντας ενδείξεις ότι το σύστημα βλαστών είναι το κεντρικό στοιχείο για το jacobine σχηματισμός στο C. crepidioides, αλλά και δείχνοντας ότι το υποκείμενο συμβάλλει. Αυτό επιβεβαιώθηκε με την ανάλυση των συνδυασμών εμβολιασμού προς την αντίθετη κατεύθυνση: όταν το C. rubens συνεισέφερε στο βλαστό, δεν σχηματίστηκε jacobine, ακόμη και όταν υπήρχε διαθέσιμο υποκείμενο C. crepidioides στο μόσχευμα CrMali CcIle-Ife (Εικόνα 4Β). Επομένως, είναι κυρίως τα όργανα βλαστών που απαιτούνται για το σχηματισμό ιακωβίνης στο C. crepidioides.

Στο Crassocephalum crepidioides υπάρχουν δύο γονίδια HSS, τα οποία εκφράζονται κυρίως στις ρίζες

Για περαιτέρω διερεύνηση, εάν υπάρχει ρυθμιστικός αντίκτυπος της ανεπάρκειας Ν στη σύνθεση της ιακοβίνης κατάντη του HSS, χαρακτηρίσαμε τα γονίδια HSS του C. crepidioides και του C. rubens. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν εκφυλισμένοι εκκινητές που στόχευαν διατηρημένες αλληλουχίες HSS και κλωνοποιήθηκαν HSS και από τις τέσσερις προσαρτήσεις. Αυτό αποκάλυψε ότι το C. rubens και το C. crepidioides περιέχουν δύο παραλλαγές HSS, η μία από τις οποίες, η HSS1, ήταν πανομοιότυπη και στα δύο είδη και η δεύτερη, η HSS2, η οποία διέφερε ελαφρώς (Συμπληρωματικό Σχήμα 4). Μια φυλογενετική ανάλυση των κλωνοποιημένων HSS με ορθολόγους HSS που κλωνοποιήθηκαν από άλλα μέλη των Senecioneae, έδειξε ότι, όπως ήταν αναμενόμενο, τα Crassocephalum HSS σχετίζονταν περισσότερο μεταξύ τους παρά με άλλα HSS (Συμπληρωματικό Σχήμα 5).

Για να μελετηθεί, εάν τα ταυτοποιημένα HSS είναι ενζυμικά ενεργά και συγκρίνονται οι δραστηριότητές τους με τους ορθολόγους HSS του παραγωγού PA S. jacobaea (ragwort), κλωνοποιήθηκαν εκδόσεις όλων των HSS με επισήμανση His, εκφρασμένες σε E. coli, καθαρίστηκαν ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες και διεξήχθησαν in vitro δοκιμασίες ενζύμων με σπερμιδίνη και πουτρεσκίνη ως υποστρώματα. Αυτό έδειξε ότι όλα τα ένζυμα παρήγαγαν ομοσπερμιδίνη, καθώς και ένα παραπροϊόν ομοσπερμιδίνης 1,3-διαμινοπροπάνιο, με παρόμοιες δραστηριότητες in vitro (Εικόνα 5Α).

Εικόνα 5 . Τα HSS1 και HSS2 του Crassocephalum crepidioides είναι ενζυμικά ενεργά και εκφράζονται κυρίως σε ρίζες. (Α) Σύγκριση in vitro δραστηριοτήτων των HSS1 και HSS2 του Crassocephalum crepidioides με το HSS2 του Crassocephalum rubens και των εκδόσεων HSS του Senecio jacobaea. Ανασυνδυασμένες, επισημασμένες με His πρωτεΐνες χρησιμοποιήθηκαν σε in vitro προσδιορισμούς ενζύμων με σπερμιδίνη και πουτρεσίνη ως υποστρώματα και αναλύοντας τον σχηματισμό σπερμιδίνης και του παραπροϊόντος 1,3-διαμινοπροπάνιο με HPLC. Οι στήλες και οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν το μέσο και τυπικό σφάλμα 1–5 ανεξάρτητων βιολογικών αντιγράφων. Τα γράμματα πάνω από τις ράβδους υποδεικνύουν p lt; 0,05, ANOVA ακολουθούμενη από δοκιμή HSD του Tukey (ομοσπερμιδίνη: ANOVA F6,13 = 4,406, p = 0,012, παραπροϊόν: ANOVA F6,13 = 4,648, p = 0,010). (ΣΙ)Το qPCR αναλύει την έκφραση του CcHSS1 2 σε φύλλα φυτών Crassocephalum crepidioides που έχουν αναπτυχθεί υδροπονικά είτε πλήρως είτε σε μέσο αποβολής νιτρικών αλάτων. Ο μέσος όρος και η τυπική απόκλιση 3 ανεξάρτητων βιολογικών αντιγράφων. Τα γράμματα πάνω από τις γραμμές υποδεικνύουν p lt; 0,05, ANOVA ακολουθούμενη από δοκιμή HSD του Tukey (ANOVA F5,11 = 15,781, p = 0,0001). nm, δεν έχει μετρηθεί.

Για να αναλυθεί, εάν η έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν HSS του C. crepidioides μπορεί να ελεγχθεί με ασιτία με Ν, πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις έκφρασης από υδροπονικά αναπτυγμένα φυτά CcNepal και CcIle-Ife. Ως γονίδιο νοικοκυριού επιλέχθηκε το GAPC2, ένα γονίδιο που χρησιμοποιείται συνήθως ως αναφορά (He et al., 2016), το οποίο κλωνοποιήθηκε από το CcIle-Ife. Δεδομένου ότι τα HSS1 και HSS2 είναι πολύ παρόμοια, οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται για qPCR στοχεύουν και τις δύο εκδόσεις HSS. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και στους δύο οικότυπους του C. crepidioides το HSS1 2, ενώ εκφραζόταν κυρίως σε ρίζες, ήταν επίσης ανιχνεύσιμο στους βλαστούς, αν και σε χαμηλά επίπεδα (Εικόνα 5Β). Σκοπεύαμε να προσδιορίσουμε τα επίπεδα μεταγραφών HSS1 2 επίσης μετά από λιμοκτονία με Ν, ωστόσο από βλαστούς με εξάντληση Ν δεν θα μπορούσε να εξαχθεί σχεδόν κανένα RNA με επαρκή ποιότητα, καθιστώντας αδύνατες τις αναλύσεις qPCR. Από ρίζες που λιμοκτονούν,

Συζήτηση

Το Crassocephalum rubens και το C. crepidioides είναι αφρικανικές ορφανές καλλιέργειες που χρησιμοποιούνται ως φυλλώδη λαχανικά και φαρμακευτικά φυτά στην Υποσαχάρια Αφρική. Το Crassocephalum crepidioides είναι ιδιαίτερα δημοφιλές στη Νιγηρία και, σε σύγκριση με το διπλοειδή στενό συγγενή του C. rubens, φέρνει σαφή οφέλη όσον αφορά τις αποδόσεις, καθώς έχει παρατεταμένη φάση βλαστικής ανάπτυξης και παράγει υψηλότερες ποσότητες βιομάζας (Adjatin et al., 2013b) . Αυτές οι ικανότητες θα μπορούσαν να σχετίζονται με την τετραπλοειδή φύση του είδους, καθώς η πολυπλοειδία μπορεί να καθυστερήσει την ανθοφορία και να αυξήσει το σφρίγος των φυτών (Comai, 2005; Mayfield et al., 2011; Wei et al., 2019). Ωστόσο, υπάρχει επίσης φυσική διακύμανση του χρόνου ανθοφορίας στο C. crepidioides: οι αφρικανικοί οικότυποι που αναλύθηκαν άνθησαν σημαντικά αργότερα από τους ασιατικούς.

Εκτός από την επίδραση της πλαστικότητας του χαρακτηριστικού, μια καλά περιγραφόμενη επίδραση της πολυπλοειδίας είναι μια μεγαλύτερη συσσώρευση δευτερογενών μεταβολιτών, συμπεριλαμβανομένων των αλκαλοειδών (Dhawan and Lavania, 1996; Gaynor et al., 2020) και εδώ δείχνουμε ότι το C. crepidioides μπορεί να συνθέσει το PA jacobine, ικανότητα που λείπει από τον C. rubens, τουλάχιστον στις συνθήκες που δοκιμάστηκαν. Αν και αυτό μπορεί να είναι ένα εξελικτικό πλεονέκτημα για το είδος (te Beest et al., 2012), είναι ένα αντιδιατροφικό χαρακτηριστικό όταν το C. crepidioides χρησιμοποιείται ως φυλλώδες λαχανικό ή φαρμακευτικό φυτό. Ως εκ τούτου, ως ουσιαστικό βήμα για την εξημέρωση αυτής της άγριας καλλιέργειας, η ιακοβίνη απαιτεί απομάκρυνση, είτε μέσω συγκεκριμένης γεωργικής πρακτικής, που μπορεί να είναι δύσκολο να εφαρμοστεί, είτε γενετικά, μέσω αναπαραγωγής.

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η ασιτία με Ν αύξησε έντονα τις ποσότητες jacobine στους βλαστούς C. crepidioides, που είναι τα καταναλισκόμενα μέρη του φυτού. Γενικά, είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η ανεπάρκεια θρεπτικών συστατικών, όπως και άλλοι τύποι περιβαλλοντικού στρες, μπορεί να αυξήσει την παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών όπως οι ανθοκυανίνες (Yang et al., 2018), και επίσης το C. crepidioides υπερσυσσωρεύει αυτές τις χρωστικές ως απόκριση σε Έλλειψη Ν. Επιπλέον, υπήρχαν ήδη ενδείξεις ότι η διαθεσιμότητα θρεπτικών συστατικών μπορεί να επηρεάσει τις συγκεντρώσεις των αλκαλοειδών. Για παράδειγμα, στο όσπριο Lupinus angustifolius (λούπινο), το οποίο παράγει το αλκαλοειδές κινολιζιδίνης (QA) λουπανίνη, η έλλειψη Κ αύξησε έντονα τα επίπεδα λουπανίνης (Gremigni et al., 2001). Αυτές οι αυξήσεις παρατηρήθηκαν επίσης σε ποικιλίες «γλυκού λούπινου», οι οποίες εκτράφηκαν για να είναι απαλλαγμένες από QA, μια επιτυχία αναπαραγωγής που επιτεύχθηκε τη δεκαετία του 1970,

Ενώ η βιοσύνθεση PA στο C. crepidioides δεν ανταποκρίθηκε έντονα σε μια ανεπάρκεια στο Κ, αυξήθηκε σαφώς όταν προκλήθηκε ανεπάρκεια Ν. Ένας τέτοιος αντίκτυπος Ν στα επίπεδα PA φαίνεται να είναι ειδικός για το είδος. Στο Crotalaria, ένα υποτροπικό γένος των Fabaceae, η έλλειψη Ν στο υπόστρωμα ανάπτυξης δεν άλλαξε τα επίπεδα PA σε όργανα πάνω από το έδαφος. Ωστόσο, αποδείχθηκε ότι η εξάντληση του Ν προήγαγε τον σχηματισμό οζιδίων ρίζας, τα οποία φιλοξενούν συμβιωτικά βακτήρια που δεσμεύουν το Ν, και ότι τα PA σχηματίστηκαν ειδικά σε αυτά τα οζίδια (Irmer et al., 2015). Στο γένος Senecio, το οποίο όπως και το Crassocephalum ανήκει στη φυλή Asteraceae Senecioneae, οι συγκεντρώσεις PA στα φύλλα μειώθηκαν ως απόκριση στη γονιμοποίηση NPK (Hol et al., 2003; Kirk et al., 2010). Ωστόσο, παρέμεινε άπιαστο, ποια θρεπτικά συστατικά προσδίδουν αυτά τα αποτελέσματα. Εδώ, δείχνουμε ότι στο C. crepidioides είναι μια ανεπάρκεια στο N που αυξάνει τη jacobine και ότι ο ρυθμιστικός αντίκτυπος συμβαίνει μετά το HSS, καθώς οι συγκεντρώσεις της ομοσπερμιδίνης ήταν ανεξάρτητες από την παροχή Ν. Στην πραγματικότητα, τα επίπεδα πολυαμινών μειώθηκαν με την απόσυρση του Ν, η οποία θα μπορούσε να προκύψει από μια αυξημένη ροή μέσω της βιοσυνθετικής οδού.

Τα επίπεδα της ρετρονεκίνης, η οποία σχηματίζεται αργότερα στη βιοσύνθεση PA, αυξήθηκαν επίσης ως απόκριση στην ανεπάρκεια Ν. Ωστόσο, δεδομένου ότι μετρήθηκε η ολική ρετρονεκίνη, δεν μπορούμε να χαρτογραφήσουμε τις θέσεις των επιπτώσεων στα βιοσυνθετικά ένζυμα PA. Η βιοσύνθεση PA είναι σε μεγάλο βαθμό ανεπίλυτη σήμερα, αλλά είναι σαφές ότι ορισμένα απαιτούμενα ένζυμα κωδικοποιούνται από μέλη μεγάλων οικογενειών γονιδίων, καθιστώντας δύσκολη την αναγνώρισή τους. Μια προσέγγιση που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί είναι ο προσδιορισμός αλληλουχίας RNA φυτών που προκαλούνται με ερεθίσματα που επάγουν την έκφραση βιοσυνθετικού γονιδίου PA. Ωστόσο, μια de novo συγκρότηση δεδομένων RNA-Seq είναι πολύ προκλητική και θα διευκολυνθεί, μόλις υπάρξει ένα γονιδίωμα αναφοράς για το C. rubens. Αυτό θα ωφελήσει επίσης τις δραστηριότητες έρευνας και αναπαραγωγής για άλλα μέλη των Asteraceae, καθώς, αν και τα Asteraceae είναι η μεγαλύτερη οικογένεια αγγειακών φυτών, που περιλαμβάνει το 8% όλων των ειδών φυτών (Anderberg et al., 2007), μόνο πέντε μέλη έχουν προσδιοριστεί ακόμη: αλογίσιο (Erygeron canadensis; Peng et al., 2014), ηλίανθος (Helianthus annuus; Badouin et al., 2017) , αγκινάρα (Cynara scolymus; Scaglione et al., 2016), μαρούλι (Lactuca sativa; Reyes-Chin-Wo et al., 2017) και γλυκιά αψιθιά (Artemisia annua; Shen et al., 2018). Κανένα από αυτά τα είδη δεν ανήκει στους Senecioneae, που είναι η μεγαλύτερη φυλή των Asteraceae (Pelser et al., 2007). Τα μεγέθη του γονιδιώματος στα Senecioneae κυμαίνονται έντονα από 0,79–52,3 pg/2C (Vitales et al., 2019) και εδώ φαίνεται ότι το C. rubens έχει μέγεθος περίπου 6,1 pg/2C με 2n = 2x = 20 χρωμοσώματα και C crepidioides μεγέθους περίπου 12,3 pg/2C με αριθμό χρωμοσωμάτων 2n = 4x = 40. Μόνο πέντε μέλη έχουν ακόμη προσδιοριστεί ως εξής: αλογίσιο (Erygeron canadensis; Peng et al., 2014), ηλίανθος (Helianthus annuus; Badouin et al., 2017), αγκινάρα (Cynara scolymus; Scaglione et al., 2016), lettuce sativa, Reyes-Chin-Wo et al., 2017) και γλυκό αψιθιά (Artemisia annua; Shen et al., 2018). Κανένα από αυτά τα είδη δεν ανήκει στους Senecioneae, που είναι η μεγαλύτερη φυλή των Asteraceae (Pelser et al., 2007). Τα μεγέθη του γονιδιώματος στα Senecioneae κυμαίνονται έντονα από 0,79–52,3 pg/2C (Vitales et al., 2019) και εδώ φαίνεται ότι το C. rubens έχει μέγεθος περίπου 6,1 pg/2C με 2n = 2x = 20 χρωμοσώματα και C crepidioides μεγέθους περίπου 12,3 pg/2C με αριθμό χρωμοσωμάτων 2n = 4x = 40. Μόνο πέντε μέλη έχουν ακόμη προσδιοριστεί ως εξής: αλογίσιο (Erygeron canadensis; Peng et al., 2014), ηλίανθος (Helianthus annuus; Badouin et al., 2017), αγκινάρα (Cynara scolymus; Scaglione et al., 2016), lettuce sativa, Reyes-Chin-Wo et al., 2017) και γλυκό αψιθιά (Artemisia annua; Shen et al., 2018). Κανένα από αυτά τα είδη δεν ανήκει στους Senecioneae, που είναι η μεγαλύτερη φυλή των Asteraceae (Pelser et al., 2007). Τα μεγέθη του γονιδιώματος στα Senecioneae κυμαίνονται έντονα από 0,79–52,3 pg/2C (Vitales et al., 2019) και εδώ φαίνεται ότι το C. rubens έχει μέγεθος περίπου 6,1 pg/2C με 2n = 2x = 20 χρωμοσώματα και C crepidioides μεγέθους περίπου 12,3 pg/2C με αριθμό χρωμοσωμάτων 2n = 4x = 40. αγκινάρα (Cynara scolymus; Scaglione et al., 2016), μαρούλι (Lactuca sativa; Reyes-Chin-Wo et al., 2017) και γλυκιά αψιθιά (Artemisia annua; Shen et al., 2018). Κανένα από αυτά τα είδη δεν ανήκει στους Senecioneae, που είναι η μεγαλύτερη φυλή των Asteraceae (Pelser et al., 2007). Τα μεγέθη του γονιδιώματος στα Senecioneae κυμαίνονται έντονα από 0,79–52,3 pg/2C (Vitales et al., 2019) και εδώ φαίνεται ότι το C. rubens έχει μέγεθος περίπου 6,1 pg/2C με 2n = 2x = 20 χρωμοσώματα και C crepidioides μεγέθους περίπου 12,3 pg/2C με αριθμό χρωμοσωμάτων 2n = 4x = 40. αγκινάρα (Cynara scolymus; Scaglione et al., 2016), μαρούλι (Lactuca sativa; Reyes-Chin-Wo et al., 2017) και γλυκιά αψιθιά (Artemisia annua; Shen et al., 2018). Κανένα από αυτά τα είδη δεν ανήκει στους Senecioneae, που είναι η μεγαλύτερη φυλή των Asteraceae (Pelser et al., 2007). Τα μεγέθη του γονιδιώματος στα Senecioneae κυμαίνονται έντονα από 0,79–52,3 pg/2C (Vitales et al., 2019) και εδώ φαίνεται ότι το C. rubens έχει μέγεθος περίπου 6,1 pg/2C με 2n = 2x = 20 χρωμοσώματα και C crepidioides μεγέθους περίπου 12,3 pg/2C με αριθμό χρωμοσωμάτων 2n = 4x = 40.

Οι πληροφορίες του γονιδιώματος είναι επίσης απαραίτητες για προσεγγίσεις ταχείας μοριακής αναπαραγωγής, όπως η επεξεργασία του γονιδιώματος, η οποία θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την αφαίρεση του jacobine από το C. crepidioides, για παράδειγμα, μέσω μετάλλαξης HSS. Για να διευκολυνθεί αυτή η προσέγγιση, κλωνοποιήσαμε παραλλαγές HSS από τα C. rubens και C. crepidioides και δείξαμε ότι το HSS είναι πιθανό να υπάρχει σε δύο αντίγραφα, τα οποία είναι και τα δύο ενεργά, τουλάχιστον in vitro. Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και οι δύο εκδόσεις HSS του C. crepidioides εκφράζονται κυρίως σε ρίζες, η ομοσπερμιδίνη ανιχνεύθηκε επίσης στα φύλλα, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να μετατοπιστεί από τα όργανα της ρίζας στα βλαστικά όργανα. Ενώ η ομοσπερμιδίνη ήταν ανιχνεύσιμη τόσο στο C. crepidioides όσο και στο C. rubens, ήταν παρούσα σε πολύ μικρότερη αφθονία στα φύλλα του τελευταίου, γεγονός που θα μπορούσε, τουλάχιστον εν μέρει, να εξηγήσει την αδυναμία του C. ruben να σχηματίσει jacobine. Επιπλέον, Επίσης, άλλες ικανότητες βλαστών φαίνεται να περιορίζουν τον σχηματισμό ιακοβίνης στο C. rubens, καθώς τα εμβολιασμένα φυτά που περιείχαν βλαστούς C. rubens δεν ήταν σε θέση να σχηματίσουν το PA, ακόμη και με την παρουσία ενός αποθέματος ρίζας C. crepidioides που παράγει ομοσπερμιδίνη. Αυτές οι ικανότητες μπορεί να περιλαμβάνουν την παραγωγή και/ή την κινητοποίηση πρόσθετων πρόδρομων ουσιών ιακοβίνης και υπάρχουν αναφορές από άλλα φυτά που δεν παράγουν ΡΑ ότι η μετατόπιση των Ν-οξειδίων του PA μέσω του φλοιού είναι ένας περιοριστικός παράγοντας στο σχηματισμό PA (Hartmann et al. , 1989).

Ο εμβολιασμός του C. rubens με το C. crepidioides παρήγαγε ζωτικά φυτά: μεγάλωσαν και δημιούργησαν φύλλα, βλαστούς και άνθη, δείχνοντας ότι ακόμη και σε συνδυασμό μεταξύ των ειδών ο εμβολιασμός ήταν επιτυχής. Τόσο τα μοσχεύματα εντός όσο και μεταξύ των ειδών έδειξαν σημάδια στρες, συμπεριλαμβανομένης της καθυστέρησης της ανάπτυξης και της συσσώρευσης ανθοκυανίνης, και αυτό παρατηρείται τακτικά (Melnyk and Meyerowitz, 2015; Gaut et al., 2019). Συμπτώματα στρες όπως η συσσώρευση ανθοκυανίνης συνδέθηκαν με τη συσσώρευση ιακοβίνης τόσο στα εμβολιασμένα όσο και στα φυτά C. crepidioides με εξάντληση N, και επομένως είναι πιθανό ότι η επαγωγή σχηματισμού ιακοβίνης είναι μέρος μιας γενικής οδού που ανταποκρίνεται στο στρες που χρησιμοποιείται για τη συσσώρευση PA.

Η αποφυγή της έλλειψης Ν είναι μια πιθανή στρατηγική για την παραγωγή φυτών χαμηλής περιεκτικότητας σε PA C. crepidioides. Ωστόσο, αυτό μπορεί να είναι δύσκολο, αν όχι αδύνατο, να εφαρμοστεί με συνέπεια στα γεωργικά συστήματα. Επίσης, δεδομένου ότι είναι δυνατός ο αντίκτυπος άλλων παραγόντων στην παραγωγή PA, οι συγκεντρώσεις jacobine θα πρέπει να παρακολουθούνται για να διασφαλιστεί η ασφαλής χρήση και αυτό θα αποτελέσει σημαντική πρόκληση για τους παραγωγούς στην Υποσαχάρια Αφρική. Εναλλακτικά, θα μπορούσαν να δημιουργηθούν γραμμές χωρίς ιακομίνη, για παράδειγμα, μέσω γενετικής αφαίρεσης του HSS, και εδώ δημιουργούμε τα πρώτα αποτελέσματα σχετικά με την αλληλουχία, την έκφραση και τη ρύθμιση του HSS, για να διευκολυνθεί αυτή η προσέγγιση. Πολύ πρόσφατα, αποδείχθηκε ότι αυτή η προσέγγιση θα μπορούσε να είναι εφικτή αφού στο Symphytum officinale η μετάλλαξη HSS απέδωσε φυτά χωρίς PA (Zakaria et al., 2021). Ωστόσο, δεν είναι σαφές, εάν C χωρίς PA. Οι ποικιλίες crepidioides μπορεί να έχουν μειονεκτήματα, όπως μειωμένη αντοχή στα φυτοφάγα, και ενώ το γεγονός ότι το C. rubens φαίνεται να είναι απαλλαγμένο από PA μπορεί να μιλάει εναντίον του, αυτό θα απαιτούσε δοκιμή. Απαιτείται τώρα η δημιουργία εργαλείων μοριακής γενετικής, όπως τεχνικές μετασχηματισμού και επεξεργασία γονιδιώματος CRISPR/Cas9, για να αντιμετωπιστούν αυτά τα βιολογικά ερωτήματα και να επιταχυνθεί η ανάπτυξη ποικιλιών C. crepidioides χωρίς PA, προς όφελος της εξημέρωσης και της ασφαλούς χρήσης αυτού. άγρια ​​καλλιέργεια.

Δήλωση διαθεσιμότητας δεδομένων

Τα σύνολα δεδομένων που παρουσιάζονται σε αυτή τη μελέτη μπορούν να βρεθούν σε διαδικτυακά αποθετήρια. Τα ονόματα του αποθετηρίου/των αποθετηρίων και οι αριθμοί πρόσβασης βρίσκονται στο άρθρο/Συμπληρωματικό Υλικό.

Συνεισφορές Συγγραφέων

Οι SS, WR και BP σχεδίασαν και σχεδίασαν την έρευνα. Ο SS έκανε το μόσχευμα. Οι SS και WR έκαναν την ανάλυση μεθυλίωσης DNA, καθιέρωσαν το σύστημα υδροπονίας, πραγματοποίησαν τις αναλύσεις μεταβολιτών και έκαναν τον χαρακτηρισμό HSS και τις αναλύσεις qPCR. Ο YL έλαβε μέρος στην κλωνοποίηση του HSS. Ο SN συμμετείχε στα πειράματα εξάντλησης του Ν σε έδαφος λιμνών. Η ΑΑ-Β πραγματοποίησε τον αναπτυξιακό φαινότυπο. Ο TW πραγματοποίησε τις μετρήσεις κυτταρομετρίας ροής. Η BP έγραψε το χαρτί με στοιχεία από SS και WR. Όλοι οι συγγραφείς συνέβαλαν στην οριστικοποίηση του άρθρου και ενέκριναν την υποβληθείσα έκδοση.

Χρηματοδότηση

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από την Deutsche Akademische Austauschdienst (υποτροφία Ph.D. DAAD στο AA-B). Οι SS και AA-B ήταν μέλη του TUM Graduate School.

Σύγκρουση συμφερόντων

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη απουσία εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.

Σημείωση εκδότη

Όλοι οι ισχυρισμοί που εκφράζονται σε αυτό το άρθρο είναι αποκλειστικά εκείνοι των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραιτήτως αυτούς των συνδεδεμένων οργανισμών τους ή του εκδότη, των εκδοτών και των κριτικών. Οποιοδήποτε προϊόν μπορεί να αξιολογηθεί σε αυτό το άρθρο ή ισχυρισμός που μπορεί να προβληθεί από τον κατασκευαστή του, δεν είναι εγγυημένο ή εγκεκριμένο από τον εκδότη.

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε την Millenium Seed Bank στο Kew Royal Botanic Gardens για τους σπόρους των προσαρτήσεων Crassocephalum που χρησιμοποιήθηκαν και την τράπεζα γονιδίων IPK για τους σπόρους του προτύπου αναφοράς Pisum sativum. Ευχαριστούμε την Irene Ziegler και τον Nicolai Köhler για την τεχνική βοήθεια.

Συμπληρωματικό υλικό

Το συμπληρωματικό υλικό για αυτό το άρθρο βρίσκεται στο διαδίκτυο στη διεύθυνση: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2021.702985/full#supplementary-material

1. ^www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank

Φωτογραφίες της Υψηλής Κουζίνας του Νότου, Αλκαλοειδή, Εξημέρωση, Έμπολο, Γονιδίωμα, Παραμελημένη καλλιέργεια, Θρεπτικά συστατικά, Yoruba bologi, Fireweed